JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف طريقة جديدة لقياس التدفق الخلوي للعزل المحتمل لوحدة تشكيل الانفجار المبكر erythroid (BFU-e) ووحدة تشكيل المستعمرة erythroid (CFU-e) مباشرة من نخاع عظم الفأر الطازج والطحال. هذا البروتوكول ، الذي تم تطويره بناء على بيانات النسخ أحادية الخلية ، هو الأول الذي يعزل جميع أسلاف الإريثرويد في الأنسجة بنقاوة عالية.

Abstract

تم تعريف أسلاف الإريثرويد المبكرة في الأصل من خلال قدرتها على تكوين مستعمرة في المختبر وتصنيفها إلى "وحدات" لتشكيل الانفجار وتشكيل المستعمرات المعروفة باسم BFU-e و CFU-e. حتى وقت قريب ، لم تكن طرق العزل المباشر والكامل والمحتمل لأسلاف BFU-e و CFU-e النقية من نخاع عظم الفأر البالغ المعزول حديثا متاحة. لمعالجة هذه الفجوة ، تم تحليل مجموعة بيانات RNA-seq أحادية الخلية (scRNAseq) لنخاع عظم الفأر للتعبير عن الجينات المشفرة لعلامات سطح الخلية. تم دمج هذا التحليل مع فحوصات مصير الخلية ، مما يسمح بتطوير نهج جديد لقياس التدفق الخلوي يحدد ويسمح بعزل مجموعات فرعية كاملة ونقية من أسلاف BFU-e و CFU-e في نخاع عظم الفأر أو الطحال. يحدد هذا النهج أيضا مجموعات فرعية سلفية أخرى ، بما في ذلك مجموعات فرعية مخصبة للخلية القاعدية / البدينة وإمكانات الخلايا الضخمة النواة. تتكون الطريقة من وضع علامات على نخاع العظم الطازج أو خلايا الطحال بأجسام مضادة موجهة إلى Kit و CD55. ثم تنقسم الأسلاف التي تعبر عن هاتين العلامتين إلى خمس مجموعات سكانية رئيسية. تحتوي المجموعة 1 (P1 أو CFU-e ، Kit + CD55 + CD49f med / low CD105 med / high CD71 med/ high) على جميع أسلاف CFU-e ويمكن تقسيمها أيضا إلى P1-low (CD71med CD150 high) و P1-hi (CD71 high CD150low) ، المقابلة ل CFU-e المبكر والمتأخر ، على التوالي ؛ السكان 2 (P2 أو BFU-e ، Kit + CD55 + CD49f med / low CD105 med / high CD71منخفض CD150مرتفع) يحتوي على جميع أسلاف BFU-e ؛ السكان P3 (P3 ، Kit + CD55 + CD49f med / high CD105 med /low CD150 منخفض CD41منخفض) مخصب لأسلاف الخلايا القاعدية/ الخلايا البدينة. يتم إثراء السكان 4 (P4 ، Kit + CD55 + CD49f med / high CD105med / low CD150High CD41 +) للأسلاف الضخمة النواة. والسكان 5 (P5 ، Kit + CD55 + CD49f med / high CD105 med /low CD150High CD41-) يحتوي على أسلاف مع إريثرويد ، خلية قاعدية / بدينة ، وإمكانات خلايا النواة الضخمة (EBMP) وأسلاف متعددة الإمكانات متحيزة لخلايا الدم الحمراء / ضخمة النواة/ متحيزة ل القاعدية (MPPs). يسمح هذا النهج الجديد بدقة أكبر عند تحليل الكريات الحمر وغيرها من الأسلاف المكونة للدم ويسمح أيضا بالرجوع إلى معلومات النسخ لكل مجموعة محددة خلويا.

Introduction

يمكن تقسيم تكون الكريات الحمر إلى مرحلتين رئيسيتين: تكون الكريات الحمر المبكر والتمايز النهائي للإريثرويد (الشكل 1) 1،2،3. في الكريات الحمر المبكرة ، تلتزم الخلايا الجذعية المكونة للدم بسلالة الكريات الحمر وتؤدي إلى ظهور أسلاف الإريثرويد المبكرة ، والتي تم تحديدها لأول مرة في 1970s بناء على إمكاناتها في تكوين مستعمرة في وسط شبه صلب4،5،6،7،8،9 . على نطاق واسع ، تنقسم أسلاف الإريثرويد إلى فئتين: السلف السابقة التي يؤدي كل منها إلى "انفجار" (مجموعة كبيرة من مجموعات خلايا الإريثرويد الأصغر) ، تسمى "وحدة تشكيل الانفجار erythroid" أو BFU-e4،5،6 ؛ وذريتهم ، التي يشكل كل منها مجموعة خلايا أو مستعمرة واحدة صغيرة من الكريات الحمر ، تسمى "وحدة تشكيل مستعمرة erythroid" أو CFU-e7،8،9. BFU-e و CFU-e لا يعبران بعد عن جينات الإريثرويد الطرفية ولا يمكن التعرف عليهما شكليا. بعد عدد من انقسامات خلايا التجديد الذاتي أو التوسع ، يخضع CFU-e لتبديل نسخي يتم فيه تحفيز جينات الإريثرويد مثل الغلوبين ، وبالتالي الانتقال إلى التمايز الطرفي الإريثرويد (ETD)1,10. أثناء ETD ، تخضع الأرومات الحمراء لثلاثة إلى خمسة انقسامات خلوية قبل استئصالها لتشكيل خلايا شبكية تنضج إلى خلايا حمراء.

تم تصنيف الأرومات الحمراء أثناء التمايز النهائي في الأصل بناء على مورفولوجيتها إلى أرومات الدم الحمراء ، والقاعدية ، ومتعددة الألوان ، وتقويم الألوان. سمح ظهور قياس التدفق الخلوي بفرزها وعزلها المحتمل بناء على حجم الخلية (يقاس بالتشتت الأمامي ، FSC) وعلامتين لسطح الخلية ، CD71 و Ter119 11،12،13 (الشكل 1). أحدث هذا النهج ونهج قياس التدفق الخلويالمماثل 14 ثورة في التحقيق في الجوانب الجزيئية والخلوية ل ETD ، مما يسمح بتحليل المرحلة التنموية الخاصة بالأرومات الحمراء في الجسم الحي وفي المختبر 10،15،16،17،18،19،20. يستخدم نهج CD71 / Ter119 الآن بشكل روتيني في تحليل سلائف الإريثرويد.

حتى وقت قريب ، كان نهج قياس التدفق الخلوي المماثل الذي يمكن الوصول إليه للعزل المباشر وعالي النقاء ل CFU-e و BFU-e من أنسجة الفئران قد استعصى على المحققين. بدلا من ذلك ، استخدم الباحثون استراتيجيات قياس التدفق الخلوي التي تعزل جزءا صغيرا فقط من هذه الأسلاف ، غالبا في وجود خلايا غير حمراء تشارك في التنقية داخل نفس المجموعات الفرعية لقياس التدفق الخلوي21. وبالتالي ، اقتصر التحقيق في BFU-e و CFU-e على أنظمة التمايز في المختبر التي تستمد وتضخم BFU-e و CFU-e من أسلاف نخاع العظم السابقة. من الممكن بعد ذلك تطبيق استراتيجيات قياس التدفق الخلوي التي تميز CFU-e عن BFU-e في هذه الثقافات المخصب بالسلف الإريثرويد22،23. يستخدم نهج بديل CFU-e الجنيني و BFU-e ، والتي يتم تخصيبها بدرجة عالية في الجزء السلبي Ter119 من كبد الجنين الفأر في منتصف الحمل10،24،25. ومع ذلك ، لا يسمح أي من هذين النهجين بالتحقيق في البالغين BFU-e و CFU-e في حالتهم الفسيولوجية في الجسم الحي. يمكن تقدير حجم التحدي عند تذكر أنه بناء على فحوصات تكوين المستعمرة ، توجد هذه الخلايا في نخاع العظم البالغ بتردد 0.025٪ و 0.3٪ فقط على التوالي6.

البروتوكول الموصوف هنا هو نهج جديد لقياس التدفق الخلوي يعتمد على التحليل النسخي أحادي الخلية لخلايا نخاع عظم الفأر Kit + التي تم حصادها حديثا (يتم التعبير عن Kit من قبل جميع مجموعات السلف المبكرة لنخاع العظام)1. يحتوي نهجنا على بعض علامات سطح الخلية التي كانت قيد الاستخدام بالفعل بواسطة Pronk et al.21,26. تم استخدام النسخ أحادي الخلية لتحديد مجموعات من علامات سطح الخلية التي تحدد الكريات الحمر وغيرها من السلف المكونة للدم المبكرة (الشكل 2). على وجه التحديد ، يمكن تقسيم جزء CD55 + من خلايا Kit + سالبة النسب (Lin-) إلى خمس مجموعات ، ثلاثة منها تنتج أجزاء متجاورة من مسار الكريات الحمر (الشكل 2). تم تأكيد الهويات النسخية لكل من هذه المجموعات السكانية عن طريق الفرز ، متبوعا ب scRNAseq وإسقاط النسخ أحادية الخلية المصنفة مرة أخرى على خريطة النسخ الأصلية (يمكن استكشاف التعبير الجيني في كل من المجموعات السكانية الخمس ومجموعة بيانات نخاع العظم بأكملها في https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . تم تأكيد إمكانات مصير الخلية لكل مجموعة من المجموعات باستخدام مقايسات تكوين المستعمرة التقليدية (الشكل 2) ، بالإضافة إلى مقايسة مصير خلية واحدة جديدة عالية الإنتاجية 1,27. تظهر هذه التحليلات أن نهج قياس التدفق الخلوي الجديد يؤدي إلى عزل عالي النقاء لجميع أسلاف BFU-e و CFU-e لنخاع العظم والطحال البالغين الجدد. على وجه التحديد ، يحتوي السكان 1 (P1) فقط على CFU-e ولا يحتوي على أسلاف أخرى مكونة للدم ، ويحتوي السكان 2 (P2) على جميع أسلاف BFU-e في نخاع العظم وعدد صغير من CFU-e ولكن لا يوجد أسلاف أخرى1. يتم توضيح البروتوكول المفصل أدناه بمزيد من التفصيل مع مثال على تجربة في الفئران التي تم حقنها إما بالمحلول الملحي أو بهرمون الإريثروبويتين المنبه لتكوين الكريات الحمر (Epo).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا لبروتوكولات الحيوانات A-1586 و 202200017 المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في كلية الطب بجامعة ماساتشوستس تشان.

ملاحظة: تم تفصيل بروتوكولين هنا: أولا ، تحليل التدفق الخلوي (القسم 1) ، متبوعا بتعديلات البروتوكول للفرز الخلوي للتدفق (القسم 2). يستخدم البروتوكول أدناه مقياس التدفق الخلوي / فارز مع 10 قنوات. ويرد مثال على الإعداد في الجدول 1، المشار إليه في الخطوة 1-14-5. من الممكن أيضا تشغيل هذا البروتوكول بتسع قنوات فقط ؛ انظر وسيلة الإيضاح في الجدول 2.

1. تحليل التدفق الخلوي

  1. القتل الرحيم للفئران البالغة (>6 أسابيع) Balb / C أو C57BL6 باستخدام طريقة مناسبة معتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (على سبيل المثال ، استنشاق CO2 متبوعا بخلع عنق الرحم). لتحليل التدفق الخلوي ، سيكون نخاع العظم (BM) من فأر واحد كافيا. للفرز ، يعتمد عدد الفئران على تطبيقات المصب. ويرد أدناه غلة الخلية لكل مجموعة سكانية (الخطوة 2.3.3).
  2. حصاد الأنسجة:
    1. قم بإعداد أنابيب فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) بسعة 5 مل تحتوي على 3 مل من محلول تلطيخ بارد (4 درجات مئوية) ("SB5": محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 0.2٪ ألبومين مصل بقري (BSA) ، 0.08٪ جلوكوز ، 5 مللي متر EDTA) على الثلج. استخدم هذا لوضع الأنسجة المحصودة.
    2. إعداد أنابيب منفصلة لكل الأنسجة تشريح من كل ماوس. لا تجمع المناديل من الفئران المتعددة.
    3. حصاد كل من عظم الفخذ وكلا الساقين. قم بإزالة جميع العضلات من العظام قبل وضعها في الأنبوب باستخدام SB5.
    4. تشريح الطحال من خلال شق على الجانب الأيسر من البطن.
  3. استخراج خلايا نخاع العظم:
    1. ضع عظم الفخذ والساق الذي تم تشريحه حديثا مباشرة في مخزن تلطيخ بارد (SB5) واحتفظ بالأنابيب على الثلج حتى تصبح جاهزة لاستخراج نخاع العظم (BM). ضع ملاطا معقم نظيفا على الثلج في دلو. نقل العظام إلى هاون جنبا إلى جنب مع SB5 من الأنبوب.
    2. قص ما يقرب من 1 مم من نهايات كل عظم بمقص تشريح بحيث تصبح فتحة العظم مرئية فقط.
    3. استخدم إبرة 26 جم ومحقنة سعة 3 مل مملوءة ب SB5 لطرد النخاع من العظام وتجميعه في الهاون. كرر العملية 3-5 مرات باستخدام مخزن مؤقت جديد في كل مرة حتى تظهر العظام عديمة اللون.
    4. قم بتصفية النخاع المتدفق من خلال مرشح شبكي 100 ميكرومتر وجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يوضع على الثلج.
    5. استخدم الهاون والمدقة لسحق العظام المتدفقة في 5-10 مل من SB5. قم بتصفية خليط العظام المسحوقة والعازلة من خلال مصفاة الخلايا 100 ميكرومتر وتجمع مع الخلايا التي تم جمعها في الخطوة 1.3.4.
  4. استخراج خلايا الطحال:
    1. قم بإعداد مرشح شبكي 100 ميكرومتر على أنبوب طرد مركزي فارغ سعة 50 مل يوضع على الجليد. ضع طحالا واحدا على مرشح الشبكة.
    2. أضف 0.5-1 مل من SB5 إلى الطحال لضمان عدم جفافه.
    3. باستخدام الجانب المطاطي من مكبس حقنة سعة 3 مل أو 5 مل ، اهرس الطحال عبر الشبكة. أضف المزيد من SB5 ، 5 مل في المرة الواحدة ، واستمر في الهرس حتى يتم جمع جميع الخلايا في الأنبوب.
  5. من هذه النقطة فصاعدا ، يتم التعامل مع نخاع العظم وخلايا الطحال بنفس الطريقة.
  6. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. قم بشفط المادة الطافية باستخدام إعداد شفط الفراغ.
  7. لعمل تعليق أحادي الخلية ، أعد تعليق الخلايا في 2 مل من SB5 وماصة لأعلى ولأسفل 50 مرة باستخدام P1000 مع طرف فتحة كبير (انظر جدول المواد). هذه لها فتحات طرف واسعة للمساعدة في منع تلف الخلايا الهشة.
  8. لعد الخلايا ، أعد التعليق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 20 مرة. تمييع الخلايا بنسبة 1: 100 في SB5. امزج 10 ميكرولتر من الخلايا المخففة مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق واعتمد على مقياس الدم و / أو عداد الخلايا.
  9. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا عند 33 × 106 خلايا حية / مل في SB5.
  10. تحضير كوكتيل Lin-FITC عن طريق خلط كميات متساوية من كل جسم مضاد في الجدول 3.
  11. قم بإعداد الخلايا لعناصر التحكم أحادية اللون وعناصر التحكم "مضان ناقص واحد" (FMO). نفذ الخطوات 1.11-1.12 بالتوازي مع تحضير وتلطيخ خلايا العينة في الخطوة 1.14 (عينات لتحليل التدفق الخلوي) و / أو الخطوة 2.1 (فرز التدفق الخلوي).
    1. قم بإعداد الخلايا للتحكم في الخلايا غير الملوثة عن طريق نقل 50 ميكرولتر (1.6 × 106 خلايا) من تعليق الخلية إلى أنبوب FACS على الجليد. قم بإعداد الخلايا لكل عنصر تحكم في اللون (11 أنبوبا) عن طريق نقل 50 ميكرولتر (1.6 × 106 خلايا) من تعليق الخلية إلى أنبوب FACS على الجليد.
    2. قم بإعداد عناصر تحكم FMO للألوان التالية (Kit ، CD41 ، CD150 ، CD49f [أربعة أنابيب]) عن طريق نقل 300 ميكرولتر (10 × 106 خلايا) من تعليق الخلية إلى أنبوب FACS منفصل على الجليد.
    3. قم بتدوير الخلايا عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق واستنشاق المادة الطافية.
  12. تلطيخ الأجسام المضادة ل FMOs وأدوات التحكم في اللون الواحد
    1. وصم FMOs عند 33 × 106 خلايا / مل (في الحجم الكلي 300 ميكرولتر) في أنابيب FACS. لكل عنصر تحكم ، أضف جميع الأجسام المضادة باستثناء الجسم المضاد الذي يحمل الاسم نفسه ل FMO. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى Kit FMO ، اترك الجسم المضاد Kit. لكل جسم مضاد ، استخدم التخفيف والتركيز النهائي كما في الجدول 2.
    2. صبغ عناصر التحكم أحادية اللون عند 20 × 106 خلايا / مل (في الحجم الإجمالي 50 ميكرولتر) في أنابيب FACS ؛ لكل عنصر تحكم ، أضف جسما مضادا واحدا عند التركيز المدرج في الجدول 2.
    3. دوامة كل أنبوب تحكم لمدة 2-3 ثوان عند 3000 دورة في الدقيقة (دورات في الدقيقة) ، ثم احتضان عند 4 درجات مئوية ، هزاز لمدة 2.5 ساعة في الظلام ، محمي من الضوء. هز الأنابيب بمحور دوران مواز لطول الأنبوب ، بين زاوية 10 درجات و 60 درجة تقريبا من الأفقي ، بحيث لا تلمس المحتويات الغطاء.
    4. اغسل الخلايا باستخدام SB5: اصنع حجم تعليق الخلية إلى 4 مل باستخدام SB5. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية.
  13. تعليق الخلية:
    1. أعد تعليق عناصر التحكم غير الملوثة وجميع عناصر التحكم أحادية اللون (باستثناء عنصر التحكم DAPI) في 300 ميكرولتر من SB5 وقم بالتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب FACS جديد.
    2. اصنع محلول DAPI / SB5 عن طريق تخفيف مخزون DAPI (1 مجم / مل في 100٪ إيثانول) عند 1: 10000 في SB5.
    3. إعادة تعليق FMOs في 1.8 مل من DAPI / SB5 والتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب FACS جديد
    4. أعد تعليق التحكم في اللون الأحادي DAPI في 300 ميكرولتر من DAPI / SB5 وقم بالتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب FACS جديد سعة 4 مل.
  14. تحضير العينة: إذا كانت الخلايا قيد التحضير لتحليل قياس التدفق الخلوي ، فانتقل إلى الخطوة 1.14. في حالة إعداد الخلايا للفرز ، انتقل إلى الخطوة 2.1.
  15. صبغ عينات التحليل الخلوي للتدفق عند 33 × 10 6 خلية / مل في حجم إجمالي قدره 300 ميكرولتر (10 × 106 خلايا) في أنابيب FACS:
    1. تحضير مزيج سيد الأجسام المضادة. حدد حجم المزيج الرئيسي بعدد العينات ، مع 300 ميكرولتر لكل عينة. اصنع المزيج الرئيسي عن طريق تخفيف جميع الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 2 عند التخفيف المشار إليه في SB5. يعمل Rabbit IgG في المزيج الرئيسي ككتلة Fc.
    2. دوامة كل أنبوب لمدة 2-3 ثوان عند 3000 دورة في الدقيقة ، ثم احتضان عند 4 درجات مئوية ، هزاز لمدة 2.5 ساعة في الظلام ، محمية من الضوء.
    3. اغسل الخلايا باستخدام SB5: اصنع حجم تعليق الخلية إلى 4 مل باستخدام SB5. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية.
    4. إعادة تعليق العينات لتحليل التدفق الخلوي في 1.8 مل من DAPI / SB5 كما هو معد في الخطوة 1.12.5.2 والتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب FACS.
    5. تحليل العينات على مقياس خلوي مع 10 قنوات لاستيعاب اتحادات الأجسام المضادة في الجدول 2 وصبغة الجدوى DAPI. يتم توفير مثال لإعداد القناة في الجدول 1. من الممكن أيضا استخدام تسع قنوات فقط ؛ انظر وسيلة إيضاح الجدول 2 .
    6. أثناء تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي ، استخدم مناهج التعويض الطيفي القياسية بمساعدة عناصر التحكم أحادية اللون وعناصر التحكم في FMO كما هو مفصل في الخطوة 2.4.

2. تعديلات البروتوكول للفرز الخلوي للتدفق

  1. إعداد لين-
    1. قم بتجميع جميع الخلايا المستخرجة من نفس الأنسجة (إما BM أو الطحال) من 10 فئران في أنبوب سعة 50 مل. أعد تعليق كل عينة مجمعة عن طريق السحب باستخدام P1000 بطرف فتحة كبير.
    2. قم بتدوير الخلايا عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق واستنشاق المادة الطافية.
    3. قم بإعداد عناصر تحكم أحادية اللون و FMO كما هو موضح في القسم 1 باستخدام خلايا غير مخصبة.
    4. إثراء خلايا Lin للفرز باستخدام إثراء الخرزة المغناطيسية لخلايا Lin:
    5. أعد تعليق الخلايا بمعدل 1 × 108 خلايا / مل باستخدام SB5 وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. أضف مصل الفئران الطبيعي والأجسام المضادة للبيوتينيل المدرجة في الجدول 4 واحتضنها مع هزاز عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق واستنشاق المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 15 مل من SB5 البارد.
    7. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق واستنشاق المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا عند 1 × 108 خلايا / مل في SB5 البارد واحتفظ بها على الجليد.
    8. دوامة الخرز النانوي المغناطيسي عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5-10 ثوان. خذ 1 مل من الحبيبات النانوية المغناطيسية لكل 10 مل من الخلايا.
    9. اغسل الخرز النانوي في أنبوب 5 مل FACS. اصنع الحجم إلى 4 مل باستخدام SB5 ، وقم بالدوران عند 900 × جم ، و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية.
    10. أعد تعليق الحبيبات النانوية في 500 ميكرولتر من SB5 واخلطها مع الخلايا المعدة في الخطوة 2.1.7. احتضان عند 4 درجات مئوية مع هزاز لمدة 15 دقيقة.
    11. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق واستنشاق المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا عند 1 × 108 خلايا / مل باستخدام SB5.
    12. ضع الأنبوب على مغناطيس عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    13. صب بعناية الطاف في أنبوب جديد 15 مل.
    14. ضع الأنبوب الذي يحتوي على المادة الطافية من الخطوة 2.1.13 على مغناطيس عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. صب بعناية الطاف في أنبوب جديد 15 مل.
    15. قم بتدوير الخلايا من المادة الطافية في الخطوة 2.1.14 عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية.
    16. أعد تعليق الخلايا المخصبة ب Lin في 1 مل من SB5.
    17. تمييع 10 ميكرولتر من الخلايا في 1: 100 في SB5. امزج 10 ميكرولتر من الخلايا المخففة مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق واعتمد على مقياس الدم و / أو عداد الخلايا.
    18. استنادا إلى عدد الخلايا في الخطوة 2.1.17 ، أعد تعليق الخلايا المخصبة ب Lin--33 × 106 خلايا / مل.
  2. تلطيخ الخلايا المخصبة:
    1. صبغ عينات الخلايا المخصبة عند 33 × 106 خلايا / مل في أنابيب FACS عن طريق إضافة جميع الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 2. دوامة كل أنبوب لمدة 2-3 ثوان عند 3000 دورة في الدقيقة ، ثم احتضان عند 4 درجات مئوية ، هزاز لمدة 2.5 ساعة في الظلام ، محمية من الضوء.
    2. اغسل الخلايا باستخدام SB5: قم بتكوين حجم أنابيب FACS إلى 4 مل باستخدام SB5. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 900 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية.
    3. أعد تعليق العينات لتحليل التدفق الخلوي في 4-6 مل من DAPI / SB5 كما هو معد في الخطوة 1.12.5.2 وقم بالتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب FACS جديد سعة 4 مل.
  3. فرز العينات:
    1. قم بفرز العينات باستخدام فوهة كبيرة وضغط منخفض لزيادة إنتاجية CFU-e إلى أقصى حد نظرا لأن خلايا CFU-e تتلف بسهولة تحت ضغط مرتفع. بالنسبة لمقياس التدفق الخلوي المستخدم في هذه الدراسة ، استخدم 14 رطلا لكل بوصة مربعة وفوهة 100 ميكرومتر أو 12 رطلا لكل بوصة مربعة مع فوهة 130 ميكرومتر. قم بإعداد بوابات الفرز كما هو موضح في الخطوة 2.4 أدناه.
    2. تحضير المخزن المؤقت للجمع: أضف 20٪ مصل بقري جنيني إلى برنامج تلفزيوني.
    3. للتحقق من نقاء السكان الذين تم فرزهم، أعد تشغيل حصة صغيرة من كل مجموعة تم فرزها في مخزن مؤقت يحتوي على DAPI، كما هو موضح في الخطوة 1.12.5.2.
      ملاحظة: عادة ، ينتج BM من إجمالي 10 فئران (حوالي 1 × 109 خلايا) ما لا يقل عن 50000-100000 خلية لكل من مجموعات P1-hi و P1-low و P2 مع قابلية بقاء تبلغ حوالي 70٪.
  4. استخدم استراتيجية البوابة الموضحة في الشكل 3 للتحليل أو إعداد بوابات الفرز.
    1. استخدم معلمة التشتت الأمامي (FSC) لإزالة الحطام بناء على الحجم. استخدم الرسم البياني لارتفاع FSC مقابل الرسم البياني لمنطقة FSC لاستبعاد مجاميع الخلايا وتحديد الخلايا المفردة ؛ كرر ذلك مع الرسم البياني للتشتت الجانبي (SSC) مقابل الرسم البياني لمنطقة SSC.
    2. استبعد الخلايا الميتة عن طريق إخراج الخلايا الإيجابية لصبغة الحمض النووي DAPI ، والتي تكون الخلايا القابلة للحياة غير منفذة لها.
    3. حدد خلايا Lin-Ter119-Kit + ، ومن هذه الخلايا ، حدد مجموعة فرعية تعبر عن CD55.
    4. قسم خلايا Lin- Ter119-Kit + CD55 + إلى مجموعتين رئيسيتين ، P6 و P7 ، بناء على التعبير عن CD49f و CD105.
    5. استنادا إلى التعبير عن CD150 و CD41 ، قم بتقسيم P6 إلى P3 (أسلاف الخلايا القاعدية أو الخلايا البدينة) ، و P4 (أسلاف الخلايا الضخمة النواة) ، و P5 (EBMP و MPP المتحيز للإريثرويد).
    6. استنادا إلى التعبير عن CD150 و CD71 ، قم بتقسيم P7 إلى P2 (BFU-e) ، وأوائل CFU-e (P1-low) ، وأواخر CFU-e (P1-hi).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يصف البروتوكول نهج قياس التدفق الخلوي لتحديد BFU-es و CFU-es في خلايا نخاع العظم والطحال التي تم حصادها حديثا. يبدأ بحصاد BM الطازج والطحال من الفئران ووضع الأنسجة على الجليد على الفور. يتم إجراء جميع الإجراءات في البرد للحفاظ على صلاحية الخلية. يتم تصنيف الخلايا بكوكتيل الأجسام المضادة "النسب" ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

القدرة على عزل أسلاف BFU-e و CFU-e بشكل مستقبلي مباشرة من الأنسجة الطازجة ذات النقاء العالي قد استعصت على الباحثين في السابق. نهجنا الجديد ، الذي تم التحقق من صحته باستخدام scRNAseq ومقايسات مصير الخلية1،27 ، يقدم الآن الأدوات اللازمة للقيام بذلك.

هناك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يعلنونه.

Acknowledgements

هذا العمل مدعوم بمنح المعاهد الوطنية للصحة R01DK130498 و R01DK120639 و R01HL141402

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Life Technologies15575020
1000 µL large orifice tipsUSA sceintific1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) AntibodyBioLegend131806
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) AntibodyBioLegend105826
Biotin-CD11bBD Biosciences557395M1/70 (clone)
Biotin-CD19BD Biosciences5537841D3 (clone)
Biotin-CD4BD BiosciencesBDB553045RM4-5 (clone)
Biotin-CD8aBD BiosciencesBDB55302953-6.7 (clone)
Biotin-F4/80Biolegend123106BM8 (clone)
Biotin-Ly-6G and Ly-6CBD Biosciences553125RB6-8C5 (clone)
Biotin-TER-119BD Biosciences553672TER-119 (clone)
Bovine Serum AlbuminSigma aldritchA1470
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f AntibodyBioLegend313624
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 AntibodyBioLegend133921
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) AntibodyBioLegend115931
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid CellsBD Biosciences563827
ChromPure Rabbit IgG, whole moleculeJackson ImmunoResearch Laboratories011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Life TechnologiesD1306
Digital DIVA hardware and software for LSR IIBD Biosciences
FITC anti-mouse F4/80 AntibodyBioLegend123108
FITC Rat Anti-CD11bBD Biosciences557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19BD Biosciences553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6CBD Biosciences553127
FlowJo software FlowJoversion 10Flow cytometer analysis software
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzerBD BiosciencesFlow cytometer 
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle SetAmazon
Normal rat serumStem Cell Technologies13551
PE anti-mouse CD105 AntibodyBioLegend120408
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 AntibodyBioLegend113812
Phosphate Buffered Saline, 10x SolutionFisher scientificBP3994
Streptavidin NanobeadsBioLegend480016Magnetic beads

References

  1. Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
  2. Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
  3. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504(2021).
  4. Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. Robinson, W. A. , National Institutes of Health, US Government Printing Office. (1974).
  5. Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
  6. Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
  7. Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
  8. Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
  9. Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
  10. Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484(2010).
  11. Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809(2011).
  12. Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
  13. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  14. Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
  15. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504(2020).
  16. Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334(2021).
  17. Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383(2012).
  18. Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
  19. Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
  20. Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192(2011).
  21. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  22. Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
  23. Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
  24. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  25. Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
  26. Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
  27. Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
  28. Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
  29. Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189 FACS CFU e BFU e

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved