JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف المقالة الحالية إجراء نهج تصوير داخل الحيوية لمراقبة إشارات الكالسيوم المستحثة ميكانيكيا لخلايا العظم المدمجة في الجسم الحي في الوقت الفعلي استجابة للتحميل الميكانيكي على مستوى الأنسجة لمشط القدم الثالث للفأر.

Abstract

أنسجة العظام حساسة بشكل رائع للاختلافات في حجم الحمل الميكانيكي. الخلايا العظمية ، الخلايا المتغصنة التي تشكل مخلوية في جميع أنحاء العظام ، هي المسؤولة عن الوظيفة الحسية الميكانيكية لأنسجة العظام. أدت الدراسات التي تستخدم علم الأنسجة والنمذجة الرياضية وزراعة الخلايا ومزارع أعضاء العظام خارج الجسم الحي إلى تطوير فهم البيولوجيا الميكانيكية للخلايا العظمية بشكل كبير. ومع ذلك ، فإن السؤال الأساسي حول كيفية استجابة الخلايا العظمية للمعلومات الميكانيكية وترميزها على المستوى الجزيئي في الجسم الحي غير مفهوم جيدا. توفر تقلبات تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العظمية هدفا مفيدا لمعرفة المزيد عن آليات النقل الميكانيكي الحاد للعظام. هنا ، نبلغ عن طريقة لدراسة علم الأحياء الميكانيكي للخلايا العظمية في الجسم الحي ، والجمع بين سلالة الفأر ومؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا الفلورية المعبر عنها في الخلايا العظمية مع نظام تحميل وتصوير في الجسم الحي للكشف مباشرة عن مستويات الكالسيوم في الخلايا العظمية أثناء التحميل. يتم تحقيق ذلك من خلال جهاز ثني ثلاثي النقاط يمكنه توصيل أحمال ميكانيكية محددة جيدا إلى مشط القدم الثالث للفئران الحية مع مراقبة استجابات الكالسيوم المشار إليها بالفلورسنت للخلايا العظمية باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون. تسمح هذه التقنية بالمراقبة المباشرة في الجسم الحي لأحداث إشارات الكالسيوم في الخلايا العظمية استجابة لتحميل العظام بالكامل وهي مفيدة في السعي للكشف عن آليات في علم الأحياء الميكانيكي للخلايا العظمية.

Introduction

يتم تنظيم مصفوفة العظام وفقا للطلب الميكانيكي1،2 ويمكن أن تتغير ديناميكيا لمراعاة المتطلبات الميكانيكيةالمتغيرة 3،4،5. تم نشر العمل الأساسي فيما يتعلق بالآلية الحسية الميكانيكية في العظام كورقة نمذجة منذ حوالي 30 عاما6،7،8 ، حيث تم اقتراح أن الخلايا العظمية المضمنة في العظام تستشعر بالتشوه الميكانيكي على مستوى أنسجة العظام عن طريق حركة السوائل في بيئتها المحلية. تم التحقق من صحة هذا النموذج تجريبيا من خلال التجارب في المختبر وخارج الجسم الحي ، حيث تبين بوضوح أن الخلايا العظمية حساسة تماما للميكانيكا1،2،3،4،5،6 وتعبر أيضا عن السيتوكينات ، التي توجه سلوك بانيات العظم لبناءالعظام 7 وناقضات العظم8،9،10 ، 11،12.

إشارات الكالسيوم هي رسول ثان في كل مكان تم إنشاؤه كشخصية مركزية وهدف تجريبي يمكن الاعتماد عليه في علم الأحياء الميكانيكي للخلاياالعظمية 13،14،15،16. تتميز إشارات الكالسيوم بأنها تتم دراستها على نطاق واسع في بيولوجيا الخلية17 ، مما يعني أن هناك الكثير من المعلومات المعروفة عن آثارها النهائية وأدوات الفلورسنت المقابلة المتاحة للمراقبة التجريبية. استخدمت التحليلات المختبرية إشارات الكالسيوم كوسيلة لتحديد التنشيط الميكانيكي للخلايا العظمية وتوصيف سلوك الإشارات الديناميكية5،18،19. وتجدر الإشارة إلى أن ملاحظة إشارات الكالسيوم في خط خلايا العظم قدمت دليلا قاطعا على أن تنشيط السوائل في مرفقات الإنتجرين على طول عملية الخلية هو على الأرجح الشكل الرئيسي لتنشيط تدفقالسوائل 20. هذه الدراسة هي واحدة من العديد من الدراسات التي تعرض فائدة إشارات الكالسيوم. يتم تحفيزه بشكل موثوق من خلال التنشيط الميكانيكي للخلايا العظمية ، وبالتالي فهو بمثابة هدف قوي لاستجواب البيولوجيا الميكانيكية للخلايا العظمية.

يعتمد النقل الميكانيكي للخلايا العظمية في الجسم الحي بشكل كبير على بيئتها الدقيقة المباشرة. توفر البروتينات المرتبطة بالمصفوفة (على سبيل المثال ، البروتيوغليكان ، الإنتجرين) مرفقات وظيفية بين أغشية خلايا الخلايا العظمية في ترتيب بالغ الأهمية لتنشيط السوائل للخلية21،22. في حين أن التحليلات ثنائية الأبعاد (2D) في المختبر مفيدة ، إلا أنها محدودة من حيث أنها لا تتضمن هذه الميزات ثلاثية الأبعاد (3D) الحرجة. ألقت الاستعدادات خارج الجسم الحي لإشارات الكالسيوم في الخلايا العظمية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بعض الضوء على كيفية استجابة الخلايا العظمية مع الحفاظ على المصفوفة المحيطة سليمة13،16. ومع ذلك ، يعتقد أن إزالة إمدادات الدم من العظام تغير العناصر الغذائية وديناميكيات السوائل في الجهاز الغني الجسي. يتطلب استجواب البيولوجيا الميكانيكية للخلايا العظمية تحقيقا في الجسم الحي لإشارات الخلايا العظمية الناجمة عن الحمل.

تم إعاقة التحقيق في الجسم الحي للخلايا المدمجة في العظام إلى حد كبير بسبب قيود تقنيات التصوير التقليدية ، مثل المجال الساطع والفحص المجهري متحد البؤر. يتم وضع الخلايا العظمية في مصفوفة معدنية23 تتكون من هيدروكسيباتيت ، ونوع الكولاجين 1 ، وبروتينات أخرى غير كولاجينية تحد من إمكانية الوصول البصري24 وتجعل التحقيق في الجسم الحي صعبا من الناحية الفنية. ومع ذلك ، فإن التطورات الحديثة في التصوير الفلوري غير الخطي ومراسلي الكالسيوم المشفرين وراثيا توفر الفرصة للتغلب على هذه التحديات.

هنا ، نبلغ عن نهج جديد مع القدرة على تصوير الخلايا العظمية في الجسم الحي لقياس إشارات الكالسيوم بدقة المستوى الخلوي25. يتم تحقيق ذلك باستخدام علامة فلورية ديناميكية باستخدام مؤشر كالسيوم مشفر وراثيا لأول مرة في خلايا عظم الفئران. تظهر الفئران المصابة بتعبير GCaMP6f الذي يستهدف الخلايا العظمية DMP1-Cre مضان مرئي في الخلايا العظمية في جميع أنحاء قشرة الحجاب الحاجز للفئرانمشط القدم 17،26. نستخدم نظام ثني ثلاثي النقاط من أجل تطبيق مستويات فسيولوجية لحجم الإجهاد بين 250-2,000 με27. تسمح هذه التقنية بالتصور في الجسم الحي لديناميكيات إشارات الكالسيوم في الخلايا العظمية أثناء التحميل الميكانيكي للعظم بأكمله ويمكن أن تكون مفيدة لأي شخص يسعى إلى فهم البيولوجيا الميكانيكية للخلايا العظمية. ستكون هذه الطريقة مناسبة للباحثين الذين يسعون إلى توسيع عملهم من التحليلات المختبرية إلى التطبيقات في الجسم الحي ، خاصة مع الاحتفاظ بالتحليلات الجزيئية الوظيفية (أي التحقيق في النشاط الخلوي عبر إشارات الكالسيوم) بدلا من دراسات التنميط الظاهري واسعة النطاق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الأساليب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة كورنيل.

1. تحضير المواد والمعدات

  1. تصميم وبناء جهاز تحميل مشط القدم لاستخدامه مع مجهر متعدد الفوتون العلوي.
    ملاحظة: تفاصيل مواصفات المكون وتشغيل الجهاز موصوفة في الوثائق التكميلية لدراسةسابقة 25. باختصار ، تتكون المكونات الرئيسية من مشغل في سلسلة مع خلية تحميل وقوس تحميل وحمام مائي ودبوس نقطة ارتكاز. يمكن الحصول على المشغل وخلية الحمل تجاريا ويجب أن يكونا قادرين على استيعاب أحمال تصل إلى 300 جم. يجب أن يكون الحمام المائي ودبوس نقطة الارتكاز وقوس التحميل مبنيا من التيتانيوم أو الفولاذ المقاوم للصدأ. يمكن تصنيعها داخليا أو تجاريا عبر الطباعة المعدنية ثلاثية الأبعاد.
  2. معايرة قيم حجم الإجهاد لإزاحة المشغل مسبقا لمجموعات الفئران الفردية (أي الجنس والعلاج والنمط الجيني). يتم ذلك باستخدام رسم خرائط الإجهاد السطحي في إجراء موضح في دراسةسابقة 25.
  3. استخدم الفئران ذات الخلفية C57BL / 6 ، التي تتراوح أعمارها بين 16 و 18 أسبوعا ، والتي تعبر عن تركيبات مؤشر الكالسيوم الفلوري في الخلايا العظمية. يتم تحقيق التعبير المستهدف للخلايا العظمية عن طريق عبور الفئران GCaMP6f و Dmp1-Cre التي يتم تنشيطها بواسطة flox. تم وصف تفاصيل استراتيجيات التربية والبائعين للفئران المؤسسية في دراسة نشرتسابقا 25.
  4. تعقيم جميع الأدوات الجراحية ، قوس التحميل ، الحمام المائي ودبوس نقطة الارتكاز باستخدام الأوتوكلاف (57.2 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، 3-4 دقائق). تطهير أهداف المجهر بالإيثانول بنسبة 100٪.
  5. قم بتشغيل المكونات الإلكترونية ، بما في ذلك مصدر الليزر والمجهر وخلية الحمل والمشغل. اترك 15-20 دقيقة لكل مكون للتسخين قبل التصوير داخل الحيوية.
    1. تأكد من توصيل المشغل ومكونات خلية الحمل وتنشيطها في جهاز التحكم. قم بإنشاء برنامج التحكم باستخدام مجموعة متنوعة من الأنظمة الأساسية ، بما في ذلك Matlab و LabView و Python ، وفقا لتفضيلات المستخدم. يسمى رمز Matlab الرئيسي المستخدم في هذه الدراسة Actuator_Control_Software_withLoadCell.m (داخل مجلد MT3 Loading Device Control Software.zip الملف التكميلي 1).
      ملاحظة: تأتي معظم أنظمة المجهر ثنائية الفوتون المتوفرة تجاريا مع برنامج تصوير قوي. الميزات الرئيسية المطلوبة لهذه الطريقة هي القدرة على ضبط الليزر على الإثارة المناسبة ل GCaMP6f (920 نانومتر) ، والقدرة على ضبط شدة طاقة الليزر ، ومجموعة السلاسل الزمنية بتردد لا يقل عن 6 هرتز. قبل التجريب ، يجب تأكيد اتصال الليزر ببرنامج التصوير وترتيب مسار الضوء المناسب للتصوير ثنائي الفوتون. يتم تأكيد ذلك بطرق مختلفة اعتمادا على إعداد التصوير. عادة ، هناك مؤشر ضوئي.

2. الجراحة

  1. تحضير مرحلة جراحية وتعقيم السطح بنسبة 70٪ من الإيثانول. تأكد من استخدام تقنيات التعقيم طوال العمليات الجراحية. الحفاظ على مستوى النظافة المطلوب لهذا البروتوكول ، لأنه إجراء نهائي.
  2. قم بتخدير الفأر باستخدام الأيزوفلوران المتبخر الممزوج بهواء أو أكسجين طبي بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة. إجراء التخدير الأولي في غرفة تحريض القوارض مع 3٪ -5٪ إيزوفلوران. الحفاظ على التخدير عند 1٪ -2.5٪ من الأيزوفلوران في مخروط الأنف لإجراءات التصوير الجراحية وداخل الحيوية.
  3. ضع جهاز تسخين أسفل الماوس أو بجانبه للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية التماثلية. راقب درجة حرارة جسم الفأر ومعدل ضربات القلب وتشبع الأكسجين طوال الجراحة. حافظ على معدل التنفس بين 60-80 نفسا في الدقيقة وحافظ عليه عن طريق ضبط جرعة الأيزوفلوران.
  4. ضع الماوس في وضع ضعيف. تأكد من عمق التخدير قبل الشق عن طريق قرصة إصبع القدم. تحديد الموقع بين مشط القدم الثاني والثالث. قم بعمل شق مشرط عبر الأدمة بين مشط القدم الثاني والثالث ، بدءا من الطرف البعيد ويتقدم بشكل قريب على طول العظام (~ 5 مم).
    ملاحظة: مشط القدم بعيد عن عظام الكاحل على المخلب وتتبع مباشرة بالقرب من الكتائب البعيدة. وهي تتكون من مشط القدم (الإنسي إلى الجانبي) الأول والثاني والثالث والرابع والخامس. يتركز مشط القدم الثالث في منتصف الجانب الأخمصي للمخلب الخلفي.
  5. باستخدام الملقط ، افتح موقع الجراحة عن طريق سحب الجلد باتجاه الحواف الإنسية / الجانبية. استئصال الأوتار الباسطة باستخدام مقص Vannas المستقيم لكشف مشط القدم الثالث.
  6. أدخل دبوس نقطة الارتكاز المركزي لجهاز تحميل مشط القدم أسفل مشط القدم الثالث.
    1. في البداية ، أدخل الدبوس في المساحة الصغيرة في الطرف البعيد حيث يلتقي مشط القدم الثالث بالكتائب القريبة ثم حرك الدبوس بالقرب منه حتى يستقر في منتصف العمود الثالث.
    2. احرص بشكل خاص على ضمان وجود واجهة مباشرة بين العظم والدبوس ، باستثناء أي عضلات ووجه. هذا أمر بالغ الأهمية للتصوير المستقر أثناء بروتوكولات التحميل.
  7. أمسك الكاحل بالملقط وضع القدم في حمام مائي مملوء بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco (8-10 مل). قم بتثبيت المخلب في مكانه باستخدام كتيفة التحميل وقم بتوصيل الحامل بترتيب المشغل / خلية الحمل. يظهر التحضير والترتيب الجراحي المكتمل داخل الجهاز في الشكل 1.

3. التصوير

ملاحظة: يحتوي إعداد الفحص المجهري الكامل ثنائي الفوتون المستخدم في هذا البروتوكول على حزمتين من البرامج: Chameleon Discovery GUI V2.0.6 لليزر (الشكل 2) و ThorImageLS4.0 للمجهر (الشكل 3). للتصوير على الفوتونين ، اضغط على Live (الشكل 3 ، زر التشغيل الأزرق). عند إجراء تجربة لتصوير البيانات وحفظها، اضغط على Capture (الشكل 3، علامة التبويب في الأعلى، بجوار إعداد الالتقاط). هذه خاصة بالمعدات والبائعين المستخدمين في هذه التجربة ، ولكن العديد من البدائل ذات المواصفات الضرورية الموجودة في هذا البروتوكول (الأطوال الموجية للإثارة ، وحجم النافذة القابلة للعرض ، ومعدل التقاط الصور ، وما إلى ذلك) ستعمل أيضا.

  1. التقط بعناية فائقة إعداد جهاز التحميل بالماوس وضعه على منصة المجهر.
  2. ابدأ بهدف تكبير منخفض في وضع التألق (الشكل 3 ، القائمة المنسدلة في الأعلى مع تحديدات Multiphoton أو Fluorescence Setup) لتحديد موقع منتصف الحجاب الحاجز للعظم وتوسيطه.
  3. بعد تحديد موقع منطقة الاهتمام ، قم بالتبديل إلى تكبير موضوعي غمر الماء أعلى (20x-40x) وقم بتبديل البصريات إلى فوتونين (الشكل 3 ، القائمة المنسدلة في الأعلى مع تحديدات Multiphoton أو Fluorescence Setup).
    ملاحظة: حجم مجال الرؤية الموصى به لا يقل عن 250 ميكرومتر × 250 ميكرومتر للنشاط الخلوي ويمكن تحقيقه إما بالتكبير/التصغير البصري أو الرقمي حسب نظام التصوير.
    1. الحد الأدنى المناسب لكثافة البكسل هو 512 بكسل × 512 بكسل. لتعيين كثافة البكسل، استخدم إعدادات Galvo/Resonance Area Control (الشكل 3).
    2. عند العثور على عائد الاستثمار ، تجنب التبييض الضوئي عن طريق تقليل الطاقة باستخدام خيار التحكم في الطاقة (الشكل 3) وزيادة تضخيم PMT في إعدادات التحكم في Galvo / Resonance Scanner (الشكل 3).
    3. حدد سطح العظم في وضع الفوتون الثنائي من خلال البحث عن التألق الذاتي للسمحاق الليفي في القناة الخضراء التي تستخدم مرشح ممر النطاق المتمركز عند 525 نانومتر.
      ملاحظة: يكون التألق الذاتي أكثر وضوحا مع الطول الموجي للإثارة عند 1,000 نانومتر ولكنه متاح أيضا عند إثارة 920 نانومتر (الشكل 3 ، التحكم بالليزر متعدد الفوتونات). هذا المعلم مهم لتحديد العمق النسبي لعائد الاستثمار في قشرة مشط القدم عند مراقبة الخلايا العظمية. وتجدر الإشارة إلى أنه أثناء تجارب السلاسل الزمنية ، لا يتم تسجيل العمق الدقيق للمستوى المصور ، على الرغم من أنه يميل إلى أن يتراوح بين 15-30 ميكرومتر. إذا كانت قياسات العمق الدقيقة مطلوبة ، فيجب أخذ مكدس z.
  4. قم بإجراء نوبة تحميل تجريبية للتأكد من أن التحضير الجراحي وتحديد المواقع داخل جهاز التحميل كانا فعالين في تحقيق مجال عائد استثمار مستقر (أي عدم وجود إزاحة للمستوى z). باختصار ، قم بتشغيل دورة تحميل لتقييم استقرار المستحضر الجراحي. قم بإجراء التحميل عن طريق تشغيل القسم Switch on Servo و Move في كود Matlab.
    1. ضع حمولة فارغة صغيرة. تأكد من إعداد بروتوكولات تحميل موجات الهافرسين المناسبة في وقت مبكر. إدخال معلمات التحميل المناسبة التي تم الحصول عليها أثناء المعايرة في القسم 2.1. قم بإجراء التحميل عن طريق تشغيل القسم Switch on Servo و Move في كود Matlab.
    2. إذا كانت هناك حركة مرئية للخلايا على الشاشة ، والتي تأتي من الحركة الدقيقة للعظم استجابة للتحميل أو التنفس ، فحدد عائد استثمار مختلف على طول الاتجاهين y أو z للتأكد من أنه فوق دبوس نقطة الارتكاز المركزي مباشرة. إذا استمرت الحركة ، اضبط الوضع الجراحي للدبوس يدويا أسفل مشط القدم الثالث.
      ملاحظة: منطقة الاهتمام الجيدة (ROI) هي تلك التي لا تتحرك فيها الخلايا داخل وخارج المستوى / التركيز. يمكن ضبط الحركة في اتجاهي x و y للمعالجة اللاحقة باستخدام المكون الإضافي لمطابقة القالب على ImageJ.
  5. إجراء تصوير z-stack أو t-series مع التحميل وفقا للتصميم التجريبي لتسجيل أحداث الإشارات المورفومترية أو الديناميكية الناجمة عن الحمل ، على التوالي.
    1. اضبط الطول الموجي للإثارة لمؤشر الفلورسنت (على سبيل المثال ، 920 نانومتر ل GCaMP6f). بالنسبة إلى z-stack ، استخدم دقة منخفضة بما يكفي لالتقاط ميزات الخلايا العظمية ، مثل خطوات 0.25-1 ميكرومتر. بالنسبة للسلسلة t، استخدم الإعدادات لأخذ عينات من معدل التحميل 6 أضعاف على الأقل. بالنسبة لمعدل تحميل 1 هرتز ، يمثل التصوير بمعدل 6 إطارات في الثانية (FPS) الحد الأدنى من معدل الالتقاط المناسب (الشكل 3 ، التحكم في Galvo / Resonance Scanner).
    2. للتحميل والتصوير المباشر ، قم بتجميع بيانات خط الأساس غير المحملة مع كل نوبة. في هذه الدراسة ، يفضل 60 ثانية من التصوير غير المحمل متبوعا ب 60 ثانية من التحميل والتصوير. تصميم بروتوكولات التحميل والتصوير وفقا لذلك. لجمع البيانات، اضغط على الالتقاط (الشكل 3، علامة التبويب في الأعلى، بجوار إعداد الالتقاط).
      1. تقدر فترة المقاومة للاستجابة الكاملة لإشارات الكالسيوم في خلايا العظام بحوالي 15 دقيقة28. انتظر على الأقل هذه المدة الطويلة بين نوبات التحميل المتسلسلة عند جمع بيانات الإشارات الديناميكية.
      2. طوال التجربة بأكملها ، لا تترك دون رقابة للتأكد من أنه لا يستيقظ بشكل غير متوقع من التخدير أو يعاني من الضيق دون فرصة للتدخل.
        ملاحظة: يجب إجراء القتل الرحيم في نهاية الإجراء عن طريق خلع عنق الرحم أو غيرها من التدابير المناسبة وفقا للطرق المعتمدة من IACUC. هذا بروتوكول عدم البقاء على قيد الحياة مما يعني أن جميع يتم قتلها رحيما بعد التصوير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

نبلغ هنا عن منهجية لدراسة إشارات الكالسيوم في الخلايا العظمية المدمجة في الجسم الحي باستخدام التحضير الجراحي الحاد والتصوير الفلوري متعدد الفوتونات. يمكن ملاحظة إشارة الفلورسنت الخضراء من مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا في الخلايا العظمية عبر تعبير DMP1-Cre.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

من الصعب دراسة الخلايا العظمية تجريبيا بسبب موقعها المضمن في مصفوفة الأنسجة الصلبة ، والتي تتدهور بسرعة أو تتمايز عند إزالة هذا المكان. تطلب البحث عن الخلايا العظمية براعة هائلة على مدى العقود الثلاثة الماضية ، مثل إنشاء خطوط شبيهة بالخلاياالعظمية 29،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

اي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#3 Handle scalpelElectron Microscopy Sciences72040-03Surgical supplies
20x Water immersion objectiveOlympusXLUMPLFLN20XWThis is a 20x objective, but 40x can also be used for this protocol. We recommend water immersions because it needs to be dipped in the bath during imaging, so open-air objective may cause abberrations
A.M. Bickford Omnicon F/AIRAM Bickford80120A sensible answer to anesthesia gas problems in the operating room, the F/AIR anesthesia gas filter was specifically designed to remove waste anesthesia gases such as Isoflurane, Halothane, Enflurane, etc. from the operating room environment.
A.M. Bickford Omnicon F/AIR Kit AM Bickford80000An entire kit with tube and adaptors to connect F/AIR to setup
B6J.Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJThe Jackson Laboratory28865GCaMP6f Mice for cross-breeding with Dmp1-Cre mice
B6N.FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJThe Jackson Laboratory23047Dmp1-Cre Mice for cross-breeding with GCaMP6f  mice
Compression load cellFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.905898LCM100 , 1000 g , Sub-miniature tension & compression load cell (Miniature/Inline Threaded) , RoHS lead free, Material - 17-4 PH S.S. , M3x0.5-thread , 34 Awg 4 conductor braided polyester cable , 5 ft Long
Corning 500 mL DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), 1x [+] calcium, magnesiumVWR International21-030-CVIonically balanced bath that contains calcium submerges the metatarsal during imaging
Dental pick toolElectron Microscopy SciencesSurgical supplies
Ethyl alcohol pure 200 proof ACS reagent >99.5%Sigma AldrichSIAL-459844-500MLSterilization purposes
Fulcrum pinFathomN/AFabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
High resolution and speed USB220 output kitFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.717435Used to connect load cell to laptop
ImageJ 1.53t with Java 1.8.0_172 (for Windows 64-bit)NIHN/AInstall here https://imagej.nih.gov/ij/
IsofluranePiramal Critical Care66794-013-25100% inhalation vapour liquid
Loading bracketFathomN/AFabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document
MATLAB R2019aMathWorksFor running the loading device
Matrx VIP 3000 vaporizer well fill isofluraneButler Schein Animal Health14309Vaporizer for anesthetic
Nonin pulse oximeter Model 2500A Vet2500A Vet
Piezo servo controllerPI-USAE-625Electronic component recommended by the company to be used with the actuator
PiezoMove high-stiffness linear piezo actuatorPI-USAP-602.5SLActuator for the loading device
Scalpel blades, No. 10 for handle No. 3, pack of 100Electron Microscopy Sciences72044-10Surgical supplies
Stainless steel tweezers with sharp, fine tips. Length: 120 mmElectron Microscopy Sciences78326-42Surgical supplies
Thorlabs Bergamo multiphoton microscopeThorLabsN/AThis is only the imaging system and does not have the laser included, although ThorLabs has laser options if desired
Titanium-Saphire Chameleon Discovery NX with Total Power Control (TPC)CoherentN/AThis system technically has two lasers, both a tunable and a fixed laser. However, for the protocol, only the tunable is needed. 
Vannas spring scissors - 4 mm cutting edgeFine Science Tools15018-10Surgical supplies
Water bathFathomN/AFabricated by direct 3D laser sintering of stainless steel (PH1 alloy) from 3D SolidWorks STL files. Original vendor was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, now acquired by FATHOM, specifications are provided in the previously published document

References

  1. Lu, X. L., Huo, B., Park, M., Guo, X. E. Calcium response in osteocytic networks under steady and oscillatory fluid. Bone. 51 (3), 466-473 (2012).
  2. Wu, D., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Matrix-dependent adhesion mediates network responses to physiological stimulation of the osteocyte cell process. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12096-12101 (2013).
  3. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: A fluid-structure interaction approach. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 85-97 (2013).
  4. Genetos, D. C., Kephart, C. J., Zhang, Y., Yellowley, C. E., Donahue, H. J. Oscillating fluid flow activation of gap junction hemichannels induces atp release from MLO-Y4 osteocytes. Journal of Cellular Physiology. 212 (1), 207-214 (2007).
  5. Lu, X. L., Huo, B., Chiang, V., Guo, X. E. Osteocytic network is more responsive in calcium signaling than osteoblastic network under fluid flow. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (3), 563-574 (2012).
  6. Schaffler, M. B., Kennedy, O. D. Osteocyte signaling in bone. Current Osteoporosis Reports. 10 (2), 118-125 (2012).
  7. Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/ -Catenin signaling is required for normal bone homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
  8. Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
  9. Kennedy, O. D., et al. Activation of resorption in fatigue-loaded bone involves both apoptosis and active pro-osteoclastogenic signaling by distinct osteocyte populations. Bone. 50 (5), 1115-1122 (2012).
  10. Rawlinson, S. C. F., Wheeler-Jones, C. P. D., Lanyon, L. E. Arachidonic acid for loading induced prostacyclin and prostaglandin E2 release from osteoblasts and osteocytes is derived from the activities of different forms of phospholipase A2. Bone. 27 (2), 241-247 (2000).
  11. David, V., et al. Ex vivo bone formation in bovine trabecular bone cultured in a dynamic 3D bioreactor is enhanced by compressive mechanical strain. Tissue Engineering Part A. 14 (1), 117-126 (2008).
  12. Davies, C. M., et al. Mechanically loaded ex vivo bone culture system "Zetos": systems and culture preparation. European Cell & Materials. 11, 57-75 (2006).
  13. Adachi, T., et al. Osteocyte calcium signaling response to bone matrix deformation. Journal of Biomechanics. 42 (15), 2507-2512 (2009).
  14. Huo, B., Lu, X. L., Guo, X. E. Intercellular calcium wave propagation in linear and circuit-like bone cell networks. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 368 (1912), 617-633 (2010).
  15. Morrell, A. E., et al. Mechanically induced Ca2+ oscillations in osteocytes release extracellular vesicles and enhance bone formation. Bone Research. 6, 6(2018).
  16. Jing, D., et al. In situ intracellular calcium oscillations in osteocytes in intact mouse long bones under dynamic mechanical loading. FASEB Journal. 28 (4), 1582-1592 (2014).
  17. Chen, T. -W., Wardill, T. J., Sun, Y., Pulver, S. R., Renninger, S. L. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  18. Jacobs, C. R., Temiyasathit, S., Castillo, A. B. Osteocyte mechanobiology and pericellular mechanics. Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 369-400 (2010).
  19. Jing, D., et al. Spatiotemporal properties of intracellular calcium signaling in osteocytic and osteoblastic cell networks under fluid. Bone. 53 (2), 531-540 (2013).
  20. Thi, M. M., Suadicani, S. O., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Mechanosensory responses of osteocytes to physiological forces occur along processes and not cell body and require αVβ3 integrin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21012-21017 (2013).
  21. Wang, Y., McNamara, L. M., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for the role of integrins in flow induced mechanotransduction in osteyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15941-15946 (2007).
  22. McNamara, L. M., Majeska, R. J., Weinbaum, S., Friedrich, V., Schaffler, M. B. Attachment of osteocyte cell processes to the bone matrix. The Anatomical Record. 292 (3), 355-363 (2009).
  23. Franz-Odendaal, T. A., Hall, B. K., Witten, P. E. Buried alive: How osteoblasts become osteocytes. Developmental Dynamics. 235 (1), 176-190 (2005).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
  25. Lewis, K. J., et al. Osteocyte calcium signals encode strain magnitude and loading frequency in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11775-11780 (2017).
  26. Lu, Y., et al. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. Journal of Dental Research. 86 (4), 320-325 (2007).
  27. Rubin, C. T., Lanyon, L. E. Dynamic strain similarity in vertebrates; an alternative to allometric limb bone scaling. Journal of Theoretical Biology. 107 (2), 321-327 (1984).
  28. Jacobs, C. R., et al. Differential effect of steady versus oscillating flow on bone cells. Journal of Biomechanics. 31 (11), 969-976 (1998).
  29. Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
  30. Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
  31. Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
  32. vander Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. Journal of Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).
  33. Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
  34. Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved