JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تظهر هنا مجموعة من البروتوكولات لتوليد وحفظ كرويات القلب (CSs) من الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان والمستزرعة في شكل متعدد الأبعاد عالي الإنتاجية. يعمل هذا النموذج ثلاثي الأبعاد كمنصة قوية لنمذجة الأمراض ، والفحوصات عالية الإنتاجية ، ويحافظ على وظائفه بعد الحفظ بالتبريد.

Abstract

تعتبر الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC-CMs) ذات أهمية قصوى لنمذجة أمراض القلب البشرية وعلاجها. لقد نشرنا مؤخرا استراتيجية فعالة من حيث التكلفة للتوسع الهائل في hiPSC-CMs في بعدين (2D). هناك قيدان رئيسيان هما عدم نضج الخلية ونقص الترتيب ثلاثي الأبعاد (3D) وقابلية التوسع في منصات الفحص عالية الإنتاجية (HTS). للتغلب على هذه القيود ، تشكل خلايا عضلة القلب الموسعة مصدرا مثاليا للخلايا لتوليد 3D ثقافة خلايا القلب وتقنيات هندسة الأنسجة. هذا الأخير يحمل إمكانات كبيرة في مجال القلب والأوعية الدموية ، وتوفير HTS أكثر تقدما وذات صلة من الناحية الفسيولوجية. هنا ، نصف سير عمل متوافق مع HTS مع سهولة التوسع لتوليد وصيانة وتحليل بصري للكرويات القلبية (CSs) بتنسيق 96 جيدا. هذه CSs الصغيرة ضرورية لسد الفجوة الموجودة في نماذج الأمراض الحالية في المختبر و / أو توليد لمنصات هندسة الأنسجة 3D. تقدم CSs مورفولوجيا وحجما وتكوينا خلويا عالي التنظيم. علاوة على ذلك ، فإن hiPSC-CMs المستزرعة على أنها CSs تظهر نضجا متزايدا والعديد من السمات الوظيفية لقلب الإنسان ، مثل التعامل التلقائي مع الكالسيوم والنشاط المقلص. من خلال أتمتة سير العمل الكامل ، من إنشاء CSs إلى التحليل الوظيفي ، فإننا نزيد من قابلية التكرار داخل وبين الدفعات كما يتضح من التصوير عالي الإنتاجية (HT) وتحليل معالجة الكالسيوم. يسمح البروتوكول الموصوف بنمذجة أمراض القلب وتقييم التأثيرات الدوائية / العلاجية على مستوى الخلية المفردة ضمن بيئة خلية 3D معقدة في سير عمل HTS مؤتمت بالكامل. بالإضافة إلى ذلك ، تصف الدراسة إجراء مباشرا للحفاظ على الكرات الكاملة والبنوك الحيوية على المدى الطويل ، مما يوفر للباحثين الفرصة لإنشاء الجيل التالي من تخزين الأنسجة الوظيفية. ستساهم HTS جنبا إلى جنب مع التخزين طويل الأجل بشكل كبير في الأبحاث الانتقالية في مجموعة واسعة من المجالات ، بما في ذلك اكتشاف الأدوية واختبارها ، والطب التجديدي ، وتطوير العلاجات الشخصية.

Introduction

أتاح اكتشاف الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) فرصا غير مسبوقة لدراسة التنمية البشرية والمرض على المستوى الخلوي. على مدار العقد الماضي ، باستخدام الدروس التنموية ، تم وضع بروتوكولات مختلفة لضمان التمايز الفعال ل hiPSCs إلى خلايا عضلية قلبية (CMs) 1،2،3،4. يمكن أن تكون الخلايا العضلية القلبية المشتقة من hiPSC (hiPSC-CMs) بمثابة مورد لنمذجة أمراض القلب والأوعية الدموية الموروثة وراثيا (CVDs) ، واختبار سلامة القلب للأدوية الجديدة ، واستراتيجيات تجديد القلب5،6،7،8. على الرغم من التمايز القلبي الموجه ل hiPSCs ، تظل أعداد CM غير المحددة تمثل تحديا في مجال القلب ، نظرا لأن hiPSC-CMs الناضجة بشكل عام غير تكاثرية ، والخلايا البشرية الأولية غير متوفرة بكميات كبيرة.

في الآونة الأخيرة ، وصفنا أن تنشيط إشارات Wnt المصاحب مع ثقافة كثافة الخلايا المنخفضة أدى إلى استجابة تكاثرية هائلة (تصل إلى 250 ضعفا) من hiPSC-CMs 9,10. تسهل هذه الاستراتيجية الفعالة من حيث التكلفة للتوسع الهائل في hiPSC-CMs عبر التمرير التسلسلي في شكل قارورة الاستزراع توحيد ومراقبة الجودة لأعداد كبيرة من hiPSC-CMs الوظيفية. بالإضافة إلى ذلك ، لمواكبة الطلب على دفعات كبيرة من hiPSC-CMs من مختلف الجهات المانحة ، تم وصف البنوك الحيوية ل hiPSC-CMs10. ومع ذلك ، فإن أحاديات عضلة القلب المصنفة في أطباق الثقافة القياسية هذه لا تمثل بنية 3D المعقدة الموجودة في القلب. علاوة على ذلك ، ظل عدم نضج hiPSC-CMs عقبة ، وبالتالي قصر في محاكاة النمط الظاهري البيولوجي والفسيولوجي لبيئة القلب والأوعية الدموية في الجسم الحي.

تم تطوير نماذج ثلاثية الأبعاد جديدة في المختبر حيث تظهر hiPSC-CMs سلوكا فسيولوجيا أقرب مثل التنظيم الذاتي 11,12 ، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM)13 ، والنضج المعزز 14,15,16 ، والانكماش المتزامن17,18,19 . تم استخدام نماذج 3D لاكتشاف الأدوية ، واختبار السمية القلبية للأدوية ، ونمذجة الأمراض ، والعلاجات التجديدية ، وحتى التجارب السريرية الأولى20،21،22،23،24. أحد النماذج الأكثر استخداما هو نسيج القلب الهندسي القائم على الفيبرين (EHT) ، والذي يظهر ترتيبا يشبه الأنسجة وانقباض القلب13،17،25. في السابق ، أظهرنا أن EHTs التي تم إنشاؤها من hiPSC-CMs الموسعة أظهرت انقباضا مشابها لتلك الموجودة في hiPSC-CMs غير الموسعة ، مما يدل على وظائف خلوية غير منقوصة بعد التوسع9. ومع ذلك ، على الرغم من أن توليد EHTs من hiPSC-CMs قد تم تأسيسه جيدا ، فمن المتوقع حدوث المزيد من التطورات فيما يتعلق بإنشاء منصة تقييم HT. هنا ، يسمح الجيل السريع لأعداد كبيرة من كرويات القلب ذاتية التجميع (CSs) بتنسيق 96 بئرا بتحسين ظروف 3D لأغراض الفحص عالي الإنتاجية (HTS).

بشكل عام ، فإن ميزة CSs كثقافة خلية 3D هي قابليتها العالية للتكاثر وقابلية التوسع. على وجه الخصوص ، يمكن ل CSs جنبا إلى جنب مع معالجة العينات الروبوتية توحيد وأتمتة ثقافة CS ، والعلاج من تعاطي المخدرات ، وتحليل المحتوى العالي20. هنا ، نصف البروتوكولات المحسنة لتوليد CSs عالية النقاء وعالية الجودة ، والتي يمكن حفظها بالتبريد بكفاءة وفحصها لوظيفة القلب عن طريق إجراء قياسات عابرة Ca2+ باستخدام نظام اكتساب وتحليل الكالسيوم البصري. يوفر هذا النموذج أداة بسيطة لكنها قوية لأداء شاشات عالية الإنتاجية على مئات إلى آلاف الكائنات الكروية17,18.

Protocol

ملاحظة: تم إنشاء hiPSC-CMs المستخدمة في هذه الدراسة وفقا لبروتوكولات زراعة hiPSC والتمايز CM الموصوفة سابقا26,27. اختياريا ، يمكن توسيع hiPSC-CMs وحفظها بالتبريد كما تم نشره مؤخرا قبل بدء بروتوكول CS (القسم 4) 10.

1. إعداد وسائط زراعة الخلايا والمحاليل والحصص

  1. تحضير الوسط القاعدي
    1. وازن بين البنسلين والستربتومايسين والوسط (RPMI 1640) لدرجة حرارة الغرفة (RT) وتأكد من إذابته تماما. امزج 500 مل من الوسط و 5 مل من القلم / العقدية. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 8 أسابيع ؛ يتوازن إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. تحضير RPMI + B27
    1. وازن بين مكمل B27 والوسط القاعدي مع RT. تأكد من إذابة المكمل تماما. امزج 490 مل من الوسط القاعدي و 10 مل من مكمل 50x B27. يحفظ في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع ؛ يتوازن إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  3. تحضير وسائط إعادة الطلاء hiPSC-CM
    1. أضف مثبط بروتين كيناز (ROCK) المرتبط ب Rho والملفوف (تركيز نهائي 2 ميكرومتر) واستبدال مصل الضربة القاضية بنسبة 10٪ (KSR) إلى وسائط RPMI + B27. أضف مثبط ROCK مباشرة إلى وسائط RM حسب الحاجة. لا تقم بتخزين الوسائط الثقافية بمجرد استكمالها.
  4. تحضير وسائط ذوبان CM
    1. أضف تركيز 1: 100 من مكمل بقاء الخلية (على سبيل المثال ، Revitacell) و 20٪ KSR إلى وسائط RPMI + B27 وقم بموازنتها إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  5. تحضير ملحق النضج
    1. تتكون الصيغة المتوسطة للنضجالموصوفة سابقا 28 من: 3 مللي مول جلوكوز ، 10 مللي مول لاكتات ، 5 مجم / مل فيتامين ب 12 ، 0.82 مللي مول بيوتين ، 5 مللي مول كرياتين مونوهيدرات ، 2 مللي مول توراين ، 2 مللي مول كارنيتين ، 0.5 مللي مول حمض الأسكوربيك ، 1x NEAA ، 0.5٪ (وزن / حجم) ألبوماكس ، 1x B27 ، و 1٪ KOSR. لتحضير زجاجة واحدة كاملة (500 مل) من مكمل النضج ، قم بإزالة 65 مل من زجاجة DMEM بدون جلوكوز وتكملة مع 2.7 غرام من الجلوكوز ، 5.6 غرام من L- اللاكتات ، 0.025 ملغ من فيتامين B12 ، 1 ملغ من البيوتين ، 3.73 غرام من الكرياتين مونوهيدرات ، 1.25 غرام من التوراين ، 1.975 غرام من L- كارنيتين ، 0.7125 غرام من حمض الأسكوربيك ، 50 مل من NEAA ، 12.5 غرام من البوماكس ، و 5 مل من البنسلين الستربتومايسين.
    2. قم بالتصفية من خلال وحدة مرشح معقمة يمكن التخلص منها بغشاء بولي إيثر سلفون (PES) ذو مسام 0.22 ميكرومتر.
    3. القسمة إلى 45 مل (لإعداد 500 مل من وسط النضج) أو 4.5 مل (لإعداد 50 مل من وسط النضج). يحفظ في درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  6. تحضير وسائط النضج
    1. قم بموازنة مكمل B27 ، والضربة القاضية SR ، والبنسلين والستربتومايسين ، وملحق النضج28 ، ووسط DMEM الخالي من الجلوكوز في RT. تأكد من إذابة المكمل تماما. امزج 435 مل من وسط DMEM بدون جلوكوز مع 10 مل من مكمل 50x B27 ، و 5 مل من البنسلين والستربتومايسين ، و 5 مل من الضربة القاضية SR ، و 45 مل من مكمل النضج. يحفظ في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع ؛ يتوازن عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  7. تحضير الفلور مشرق المتوسطة
    1. موازنة البنسلين والستربتومايسين ووسط الفلوروبرايت DMEM في RT. تأكد من إذابة المكمل تماما. امزج 500 مل من وسط فلوربرايت DMEM مع 5 مل من البنسلين والستربتومايسين. يحفظ في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر ؛ يتوازن عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  8. تحضير محلول المنظفات غير الأيونية
    1. امزج 20٪ وزن / وزن مسحوق منظف غير أيوني (على سبيل المثال ، F-127) مع برنامج تلفزيوني. قم بالتصفية باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر ؛ التوازن في RT قبل الاستخدام.
  9. تحضير وسط صبغة الكالسيوم
    1. امزج محلول المنظفات غير الأيونية (التركيز النهائي 0.04٪ v / v) و 0.1x من صبغة الكالسيوم (على سبيل المثال ، Cal520 AM) في وسط فلور اللامع. في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، أضف 10 ميكرولتر من Cal520 و 20 ميكرولتر من محلول المنظفات غير الأيونية. تخلط حتى يذوب تماما. احتفظ بالمحلول في الظلام قبل إضافته إلى الخلايا.

2. إعداد المخازن المؤقتة

  1. تحضير النفاذية وحظر المخزن المؤقت: يحتوي هذا المخزن المؤقت على 10 مل من PBS و 5٪ wt / v BSA و 0.3٪ v / v Triton-X-100.
  2. تحضير المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي: يحتوي هذا المخزن المؤقت على 50 مل من PBS و 1٪ بالوزن / v BSA و 0.3٪ v / v Triton-X-100.
  3. المخزن المؤقت لغسل قياس التدفق الخلوي: يحتوي هذا المخزن المؤقت على 50 مل من PBS و 1٪ بالوزن / الحجم BSA.
  4. المخزن المؤقت للغسيل الكروي (SWB): يحتوي هذا المخزن المؤقت على 1 مل من Triton-X-100 ، و 2 مل من 10٪ (وزن / فولت في DPBS) SDS ، و 2 جم من BSA في 1 لتر من PBS.
    ملاحظة: يمكن تخزين SWB في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  5. تحضير محلول التضمين (ES): لتحضير 100 مل من محلول التضمين ، امزج 50 مل من الجلسرين مع 9.09 مل من dH2O ، 1 مل من محلول Tris (1 M ، pH 8.0) ، و 200 ميكرولتر من EDTA (0.5 M). أضف 22.7 جم من الفركتوز واخلطه في RT في الظلام حتى يذوب. عندما تكون صافية ، أضف 22.2 جم من الفركتوز واخلطها حتى تذوب. ثم يضاف 15 غرام من اليوريا ويخلط حتى يذوب (يحفظ على حرارة 4 درجات مئوية في الظلام).
  6. قم بإعداد المخزن المؤقت PBT (PBS مع Tween-20). يحتوي هذا المخزن المؤقت على PBS / Tween-20 (0.1٪ v / v). بالنسبة إلى 1 لتر من برنامج تلفزيوني ، أضف 1 مل من Tween-20.

3. تحضير الجزيئات الصغيرة

  1. أعد تكوين مسحوق ثيازوفيفين (مثبط الصخور) في حصص 10 مللي مول من 50 ميكرولتر في DMSO وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. يحفظ بعيدا عن الضوء.
  2. قم بإعداد حصص 2.5 مللي متر من 10 ميكرولتر لكل من Cal-520 AM في DMSO وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. يحفظ بعيدا عن الضوء.

4. توليد كروية القلب

ملاحظة: للحصول على كميات أكبر من CSs ، قم بزرع ما يصل إلى 1 مليون سم في لوحة تثبيت منخفضة للغاية ذات 6 آبار مع 2 مل من وسائط إعادة الطلاء hiPSC-CM. استخدمت هذه الدراسة ما لا يقل عن 2500 (2.5 ألف CS) حتى 20000 (20 ألف CS) hiPSC-CMs لكل بئر من صفيحة 96 بئرا.

  1. بالنسبة للوحة واحدة مكونة من 96 بئرا ، قم بإعداد مزرعة خلوية تحتوي على ما لا يقل عن 2 × 106 خلايا عضلية قلبية مشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات يسببها الإنسان (hiPSC-CMs) 10.
  2. عندما تصل hiPSC-CMs المستزرعة إلى نقطة التقاء ، أضف 0.1 مل / سم2 من محلول انفصال القلب المعقم (على سبيل المثال ، تريبل) إلى كل بئر. احتضان الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. باستخدام ماصة 5 مل ، قم بفصل الخلايا ميكانيكيا عن طريق التنظيف ب 2 مل من الوسط القاعدي الدافئ لعمل تعليق خلية واحدة. تأكيد الانفصال باستخدام مجهر المجال الساطع (تكبير 4x) ؛ ستبدو الخلايا بيضاء ولها شكل دائري.
  4. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × جم.
  5. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسائط إعادة الطلاء hiPSC-CM.
  6. باستخدام طرف ماصة 1,000 ميكرولتر ، قم بفصل حبيبات الخلية ميكانيكيا. يبدو المحلول متجانسا بعد ثلاثة أو أربعة خلطات. عد الخلايا. انقل الكمية المناسبة من الخلايا في 100 ميكرولتر من وسيط إعادة الطلاء إلى كل بئر مرفق منخفض للغاية 96 بئرا.
  7. ضع لوحة CSs على شاكر مداري عند 70 دورة في الدقيقة في الحاضنة لمدة 24 ساعة. اضبط ظروف الحاضنة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 و 21٪ O2 و 90٪ رطوبة.
  8. نضح 50 ميكرولتر من الوسط من كل بئر وأضف 100 ميكرولتر من RPMI + B27 وسط لكل بئر لأول 48 ساعة.
    ملاحظة: احتفظ دائما ب 50 ميكرولتر من الوسط في لوحة 96 بئرا لتجنب الشفط العرضي والتمزق الكروي.
  9. نضح 100 ميكرولتر من الوسط من كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر من وسط النضج لكل بئر. الحفاظ على الخلايا في وسط النضج وتحديث الوسط كل 2-3 أيام.

5. الحفظ بالتبريد ل CSs

ملاحظة: يمكن حفظ CSs بالتبريد للتخزين طويل الأجل. يمكن إجراء الحفظ بالتبريد من اليوم 3 بعد توليد CSs. يمكن حفظ CSs بالتبريد مباشرة في آبار صفيحة 96 بئرا أو كتعليق CS في cryovials.

  1. قم بتبريد الطبق مسبقا عن طريق وضع الطبق على الثلج لمدة 10 دقائق.
  2. أجهزة الطرد المركزي لوحة كروية لمدة 3 دقائق في 70 × غرام.
  3. قم بإزالة المادة الطافية حتى يتبقى 50 ميكرولتر وأضف 200 ميكرولتر من وسط تجميد hiPSC المثلج البارد لكل بئر.
    ملاحظة: احتفظ بتعليق CS على الثلج طوال مدة الإجراء. في حالة وجود صفيحة ذات 6 آبار مع كرويات ، قم بتجميد بئر واحد في 500 ميكرولتر تجميد متوسط التبريد.
  4. ختم اللوحة مع فيلم ختم لوحة.
    ملاحظة: يجب تخزين لوحة 96 بئرا في صندوق بوليسترين أو ، في حالة عدم توفرها ، يمكن صنع قالب سيليكون كما هو موضح في الخطوة 5.5.1.
  5. لضمان التبادل الحراري المنتظم بين لوحة البئر والفريزر ، ضع اللوحة بعناية في صندوق البوليسترين أو في قالب السيليكون.
    1. لتحضير قالب السيليكون: امزج بقوة مكونين من مجموعة المطاط الصناعي السيليكوني بنسبة 10: 1. قم بإزالة الفقاعة من المحلول باستخدام مضخة تفريغ لمدة 15-20 دقيقة. بعد ذلك ، قم بصب المحلول داخل الجزء السفلي من لوحة البئر وإزالة الفقاعة باستخدام مضخة تفريغ لمدة 10 دقائق. ضع القالب في فرن وعالجه على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 8 ساعات للحصول على مطاط صناعي شبه مرن مقشر من الطبق.
  6. قم بتجميد اللوحة عند -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات في صندوق البوليسترين أو قالب السيليكون المحضر.
  7. انقل اللوحة إلى خزان النيتروجين السائل أو الفريزر -150 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.

6. ذوبان كرويات القلب

ملاحظة: لا تقم بإذابة أكثر من طبق واحد في وقت واحد لضمان عملية ذوبان سريعة.

  1. تحضير 20 مل من وسط قاعدي مسخن مسبقا 37 درجة مئوية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
  2. اجمع صفيحة الخلية مع CSs من النيتروجين السائل وضعها في الحاضنة لمدة 15 دقيقة. اضبط ظروف الحاضنة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 و 21٪ O2 و 90٪ رطوبة.
  3. قم بإزالة المادة الطافية وبقايا حبيبات الخلية ، وأعد تعليق كل بئر في وسط قاعدي دافئ. استخدم 200 ميكرولتر من المتوسط لكل بئر.
  4. جهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق عند 70 × جم.
  5. كرر الخطوتين 6.3 و6.4.
  6. قم بإزالة المادة الطافية حتى تبقى حبيبات الخلية وأضف 200 ميكرولتر من وسط ذوبان CM في كل بئر.
  7. ضع لوحة CSs على شاكر مداري عند 70 دورة في الدقيقة في حاضنة لمدة 24 ساعة. اضبط ظروف الحاضنة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 و 21٪ O2 و 90٪ رطوبة.
  8. نضح 50 ميكرولتر من الوسط من كل بئر وأضف 100 ميكرولتر من وسط RPMI + B27 لكل بئر لأول 48 ساعة.
  9. نضح 100 ميكرولتر من الوسط من كل بئر وأضف 100 ميكرولتر من وسط النضج لكل بئر. الحفاظ على الخلايا في وسط النضج وتحديث الوسط كل 2-3 أيام.

7. تقييم العابرين داخل الخلايا Ca2+

ملاحظة: CSs في الثقافة لمدة 3 أسابيع ؛ 2 أسابيع قبل التجميد ، و 1 أسبوع بعد ذوبان الجليد. عناصر التحكم "الجديدة" متطابقة مع العمر.

  1. بعد 1 أسبوع من الثقافة ، تعتبر CSs المذابة مثالية للتصوير البصري للتعامل مع الكالسيوم. استخدم صبغة الكالسيوم (على سبيل المثال ، Cal520AM) لتقييم امتصاص وإطلاق Ca2+ من الخلايا.
  2. تعامل معهم مع 100 ميكرولتر من وسط صبغة الكالسيوم لكل بئر واحتضانهم لمدة 60 دقيقة في الحاضنة. اضبط ظروف الحاضنة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 و 21٪ O2 و 90٪ رطوبة.
    ملاحظة: Cal520AM حساس للضوء. تنفيذ جميع إجراءات التحميل والتجارب في الظلام.
  3. إعداد نظام اكتساب وتحليل الكالسيوم.
    1. قم بتشغيل المجهر ، مع ضمان تشغيل خيار التحكم البيئي.
    2. اضبط أبعاد الكاميرا وفتحة الإطار لتقليل مساحة الخلفية.
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام مجهر Leica Thunder DMi8 ؛ أنظمة المجهر الأخرى قابلة للتطبيق أيضا حتى تسمح بمعدل أخذ عينات أعلى من 30 إطارا / ثانية (FPS).
  4. سجل مقطع فيديو بدفق ثابت من قمم 2-10 في غضون 10 ثوان وامسح عبر اللوحة المكونة من 96 بئرا ، وانتقل في البداية إلى اليسار ، ثم لأسفل بطريقة متعرجة لتغطية اللوحة بأكملها. قياس إشارة الكالسيوم باستخدام ليزر 488 نانومتر ؛ اضبط التباين على خلفية سوداء بإشارة خضراء ساطعة أثناء إطلاق الكالسيوم.
  5. بعد الحصول على عابري Ca2+ ، قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل آثار التألق (على سبيل المثال ، CyteSeer ، Vala Sciences) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

8. تحليلات التدفق الخلوي للكرويات القلبية المنفصلة

ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد صلاحية CSs قبل وبعد عملية الذوبان.

  1. اجمع CSs في أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة سعة 5 مل لتجنب تلف الكرة الأرضية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 70 × جم. نضح الطافد وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 × غرام. نضح المادة الطافية وفصل CSs عن طريق إضافة 1 مل من محلول انفصال القلب (على سبيل المثال ، تريبل). احتضان الأنبوب على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. باستخدام ماصة 5 مل ، قم بفصل الخلايا ميكانيكيا عن طريق التنظيف ب 2 مل من الوسط القاعدي حتى يمكن رؤية الخلايا المفردة عند ملاحظتها تحت المجهر.
  4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 × غرام.
  5. نضح المادة الطافية وإصلاح CMs مع 200 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهايد 4٪ (PFA) في 1x PBS. احتضان لمدة 10 دقائق في RT.
  6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 × غرام. نضح الطافد وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: نقطة الإيقاف المؤقت: يمكن تخزين hiPSC-CMs الثابتة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  7. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب FACS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 200 × جرام. نضح الطافع وإعادة تعليق 1 × 105 خلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية.
  8. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  9. لتحليل قياس التدفق الخلوي المناعي ، قم بتنفيذ الخطوات 8.9.1-8.9.4.
    1. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي (50 ميكرولتر) الذي يحتوي على الجسم المضاد α-actinin بتخفيف 1: 300. في أنبوب FACS آخر ، أعد تعليق 1 × 105 خلايا في المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي (50 ميكرولتر) مع التحكم في النمط المتماثل المعني (على سبيل المثال ، فأر FITC IgM ، κ isotype [1: 200 تخفيف]). وبالمثل ، أعد تعليق 1 × 105 خلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي للتحكم السلبي.
    2. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    3. إضافة 2.5 مل من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي وأجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ؛ تخلص من المادة الطافية وكرر خطوة الغسيل هذه مرتين.
    4. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي باستخدام الجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للفأر (تخفيف 1: 300).
      ملاحظة: ضع الأنبوب في الظلام لأن محلول الأجسام المضادة الثانوي حساس للضوء.
  10. للتحقق من الجدوى باستخدام يوديد البروبيديوم (PI) ، أضف 150 ميكرولتر من PI لكل عينة (1: 1,000) واحتضانها لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: ضع الأنبوب في الظلام لأن محلول PI حساس للضوء.
  11. اضبط البوابات وفقا لاستراتيجية البوابة القياسية كما هو موضح في الشكل التكميلي 1 وقم بتحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

9. تلطيخ المناعي للكرويات 3D كاملة

ملاحظة: يعتمد هذا البروتوكول على بروتوكول التصوير 3D عالي الدقة للعضويات الكاملة عند وضع العلامات المناعية ، والذي تم نشره مسبقا29 وتعديله للكرويات القلبية. أثناء الإجراء ، يمكن طلاء جميع أطراف الماصات والأنابيب المخروطية بنسبة 1٪ بالوزن / الحجم BSA-PBS لمنع الأجسام الكروية من الالتصاق بالبلاستيك. لطلاء المواد ، اغمس في 1٪ BSA-PBS. احرص على عدم إتلاف الكرات باستخدام ماصة سعة 5 مل ، وتجنب الاضطراب الميكانيكي.

  1. اجمع CSs في أنبوب مطلي سعة 15 مل باستخدام ماصة سعة 5 مل. الكرويات مرئية للعين. جمع ~ 20-50 كروية لكل مجموعة الأجسام المضادة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 70 × جم ونضح المادة الطافية.
  2. أعد تعليق الكرويات بعناية في 1 مل من محلول بارافورمالدهايد (PFA) المثلج البارد 4٪ في 1x PBS باستخدام طرف 1 مل مطلي.
  3. يثبت عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد 20 دقيقة ، أعد تعليق الكرويات برفق باستخدام طرف مطلي سعة 1 مل. هذا يساوي التثبيت بين جميع كرويات.
  4. أضف 10 مل من برنامج تلفزيوني مثلج بارد إلى الأنبوب واخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب. احتضان لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتدور لأسفل عند 70 × غرام لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، لا تكون هناك حاجة بشكل عام إلى طلاء الأطراف والأنابيب المخروطية لأن CSs لا تلتصق بالطرف بعد التثبيت.
  5. قم بحظر CSs عن طريق إعادة تعليق الحبيبات في SWB بارد الجليد (200 ميكرولتر من SWB لكل بئر) ونقل الكرويات إلى لوحة استزراع معلقة 24 بئرا.
    ملاحظة: يمكن تقسيم CSs من حبيبات واحدة كبيرة على آبار متعددة لأداء تلطيخ مختلف. استخدم ~ 20-50 CSs لكل مجموعة من الأجسام المضادة.
  6. احتضان في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
  7. أضف 200 ميكرولتر من SWB في بئر فارغ ليكون بمثابة بئر مرجعي.
    ملاحظة: بالنسبة للتلطيخ المناعي ، يمكن أيضا استخدام ألواح 48 أو 96 بئرا لتقليل استخدام الأجسام المضادة. ومع ذلك ، يمكن تقليل نتائج التلوين والغسيل بسبب الحجم الأصغر لكل بئر.
  8. اسمح للكرويات بالاستقرار في الجزء السفلي من اللوحة ، عن طريق ترك اللوحة مائلة بزاوية 45 درجة لمدة 5 دقائق.
  9. قم بإزالة SWB ، وترك CSs في 200 ميكرولتر من SWB (استخدم البئر المرجعي لتقدير الحد الأدنى للحجم البالغ 200 ميكرولتر).
  10. أضف 200 ميكرولتر من SWB مع الأجسام المضادة الأولية مركزة 2x (على سبيل المثال ، ɑ-actinin [1: 200] و Troponin T [1: 200]) واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية أثناء التأرجح / الاهتزاز (40 دورة في الدقيقة على شاكر أفقي).
  11. في اليوم التالي ، أضف 1 مل من SWB إلى كل بئر.
  12. اترك الكرويات تستقر في قاع اللوحة عن طريق ترك اللوحة بزاوية 45 درجة لمدة 5 دقائق.
  13. قم بإزالة SWB ، وترك 200 ميكرولتر في اللوحة. أضف 1 مل من SWB واغسله لمدة 2 ساعة مع هزاز / اهتزاز بطيء.
  14. كرر الخطوتين 9.12 و 9.13 مرتين أخريين.
  15. اسمح ل CSs بالاستقرار في الجزء السفلي من اللوحة عن طريق ترك اللوحة مائلة عند 45 درجة لمدة 5 دقائق. قم بإزالة SWB ، وترك 200 ميكرولتر في كل بئر
  16. أضف 200 ميكرولتر من SWB مع الأجسام المضادة الثانوية والأجسام المضادة المترافقة والأصباغ المركزة 2x (على سبيل المثال ، DAPI [1 ميكروغرام / مل] ، الفأر AF488 [1: 500] ، الأرنب AF568 [1: 500]) ، واحتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في الظلام ، بينما تهتز / تهتز ببطء.
  17. في اليوم التالي، كرر الخطوتين 9.12 و9.13 مرتين أخريين.
  18. انقل CSs بعناية إلى أنبوب سعة 1.5 مل وقم بتدويره لأسفل عند 70 × جم لمدة 3 دقائق.
  19. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من SWB عن طريق السحب دون تعطيل CSs.
  20. أضف محلول التضمين (ES ؛ 50 ميكرولتر على الأقل ، عند RT) باستخدام طرف 200 ميكرولتر مع قطع الطرف وإعادة تعليقه برفق لمنع تكوين الفقاعة واحتضانه عند RT لمدة 20 دقيقة.
  21. في غضون ذلك ، قم بإنشاء حاوية مربعة على شريحة زجاجية باستخدام طلاء الأظافر أو مانع التسرب السيليكوني.
  22. اقطع نهاية طرف 200 ميكرولتر وانقل CSs في ES إلى منتصف الحاوية المربعة.
  23. ضع غطاء مربع في الأعلى. لتقليل فقاعات الهواء ، ضع جانبا واحدا من غطاء الغطاء أولا ، ثم اخفض غطاء الغطاء ببطء من جانب إلى آخر حتى لا يكون هناك هواء محبوس تحت السطح ، ثم حرر غطاء الغطاء.
  24. اضغطي برفق على جميع حواف الغطاء لإغلاقه على طلاء الأظافر أو مانع التسرب السيليكوني.
  25. اترك الشريحة طوال الليل في RT. في اليوم التالي ، تكون الشريحة جاهزة للتصوير.
    ملاحظة: يمكن أن يتسبب المسح البصري بواسطة ES في انكماش الأنسجة بشكل طفيف. ومع ذلك ، لا يمكن أن يؤثر هذا على التشكل العام ل CSs. يمكن إيقاف إجراء التلوين هنا عن طريق تخزين الشرائح عند 4 °C (لمدة أسبوع 1 على الأقل) أو عند -20 °C (لمدة 6 أشهر على الأقل).

النتائج

يصف البروتوكول الموضح في الشكل 1A توليد CSs من hiPSC-CMs الموسعة سابقا. تكتسب CSs بنية ثلاثية الأبعاد بحلول اليوم الأول بعد البذر في ألواح مستديرة القاع منخفضة للغاية ويمكن استزراعها لمدة تصل إلى 6 أسابيع (الشكل 1B). وفقا لتقييم تلطيخ التألق المناعي ، أعربت غالبية الخلايا في CSs البالغة من العمر 3 أسابيع عن بروتينات ساركومية مثل α-actinin و troponin T وأظهرت تنظيما منتظما للساركومير (الشكل 1C). من أجل القياس الكمي للخلايا الإيجابية α-actinin ، تم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي. وفقا لنتائج التألق المناعي ، أظهرت بيانات قياس التدفق الخلوي مستويات عالية مماثلة من α-actinin في كل من اليوم 0 (76.9٪ ± 16.6٪) و CSs البالغة من العمر 3 أسابيع (71.1٪ ± 22.7٪) (الشكل 1D) ، مما يشير إلى تكوين خلوي ثابت ونقي للغاية أثناء الاستزراع. كان هناك تعبير متزايد عن جينات القلب للتقاطعات (GJA1 و JPH2 و PKP2) والديسموسومات (DES) والميتوكوندريا (ATP5A) في الكرات المشتقة من hiPSC-CM (اليوم 42) مقابل hiPSC-CMs المزروعة في 2D لمدة 90 يوما (الشكل 1E). التعبير عن هذه الجينات هو السمة المميزة للتفاعل بين الخلايا والخلايا والنضج30.

بعد ذلك ، تم تقييم الخصائص الوظيفية ل CSs ، وهي معدل الضرب ومعالجة Ca2+ ، في نقاط زمنية مختلفة (الشكل 2). تم تقييم معلمات الكالسيوم العابرة مثل وقت الارتفاع ووقت الذروة ووقت الاضمحلال ومدة عبور الكالسيوم (CTD90) كما هو موضح في الشكل 2 أ ، ب. النسبة المئوية لضرب CSs متشابهة في الأسابيع الثلاثة الأولى بعد التوليد ولكنها انخفضت بشكل ملحوظ في الأسبوع 6 (Wk6) CSs (الشكل 2C). انخفض معدل الضرب بشكل كبير عند Wk3 مقارنة ب Wk1 ، وعلى غرار النسبة المئوية لضرب CSs ، انخفض بشكل كبير عند Wk6 (الشكل 2D). في Wk6 ، لوحظ تدهور CS ، والذي يمكن أن يفسر الانخفاض في كل من معدل الضرب وعدد CSs الضرب. أشار قياس معلمات الكالسيوم العابرة إلى قيمة ذروة أعلى بكثير عند Wk2 (الشكل 2E) ، بينما زاد وقت الارتفاع ووقت الاضمحلال و CTD90 بشكل ملحوظ عند Wk3 مقارنة ب Wk1 (الشكل 2F-H ). مجتمعة ، تظهر هذه النتائج أن الأجسام الكروية المشتقة من hiPSC-CM هي الأمثل وظيفيا في حوالي الأسابيع 2 و 3 بعد الجيل.

يوضح الشكل 3 تأثير حجم الكرة على معدل الضرب ومعالجة الكالسيوم. تم إنشاء CSs عن طريق البذر 2.5 × 10 4 ، 5 × 10 4 ، 10 × 10 4 ، و 20 × 10 4 hiPSC-CMs في بئر من 96 بئرا لما مجموعه 24 CSs / بئر لكل حالة (الشكل 3A). كما هو متوقع ، زاد حجم الكروية مع زيادة عدد الخلايا المستخدمة ، حيث تراوح من 178 ± 36 ميكرومتر إلى 351 ± 65 ميكرومتر (الشكل 3 أ ، اللوحة اليمنى). تم قياس عابري Ca2+ في CSs البالغة من العمر 3 أسابيع عند كثافات البذر الأربعة المختلفة (الشكل 3B). أشارت قياسات CSs النابضة إلى أن حوالي 50٪ فقط من CSs الأصغر حجما (2.5K- و 5K-CSs) كانت تنبض ، في حين أن النسبة المئوية ل CSs ذات الحجم الأكبر (10K- و 20K-CSs) كانت أعلى بكثير (حوالي 85٪) (الشكل 3C). تم عرض معدل ضرب مماثل (حوالي 28 نبضة في الدقيقة) بواسطة 5K- و 10K- و 20K-CSs ، والذي كان أعلى بكثير مقارنة ب 2.5K-CSs (الشكل 3D). كانت قيم الذروة لصور الكالسيوم متشابهة في جميع الظروف المختبرة (الشكل 3E) ، ومع ذلك ، فقد زاد وقت الارتفاع (الشكل 3F) ووقت الاضمحلال (الشكل 3G) و CTD90 (الشكل 3H) بشكل كبير في CSs ذات الحجم الأكبر (10K- و 20K-CSs) مقارنة بالأصغر (2.5K- و 5K-CSs). مجتمعة ، تظهر هذه النتائج أن الأجسام الكروية المشتقة من hiPSC-CM مثالية لفحص مناولة الكالسيوم عند استخدام كثافة البذر بين 10 آلاف و 20 ألف hiPSC-CMs / بئر.

بعد ذلك ، قمنا بتقييم تأثير الحفظ بالتبريد على صلاحية CS ووظيفتها. قبل التحليل ، تم الحفاظ على CSs المذابة في الثقافة لمدة 1 أسبوع (الشكل 4A). كما هو موضح في كل من اختبارات قياس التدفق الخلوي (الشكل 4B) و Calcein-AM (الشكل 4C) ، لم يؤثر الحفظ بالتبريد على صلاحية الخلية داخل CSs. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت CSs المذابة مستويات تعبير مماثلة للبروتينات الساركومية مقارنة ب CSs الطازجة المتطابقة مع العمر (الشكل 4D). تشير هذه البيانات إلى أنه يمكن حفظ CSs بكفاءة لتحليل وظائف القلب اللاحقة والفحص عالي الإنتاجية.

أخيرا ، تم قياس نشاط الضرب ومعالجة Ca2+ في كل من CSs الطازجة والمحفوظة بالتبريد (الشكل 5). تم قياس النسبة المئوية للضرب CSs في نقاط زمنية مختلفة بعد ذوبان الجليد ، على التوالي ، في 2 و 5 و 7 أيام. في حين أن معظم CSs الطازجة أظهرت نشاط الضرب بمرور الوقت ، فمن الواضح أن CSs المحفوظة بالتبريد احتاجت إلى أسبوع واحد من الاستزراع من أجل استعادة نشاط الضرب (الشكل 5B). لم يكن هناك تغيير كبير في معدل الضرب من CSs المذابة مقابل الطازجة. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي نشاط ضرب عفوي في بعض CSs المجمدة (الشكل 5C). على الرغم من انخفاض قيم الذروة بشكل كبير في CSs المجمدة / المذابة مقارنة بالطازجة (الشكل 5D) ، لم تلاحظ أي تغييرات كبيرة في وقت الارتفاع ووقت الاضمحلال و CTD90 من CSs المجمدة / المذابة مقارنة بالطازجة (الشكل 5E-G). تشير هذه البيانات إلى أنه بعد ذوبان الجليد ، من المهم السماح ل CSs بالتعافي في الحاضنة لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل قياس نشاط الضرب و Ca2+ عابرة.

مجتمعة ، تظهر هذه النتائج أن الحفظ بالتبريد للكرويات المشتقة من hiPSC-CM يحافظ على صلاحية خلايا عضلة القلب ، والبنية العضلية ، وخصائصها الوظيفية مثل نشاط الضرب التلقائي ومعالجة الكالسيوم. وبالتالي ، تمثل الأجسام الكروية المشتقة من hiPSC-CM نموذجا مناسبا لتلخيص الفيزيولوجيا الكهربية للقلب بدقة في المختبر.

figure-results-6095
الشكل 1: توليد كرويات قلبية . (أ) التمثيل التخطيطي للتمايز القلبي الموجه القائم على Wnt ، والتوسع اللاحق ل hiPSC-CMs ، وتوليد CSs. تم إنشاؤها باستخدام biorender.com. (ب) صور المجال الساطع في نقاط زمنية مختلفة لزراعة CS. شريط مقياس ، 200 ميكرومتر. أسبوع يمثل الأسبوع. (ج) صور التألق المناعي التمثيلي للبروتينات الساركومية القلبية α-أكتينين وتروبونين T في CSs البالغة من العمر 3 أسابيع. التألق المناعي: Hoechst (أزرق) ، α-أكتينين (أخضر) ، وتروبونين T (أحمر). شريط مقياس ، 200 ميكرومتر. تعرض الصورة المدمجة المكبرة على اليمين تنظيم القطعة العضلية. شريط مقياس ، 50 ميكرومتر. (د) القياس الكمي لقياس التدفق الخلوي للخلايا الإيجابية α-أكتينين قبل (اليوم 0) و 3 أسابيع بعد تكوين CSs. (ن = 14-23 لكل حالة. (E) تم إجراء RT-qPCR على hiPSC-CMs المستزرعة لمدة 90 يوما (2D) وعينات كروية مستزرعة لمدة 42 يوما لتحديد مستويات التعبير لجينات القلب المختلفة المتعلقة بتقاطعات الخلايا والخيوط الوسيطة والميتوكوندريا. (ن = 1-3 دفعات). يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD. NS (غير معنوية) كما تم حسابها بواسطة اختبار t غير مزاوج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7524
الشكل 2: معدل الضرب ومعالجة الكالسيوم في CSs في أسابيع مختلفة بعد التوليد. (أ) أمثلة على معلمات الكالسيوم العابرة المحسوبة بواسطة خوارزمية تحليل علوم فالا في برنامج Cyteseer. (ب) آثار عابرة تمثيلية للكالسيوم وصور الفاصل الزمني ل CSs في نقاط زمنية مختلفة (أسابيع) بعد التوليد. شريط المقياس ، 200 ميكرومتر. (ج) يتم التعبير عن القياس الكمي للدورة الزمنية لنشاط الضرب التلقائي كنسبة مئوية من CSs الضرب. (د) معدل ضرب CSs أثناء وقت الاستزراع. (ه-ح) القياس الكمي لعابرات الكالسيوم التي تظهر قيمة الذروة ووقت الارتفاع ووقت الاضمحلال و CTD90. البيانات المعروضة هي متوسط ± SD. النسخ المتماثلة البيولوجية = ثلاثة ، النسخ المتماثلة التقنية = 38 و 50 و 66 و 7 على التوالي. * ع < 0.05 ، **** ع < 0.001 ؛ ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey للمقارنات المتعددة المخصصة. الاختصارات; CTD = مدة الكالسيوم العابرة ، Wk = أسبوع ، CSs = كرويات القلب البشري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8847
الشكل 3: معدل الضرب ومعالجة الكالسيوم في CSs المتولدة باستخدام كثافات بذر الخلايا المختلفة. (أ) تصوير المجال الساطع (يسار) وقياسات الحجم (يمين) ل CSs المتولدة باستخدام أعداد مختلفة من hiPSC-CMs. شريط مقياس ، 200 ميكرومتر. (ب) آثار عابرة تمثيلية للكالسيوم وصور الفاصل الزمني ل 2.5K-20K-CSs. (ج، د) نسبة الضرب ومعدل الضرب من 2.5K-20K-CSs. (ه-ح) قيمة الذروة ، وقت الارتفاع ، وقت الاضمحلال ، و CTD90 في 2.5K-20K-CSs. البيانات هي المتوسط ± SD. النسخ المتماثلة البيولوجية = ثلاثة ، النسخ المتماثلة التقنية = 28-39. * ع < 0.05 ، **** ع < 0.001 ؛ ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey للمقارنات المتعددة المخصصة. الاختصارات: CTD = مدة الكالسيوم العابرة ، Wk = أسبوع ، k = × 1000 خلية ، CSs = كرويات قلبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-10013
الشكل 4. تأثير الحفظ بالتبريد على صلاحية وبنية الأجسام الكروية القلبية. (أ) التمثيل التخطيطي لتوليد CS ، والبنوك الحيوية اللاحقة ، والذوبان. (ب) اختبار صلاحية خلية قياس التدفق الخلوي في كل من CSs الطازجة والمحفوظة بالتبريد. كعنصر تحكم إيجابي ، تم استخدام علاج بمحلول Triton-X بنسبة 10٪ لمدة 5 دقائق. (ن = 4 لكل شرط). يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD. ** **p < 0.001 ؛ ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey للمقارنات المتعددة المخصصة. (C) اختبار صلاحية خلية Calcein-AM في CSs الطازجة مقابل المذابة بعد 7 أيام من الزراعة (n = 15-17 لكل حالة ، ** **p < 0.001 ، عن طريق اختبار t المزدوج ؛ شريط المقياس ، 200 ميكرومتر). (د) تلطيخ المجال الساطع التمثيلي (يسار) والتألق المناعي لتعبير α-أكتينين وتروبونين T في CSs الطازجة والمذابة. التألق المناعي: Hoechst (أزرق) ، α-أكتينين (أخضر) ، وتروبونين T (أحمر). تعرض الصور المدمجة على اليمين تشققات القطعة العضلية في CSs. شريط مقياس ، 50 ميكرومتر. الاختصارات: X = يوم ذوبان الجليد المختار ، PI = يوديد البروبيديوم ، Cal-AM = calcein-AM ، EthD-I = Ethidium Homodimer I. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-11451
الشكل 5: عابرات الكالسيوم في CSs الطازجة مقابل المذابة. (أ) آثار الكالسيوم العابرة التمثيلية وصور الفاصل الزمني ل CSs قبل الحفظ بالتبريد و 1 أسبوع بعد الذوبان. (ب) نسبة ضربات كرويات القلب الطازجة والمجمدة / المذابة. تمثل الأشرطة تجارب فردية. (ج) معدل ضربات الأجسام الكروية القلبية الطازجة والمجمدة/المذابة. (د-ز) القياس الكمي لمعلمات الكالسيوم العابرة: قيمة الذروة ، وقت الارتفاع ، وقت الاضمحلال ، و CTD90. البيانات هي المتوسط ± SD. * p < 0.05 ، ****p < 0.001 ؛ ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey للمقارنات المتعددة المخصصة. الاختصارات; CTD = مدة الكالسيوم العابرة ، CSs = كرويات القلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: استراتيجيات البوابات التمثيلية لتحليل التدفق الخلوي. (أ) استراتيجية البوابات التمثيلية ل α-actinin hiPSC-CMs الإيجابية في السكان النقيين مقابل التحكم السلبي والتحكم في النمط المتماثل. عدد الخلايا التي تم تحليلها إيجابية α الأكتينين هو 25 × 105. الاختصارات; SSC = مبعثر جانبي ، PI + = يوديد البروبيديوم إيجابي. (ب) استراتيجية بوابة تمثيلية لتحليل الجدوى في كل من التحكم الجديد والمذاب والإيجابي (Triton-X) والتحكم السلبي (غير الملوث). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

يعوق اكتشاف أدوية القلب الاعتماد على نماذج حيوانية وخلوية غير بشرية ذات إنتاجية غير كافية ودقة فسيولوجية لأداء القراءات بدقة. بيولوجيا hiPSC-CM إلى جانب أجهزة HT والتحقيقات الفسيولوجية لديها القدرة على إعادة إدخال النماذج البشرية في المراحل المبكرة من نمذجة أمراض القلب واكتشاف الأدوية. قمنا بتطوير طريقة توليد أنسجة القلب 3D التي تنتج CSs عالية الجودة والوظيفية لنمذجة أمراض القلب المثلى ومنصة فحص المخدرات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الجمع بين التكنولوجيا الكروية في أنظمة المفاعلات الحيوية 3D لإنتاج EV الصناعي يسمح بخطوة ضرورية نحو الترجمة السريرية للعلاج القائم على EV. تعتمد الطريقة الموضحة هنا على عدة عوامل حاسمة وهي متغير من البروتوكولات الحالية9،10،28،29. وتشمل هذه الطرق: 1) توليد تركيبات الأنسجة ثلاثية الأبعاد ، 2) عدد الخلايا الأمثل وتوقيتها قبل الفحص ، 3) تحسين الحساسية والقدرة الإنتاجية العالية للأدوات ، و 4) القدرة على تجميد الأجسام الكروية قبل أي تحليل وظيفي. على عكس البروتوكولات الموصوفة سابقا ، يصف البروتوكول المقترح توليد ما يصل إلى 1500 كروي يوميا ومدى ملاءمته ل HTS. يتطلب التحليل التقليدي لمائة مركب يزيد عن 6 × 0.5 جرعة لوغاريتمية ل 10 مكررات باستخدام أنظمة تصوير الكالسيوم الحالية المكونة من 96 بئرا أو أنسجة القلب المهندسة متعددة الإرسال المكونة من 24 بئرا ما يقرب من 500 مليون إلى 3 مليارات hiPSC-CMs31,32. يجعل التطبيق المقترح فحوصات القلب أقل تكلفة وفعالية من حيث الوقت مقارنة بالأنظمة التقليدية لأن لوحات 96 بئرا تتطلب 10٪ فقط من كثافة البذر مقارنة بالطريقة الموصوفة. علاوة على ذلك ، مقارنة بالبروتوكولات السابقة ، مثل طريقة التعليق والإفلات ، فإن توليد الأجسام الكروية عن طريق التجميع الذاتي في لوحات التثبيت المنخفضة للغاية يتيح التصوير الآلي عالي الجودة للأنسجة الدقيقةالمفردة 33.

هذا النموذج 3D الصغيرة يحاكي النمط الظاهري البيولوجي والفسيولوجي لبيئة القلب والأوعية الدموية في الجسم الحي . كما هو موضح سابقا ، تزداد عابرات الكالسيوم بشكل كبير في تركيبات أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد مقارنة بثقافات الخلايا أحادية الطبقة 2D34.

بعد ذلك ، وجدنا أن كثافة البذر ووقت الاستزراع المناسب هما أيضا عاملان حاسمان لفحص CS ناجح. كانت كثافات 10K-20K hiPSC-CMs لكل كروية والفحص بين الأسابيع 2-3 بعد التوليد مثالية ، في حين أن الكرويات الصغيرة جدا أو القديمة جدا تظهر معالجة مضطربة للكالسيوم (الشكل 2 والشكل 3). لذلك ، من المهم الحفاظ على كثافة البذر متسقة قدر الإمكان ، لأن الحجم يؤثر على المعلمات الوظيفية. أيضا ، على الرغم من أن هذه الطريقة البصرية توفر نتائج جيدة لثقافات 3D الحية كنسيج كامل ، فإن الحصول على البيانات داخل كرويات أكبر على المستوى الخلوي (الفرعي) يمثل تحديا دون الاعتماد على طرق الأنسجة التي تستغرق وقتا طويلا. في الآونة الأخيرة ، تم نشر العديد من الأساليب التي تستخدم "المقاصة البصرية" ، والتي تمكن من الحصول على كرويات 3D كاملة مع فرصة لتحديد كمية خلية واحدة من العلامات. هنا ، قمنا بتكييف بروتوكول لمدة 3 أيام من حصاد CS إلى تحليل الصور ، والذي تم تحسينه للتصوير ثلاثي الأبعاد باستخدام المجهر متحد البؤر29 (الشكل 1C والشكل 4D).

أخيرا ، مع الزيادة في تطبيقات أنسجة القلب 3D والتطبيقات التجارية ، يزداد الطلب على التخزين طويل الأجل والبنوك الحيوية الخاصة بالمريض من مختلف الجهات المانحة. الحفظ بالتبريد هو استراتيجية فعالة لتوليد لوحات HTS من دفعات متعددة بمرور الوقت. تم وصف تجميد hiPSC-CMs سابقا ولا يختلف مقارنة بأنواع الخلايا المستزرعة الأخرى10،35،36. في الآونة الأخيرة ، تم وصف طرق تجميد الألواح مع خلايا 2D37. هنا ، وجدنا أن مجموعة الحفظ بالتبريد PSC هي الحالة المثلى مقارنة بثلاثة آخرين (البيانات غير معروضة) واستخدمنا هذه الوسيلة للتجميد الفعال للكرويات. بعد الحفظ بالتبريد ، تظل الصلاحية عالية (الشكل 4B ، C) ، لكن الخصائص الكهربية ل CSs تتأثر ويلزم فترة حضانة بعد الذوبان. في الواقع ، بعد 1 أسبوع من ذوبان الجليد ، أظهرت CSs نشاط الضرب التلقائي ومعالجة الكالسيوم. ومع ذلك ، فقد تم وصف أن hiPSC-CMs الطازجة والمستردة لا تظهر دائما خصائص جزيئية وفسيولوجية متطابقة38. يجب مراعاة هذا القيد عند استخدام hiPSC-CMs المحفوظة بالتبريد لتقييم قراءات القلب التي يسببها الدواء. علاوة على ذلك ، على الرغم من أننا نعدل بشكل فعال عدد الخلايا لكل كروي والتوقيت الأمثل للتصوير العابر للكالسيوم ، يمكن تحسين كرويات القلب عن طريق خلط خلايا عضلة القلب المشتقة من hiPSC مع الخلايا البطانية ، والخلايا الليفية ، وتقاطعات الخلايا الخلوية ، والمصفوفات خارج الخلية ، مثل الشيتوزان ، أو الكولاجين الرابع ، أو الفبرونيكتين ، أو الماتريجيل ، أو اللامينين ، محاكيا بيئة القلب في الجسم الحي 39 ، 40. بشكل عام ، نقترح بروتوكولا خطوة بخطوة لإنشاء CSs بكفاءة ومناسبة للتطبيقات النهائية مثل نمذجة الأمراض وفحص الأدوية HT.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نود أن نعترف بعلوم VALA لحزمة برامج Cyteseer وتحسين تحليل الكالسيوم الآلي 3D. نود أن نعترف بدعم المنح من مؤسسة PLN (RM). يتم دعم P.A.D. و FS من قبل CUREPLaN Leducq. يتم دعم J.P.G.S. من قبل H2020-EVICARE (# 725229) التابع لمجلس البحوث الأوروبي (ERC). يتم دعم JWB من قبل زمالة UMC Utrecht السريرية ، وزمالة معهد القلب الهولندي ، ومنحة المواهب الشابة CVON-Dosis. مؤسسة القلب الهولندية (CVON-Dosis 2014-40). يتم دعم NC من قبل برنامج الجاذبية "التجديد المدفوع بالمواد" من قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي (RegmedXB # 024.003.013) ، وإجراءات ماري سكودوفسكا كوري (اتفاقية المنحة RESCUE # 801540). ف. س.-ب. مدعوم من صندوق التحالف (UMCU ، UU ، TU / e). يتم دعم A.v.M. من قبل مشروع BRAVE الممول من الاتحاد الأوروبي (H2020 ، ID: 874827)

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24 wells suspenion plate Corning 3738
96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateCorningCLS3474-24EA
AlbumaxThermo Fisher Scientific11020021
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) antibodySigma-AldrichA7811Dilution: 1:200
Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932)Abcamab45932Dilution: 1:200
Ascorbic acid Sigma-AldrichA8960
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific17504-044
BiotinSigma-AldrichB4639
Bovine serum albumin fraction V (BSA)Roche10735086001
Cal-520, AM Abcamab171868
Confocal microscopeLeica DMi8 
Confocal microscope software Leica Las X
Conical tubes 15 mLGreiner Bio-One5618-8271
Creatine monohydrate Sigma-AldrichC3630
DAPI Thermo Fisher ScientificD3571Concentration: 1 µg/mL
DMEM no glucose Thermo Fisher Scientific11966025
EDTAThermo Fisher Scientific15575020
Fructose Sigma-Aldrich76050771.05
GlucoseSigma-AldrichG7021
GlycerolBoom76050771.05
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488InvitrogenA11029Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568InvitrogenA11011Dilution: 1:500
Horizontal shakerIKA4003000
Human induced pluripotent stem cell lines(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)CVI-273 (control 1)
Human induced pluripotent stem cell linesGermany 141 (control 2) 144 (control 3)
Hydrochloric acid (HCl) Ajax Firechem265.2.5L-PL10 M stock solution, corrosive
Isotype control, FITC mouse IgM κ isotypeBD556652
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific10828Protect from light
L-carnitineSigma-AldrichC0283
Myocyte calcium and contractility systemLeica Thunder, DMi8
Non essential amino acids (NEAA)Thermo Fisher Scientific11140
Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0–7.6Santa CruzSC281692Hazardous
PBS, pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010023
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific15140
PES Membrane Vacuum Filter systemCorning 431097
PI/RNase Staining SolutionInvitrogenF10797Dilution: 1:1000
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
PSC Cryopreservation KitThermo Fisher ScientificA2644601
RevitaCellThermo Fisher ScientificA2644501
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific11875
Silicone Elastomer KitSYLGARD184
Sodium dodecyl sulfate solution (10%)Sigma-Aldrich71736
Sodium L-LactateSigma-Aldrich71718
TaurineSigma-AldrichT0625
Tris Fisher Scientific 11486631
Triton X-100MerckX100-1LHazardous
Trypan blue solution, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061
TrypLE Select Enzyme (10x)Thermo Fisher ScientificA1217701
Tween-20 Sigma-AldrichP1379
Urea Sigma-Aldrich51456
Vitamin B12Sigma-AldrichV6629
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)Tocris 1254Protect from light

References

  1. Burridge, P. W., et al. Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  2. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  3. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  4. Paige, S. L., et al. Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells. PLoS One. 5 (6), 11134 (2010).
  5. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  6. Ahmed, R. E., et al. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178 (2020).
  7. Liu, C., et al. Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells. EBioMedicine. 76, 103813 (2022).
  8. Musunuru, K., et al. Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043 (2018).
  9. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  10. Maas, R. G. C., et al. Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334 (2021).
  11. Tremblay, C., et al. A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).
  12. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12 (1), 5142 (2021).
  13. Goldfracht, I., et al. Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications. Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).
  14. Fleischer, S., et al. Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup. Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).
  15. Branco, M. A., et al. Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture. Science Reports. 9 (1), 9229 (2019).
  16. Ergir, E., et al. Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture. bioRxiv. , (2022).
  17. Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scienctific Reports. 7 (1), 5464 (2017).
  18. Kofron, C. M., et al. A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues. Science Reports. 11 (1), 10228 (2021).
  19. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  20. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  21. Tenreiro, M. F., et al. Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering. npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30 (2021).
  22. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).
  23. McDermott-Roe, C., et al. Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799 (2019).
  24. National Library of Medicine (U.S.). Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure. National Library of Medicine. , (2020).
  25. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  26. Oh, J. G., et al. Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization. Journal of Visualized Experiments. 155, 60135 (2020).
  27. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  28. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  29. van Ineveld, R. L., et al. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
  30. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: New phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  31. Ding, B., et al. Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro. Cell Transplantation. 29, 963689719897066 (2020).
  32. Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).
  33. Amaral, R. L. F., et al. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).
  34. Daily, N. J., et al. Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture. Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168 (2015).
  35. Preininger, M. K., et al. Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions. Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).
  36. Kim, Y. Y., et al. Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition. Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).
  37. Daily, M. I., et al. Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation. Cryobiology. 93, 62-69 (2020).
  38. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  39. Yeh, H. -. Y., et al. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  40. Scalise, M., et al. From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved