استخراج وتوسيم وتنقية الخلايا الخاصة بالنسب من الجريبات الغارية البشرية

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولات لتحديد وتنقية خلايا المبيض من بصيلات الغار. نوضح طرق معالجة المبايض الكاملة للحفظ بالتبريد للشرائط القشرية مع حصاد البصيلات الغارية السليمة التي يتم معالجتها إنزيميا لتحرير أنواع متعددة من الخلايا المقيمة في البصيلات ، بما في ذلك الخلايا الحبيبية ، والثيكا ، والبطانة ، المكونة للدم ، والخلايا اللحمية.

Abstract

يعد تنشيط البويضات ونموها وتطورها ونضجها عملية معقدة يتم تنسيقها ليس فقط بين أنواع متعددة من خلايا المبيض ولكن أيضا عبر نقاط تحكم متعددة داخل دائرة المهاد / الغدة النخامية / المبيض. داخل المبيض ، تنمو أنواع متعددة من الخلايا المتخصصة في ارتباط وثيق مع البويضة داخل جريبات المبيض. تم وصف بيولوجيا هذه الخلايا بشكل جيد في المراحل اللاحقة ، عندما يتم استردادها بسهولة كمنتجات ثانوية للعلاجات الإنجابية المساعدة. ومع ذلك ، فإن التحليل المتعمق للجريبات الغارية الصغيرة المعزولة مباشرة من المبيض لا يتم إجراؤه بشكل شائع بسبب ندرة أنسجة المبيض البشري ومحدودية الوصول إلى المبيض في المرضى الذين يخضعون للعلاج الإنجابي المساعد.

تتيح طرق معالجة المبايض الكاملة للحفظ بالتبريد للشرائط القشرية مع التحديد / العزل المتزامن للخلايا المقيمة في المبيض إجراء تحليل عالي الدقة للمراحل المبكرة من تطور الجريب الغاري. نوضح بروتوكولات لعزل أنواع الخلايا المنفصلة عن طريق معالجة الجريبات الغارية إنزيميا وفصل الخلايا الحبيبية والثيكا والبطانية والمكونة للدم واللحمية. يتيح عزل الخلايا عن الجريبات الغارية بأحجام ومراحل نمو مختلفة التحليل الشامل للآليات الخلوية والجزيئية التي تدفع نمو البصيلات وفسيولوجيا المبيض ويوفر مصدرا للخلايا القابلة للحياة التي يمكن زراعتها في المختبر لتلخيص البيئة المكروية للجريب.

Introduction

العناصر الوظيفية الأساسية للمبيض البشري هي البصيلات التي تحكم نمو وتطور البويضات. تم وضع بروتوكولات عزل الخلايا المسامية بشكل جيد في سياق الإخصاب في المختبر ، ولكنها مناسبة فقط لجمع الخلايا من بصيلات اللوتين عند نقطة استرجاع البويضة¹. لقد طورنا بروتوكولا يتيح عزل مجموعات الخلايا المنفصلة من الجريبات الغارية في مراحل النمو المختلفة التي تنشأ من المبايض الأصلية أو أنسجة المبيض المزروعة^{بالأجانب 2}. على الرغم من وجود إجماع على أن مساهمات الخلايا المقيمة في الجريب في زراعة البويضة مهمة للغاية ، إلا أن القليل من الدراسات قد حددت واستخرجت الأنواع الفرعية المظهرية الفريدة الموجودة في بصيلات المرحلة الغارية. إن الفهم الأعمق للتسلسل الهرمي للتمايز ونقل الإشارات بين الخلايا المتخصصة خلال مراحل النمو المختلفة يمكن أن يوسع فهمنا لفسيولوجيا المبيض في ظل الظروف الاستتبابية والمرضية. علاوة على ذلك ، فإن التمييز بين الأنواع الفرعية الخلوية المنفصلة ومساهماتها الجزيئية في نمو / نضج الجريب قد يوفر وسيلة لتوليد بدائل خارج الجسم الحي تعيد بناء وظيفة المبيض لتعزيز نضوج البويضة و / أو علاج ضعف الغدد الصماء.

يساهم كل نوع فريد من الخلايا داخل المبيض في الوظيفة المعقدة للجريب ، والتي تعمل بشكل فعال كعضو صغير منفصل لتعزيز نمو ونضج البويضة التي تحتوي عليها. يتم تغليف البويضة ، وهي محور الجريب ، مباشرة بطبقة مستمرة من الخلايا الحبيبية (GCs) ، حيث تشكل خلايا الثيكا (TCs) طبقة ثانوية من الخلايا التي تتحد مع البويضة و GCs لتكوين الوحدة المسامية. على الرغم من تصنيفها إلى مجموعتين ، إلا أن GCs و TCs تحتوي على العديد من الأنواع الفرعية. يتم تصنيف GCs وفقا لموقعها داخل المسام ؛ يتم تعيين GCs التي تحيط بالبويضة مقابل تلك المجاورة للغشاء القاعدي على أنها GCs بيضوية وجدارية ، على التوالي ، وتعرض هذه الأنواع الفرعية توقيعات نسخية فريدة. تحتوي TCs على العديد من الأنواع الفرعية التي تعمل على توفير الدعم الستيرويدي والأيضي والهيكلي. تلعب الخلايا البطانية وحول الأوعية الدموية والخلايا المناعية دورا مركزيا في الحفاظ على فسيولوجيا المبيض الطبيعية. لا تعمل سدى المبيض كركيزة لنمو الجريب فحسب ، بل من المحتمل أيضا أن توفر مصدرا للأسلاف التي تؤدي إلى ظهور TCs. هذا المركب متعدد الطبقات من الأنواع الفرعية الخلوية داخل المبيض هو ما يمكن من وظيفته كعضو غدد صماء وعضو تناسلي.

تقدم هذه الورقة بروتوكولا لتحديد وتنقية الخلايا الحبيبية ، الثيكا ، اللحمية ، البطانية ، والمكونة للدم من الجريبات الغارية. لقد استخدمنا هذا البروتوكول لعزل خلايا المبيض هذه وتحليلها باستخدام تسلسل الخلية الواحدة ، متبوعا بتلطيخ محدد في بصيلات مراحل النمو المختلفة. يوفر البروتوكول منهجية مباشرة قابلة للتكرار وستمكن من التحليل عالي الدقة لكل من فسيولوجيا وأمراض المبيض.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في طب وايل كورنيل. تم إجراء جميع تجارب زرع الأجانب باستخدام أنسجة المبيض وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. تم عزل كلا المبيضين من متبرع عضو ميت دماغيا يبلغ من العمر 14 عاما وليس له تاريخ من العلاج الإشعاعي / الكيميائي ولا يوجد تاريخ موثق لأمراض الغدد الصماء أو الإنجاب. وافقت لجنة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابعة ل Weill Cornell Medicine على جمع الأنسجة ، وتم الحصول على موافقة من عائلة المتبرع بالأعضاء بعد الموافقة المستنيرة فيما يتعلق باستخدام الأنسجة.

1. جمع أنسجة المبيض والتعامل معها

1. جمع المبايض الكاملة والأنسجة المرتبطة بها ، وشطف في محلول ملحي معقم.
2. باستخدام ملاقط معقمة ، ضع المبايض في وعاء معقم. صب محلول معقم ومخزن وبارد (على سبيل المثال ، وسط Leibovitz's L-15) في الحاوية. تأكد من تغطية الأنسجة بالكامل بالسائل.
3. أغلق الحاوية وقم بتكديسها مرتين باستخدام أكياس بلاستيكية معقمة. انقل الحاوية على الثلج داخل صندوق معزول (مثل الستايروفوم). نقل العينات إلى المختبر الذي سيقوم بمعالجة المبايض في أسرع وقت ممكن ، ويفضل أن يكون ذلك في وقت لا يتجاوز 5 ساعات ^3,4.

2. معالجة أنسجة المبيض

ملاحظة: تأكد من تحضير جميع الكواشف والأدوات قبل وصول الأنسجة إلى المختبر لتقليل الفاصل الزمني الإقفاري قدر الإمكان. يمكن تحضير المخازن المؤقتة حتى 1 أسبوع قبل التجميد وتبريدها حتى الاستخدام.

1. الاستعدادات لمعالجة المبيض والتجميد
   1. وضع أدوات جراحية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية استعدادا لمعالجة الأنسجة: مشرط رقم 21 ؛ مشرط واحد رقم 11 ؛ مقص منحني ناعم حاد ملقط طويل واحد (~ طول 150 مم) ؛ واثنين من ملقط متوسط (~ طول 110 مم).
   2. تحضير 100 مل من وسط معالجة الأنسجة (انظر جدول المواد): وسط ليبوفيتز L-15 يحتوي على محلول مضاد حيوي مضاد حيوي وفلتر باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر. حافظ على الوسط باردا.
   3. قم بتسمية المبردات ، وأضف 1.5 مل من محلول التجميد (انظر جدول المواد) إلى كل قارورة ، وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   4. تتوفر لوحة من 6 آبار في متناول اليد للاستخدام.
2. عند وصول الأنسجة
   1. رش الحاوية بمحلول إيثانول بنسبة 70٪ ، وامسحها جيدا ، وضعها داخل خزانة السلامة الحيوية.
   2. ارتداء قفازات معقمة ، افتح الحاوية. ضع المبيض في طبق بتري معقم ، واسكب وسطا مبردا (من الخطوة 2.1.2) لترطيب الأنسجة. تأكد من أن المبيض نصف مغمور في الوسط.
   3. إزالة أي خيوط أو مواد أخرى وتشريح الأنسجة المحيطة المتبقية بعيدا عن المبيض.

3. عزل بصيلات الغار

1. تحديد بصيلات فردية للعزل. عند اختيار بصيلات صحية ، استبعد أي بصيلات مملوءة بالدم أو داكنة أو غير متماثلة ، حيث من المحتمل أن تكون هذه الجريبات.
2. عزل الجريبات الغارية المختارة من المبيض بأكمله باستخدام المشارط ، والحفاظ على الغار سليما عن طريق استئصال الأنسجة القشرية التي تشمل الجريب.
3. ضع كل جريب غاري سليم تم استئصاله في بئر واحد من اللوحة المكونة من 6 آبار. إذا لزم الأمر لأغراض وصفية ، استخدم مسطرة موضوعة أسفل الطبق لتحديد قطر الجريب.
4. باستخدام مشرط ، قم بتقسيم الجريب الغاري السليم للوصول إلى التجويف الغاري ، وأضف 4 مل من وسط انفصال الخلايا الأنزيمية. احتضان الطبق في حاضنة مرطبة عند 5٪ CO₂ و 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
5. كرر استخراج بصيلات غارية إضافية حسب الحاجة.

4. عزل الخلايا المقيمة للجريب

1. بعد الحضانة ، أضف 4 مل من الوسط المتاح الذي يحتوي على 20٪ FBS ، واغسله عن طريق السحب المتكرر والقوي للوسط فوق البصيلات المنقسمة باستخدام P1000 micropipette.
2. جمع الوسيط ، وتمريره من خلال مرشح 100 ميكرومتر.
3. جهاز طرد مركزي الطافاح المصفى عند 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. نضح المادة الطافية ، واحتفظ بحبيبات الخلية (المخصبة ب GCs) على الثلج لوضع العلامات وفرز الخلايا المنشطة بالتألق (FACS).
4. ضع الأنسجة المتبقية في خليط من كولاجيناز (100 وحدة / مل) و dispase (1 وحدة / مل) مخفف في محلول ملحي متوازن (على سبيل المثال ، هانكس) ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 5٪ CO₂ و 37 درجة مئوية ، مما يؤدي إلى تعطيل الأنسجة ميكانيكيا عن طريق التثليث والامتصاص القوي (أي 10-15 يمر عبر طرف الماصة) مرتين بعد 10 دقائق و 20 دقيقة.
5. استرجع الوسائط التي تحتوي على الأنسجة ، واغسلها عن طريق السحب من خلال طرف ماصة P1000 micropipette ، وقم بالضغط من خلال مرشح 100 ميكرومتر.
6. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. نضح المادة الطافية ، وضع جانبا حبيبات الخلية (المخصب ب TCs وخلايا السدى) على الجليد لوضع العلامات و FACS.

5. فرز الخلايا المنشط بالفلورة

1. أعد تعليق كريات الخلايا في محلول مانع (PBS + 0.1٪ FBS) ، واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
2. أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام و 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، ونضح الطاف.
3. أعد تعليق كريات الخلايا في محلول مانع يحتوي على أجسام مضادة مقترنة مباشرة (انظر الجدول 1 للحصول على مجموعات الأجسام المضادة المناسبة لتحديد GCs و TCs) ، واحتضانها على الجليد لمدة 10 دقائق.
4. اغسل الخلايا وطردها مركزيا على حرارة 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، وتشغيل تعليق الخلية من خلال أداة FACS لالتقاط عدد صغير من الخلايا (500-1000) باستخدام شدة مضان الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور للبوابة.
5. لتحديد المجموعات السكانية الفرعية الفريدة ، استخدم استراتيجيات البوابات التالية:
   1. لتنقية GCs ، ارسم بوابة حول خلايا CD45 + (الشكل 1B) ، واستبعد هذه المجموعة من السكان CD99 ⁺ (الشكل 1A والشكل 1C) ؛ بعد ذلك ، قم بتقسيم جزء CD99 + المتبقي إلى كسور PVRL ^+/- (الشكل 1A والشكل 1C).
   2. لتنقية TCs والسدى ، قم ببوابة إجمالي ENG + (الشكل 1A) أو CD55 + (الشكل 1D) لاستبعاد الجزء البطاني CD34 + (الشكل 1E) وتمييز الخلايا الستيرويدية (ANPEP ⁺) وغير الستيرويدية (ANPEP^-). كن حذرا للتعويض عن النزيف بين الفلوروفورات القريبة في أطياف الانبعاث.
6. للتحقق من نقاء جزء الخلية الذي تم فرزه ، قم بتشغيل 5٪ من إجمالي الحجم الملتقط من خلال أداة FACS ، وتأكد من أن الخلايا تملأ البوابات المتوقعة وأنها موجودة بنقاوة >95٪.

6. معالجة الأنسجة القشرية المبيض

1. يقسم ما تبقى من المبيض إلى شطرين، ويستأصل النخاع باستخدام مقص ومشارط دقيقة منحنية، مع الحرص على تجنب تلف قشرة المبيض.
2. استمر في معالجة قشرة المبيض وترققها عن طريق الكشط اللطيف حتى يبقى الحد الأدنى من النخاع. تأكد من استخدام الحد الأدنى من القوة اللازمة.
   ملاحظة: يجب أن يتراوح سمك الأنسجة القشرية بين 1 مم و 1.5 مم.
3. قسم الأنسجة القشرية إلى شرائح بعرض 2-3 مم على طول المبيض.

7. تجميد بطيء لأنسجة المبيض

1. التحضير للتجميد
   1. ضع شريطا قشريا واحدا في كل قارورة مبردة مبردة تحتوي على محلول تجميد.
   2. رج القنينات المبردة التي تحتوي على الشرائط القشرية على طبق دوار لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
2. تجميد بطيء لأنسجة المبيض⁵
   1. ضع المبردات التي تحتوي على أنسجة المبيض في مجمد قابل للبرمجة يبدأ عند 0 درجة مئوية.
   2. تبرد بمعدل 2 درجة مئوية / دقيقة حتى -7 درجة مئوية.
   3. الحفاظ على cryovials في درجة الحرارة هذه لمدة 10 دقائق.
   4. نواة تكوين بلورات الجليد عن طريق لمس كل cryovial مع طرف القطن الذي تم غمرها لفترة وجيزة في النيتروجين السائل (LN₂).
   5. تبرد بمعدل 0.3 درجة مئوية / دقيقة حتى تصل درجة حرارة العينة إلى -40 درجة مئوية.
   6. قم بزيادة معدل التبريد إلى 10 درجة مئوية / دقيقة حتى تصل درجة حرارة العينة إلى -140 درجة مئوية.
   7. نقل cryovials للتخزين في LN₂.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

قمنا بعزل البصيلات من سطح المبيض ومعالجتها إنزيميا لعزل GCs وكذلك خلايا theca و stroma المحيطة بالتجويف الغاري. تم جمع الخلايا ، وتم فرز كسور الخلايا من البصيلات الغارية (بأقطار تتراوح بين 0.5 مم و 4 مم) بواسطة FACS إلى نقاء >95٪ (الشكل 1).

لتسمية وتنقية الكسور الخلوية الفر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يعد تحسين دقة التنوع الخلوي داخل بصيلات المبيض أمرا مهما سريريا لعدة أسباب. عند تطبيق البروتوكول أعلاه على عزل الأنواع الفرعية المظهرية الفريدة الموجودة داخل بصيلات المرحلة الغارية ، يجب مراعاة عدة عوامل. أولا ، تعد صحة وصلاحية أنسجة المبيض التي تستمد منها الجريب الغاري أمرا بالغ الأهمي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, reagents
Antibiotic-Antimycotic 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Anti-Anti
Antifade Mountant solution	Thermo Fisher Scientific	P36930	ProLong Gold
Collagenase from Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C 2674
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dispase II, powder	Thermo Fisher Scientific	17105041
DMSO	Millipore Sigma	D 2650	Dimethyl sulfoxide
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Enzyme Cell Detachment Medium	Thermo Fisher Scientific	00-4555-56	Accutase
Fetal Bovine Serum, heat-inactivated	Thermo Fisher Scientific	10438026
Hanks′ Balanced Salt solution	Thermo Fisher Scientific	14175079	no calcium, no magnesium, no phenol red
Leibovitz’s L-15 medium	Thermo Fisher Scientific	11415064
Normal Saline	Quality Biological	114-055-101
Sucrose	Millipore Sigma	S 1888
Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)
- 69.64 mL of Leibovitz's L-15
- 17.66 mL of fetal bovine serum
- 3.42 g of sucrose
- 10.65 mL of DMSO
- 1 mL of antibiotic-antimycotic
Lab Plasticware and Supplies
6-well Clear Flat Bottom Not Treated	Corning	351146	Falcon
Cell Strainer 100 µm	Fisher scientific	352360	Corning, Falcon
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	377267	CryoTube 1.8 mL
Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm	Millipore Sigma	CLS430599	60EA
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL	Fisher scientific	352235	Corning, Falcon
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm	Corning	431154
Antibodies
ANPEP	BioLegend	301703
CD34	R&D Systems	FAB7227A
CD45	BioLegend	304019
CD55	BioLegend	311306
CD 99	BioLegend	371308
PVRL	BioLegend	340404
Surgical tools
long forceps (~150 mm length)	Fisherbrand	12-000-128	Fisher Scientific
medium forceps (~110 mm length)	Fisherbrand	12-000-157	Fisher Scientific
number 21 scalpel	Andwin Scientific	EF7281H	Fisher Scientific
number 11 scalpel	Andwin Scientific	FH/CX7281A	Fisher Scientific
sharp fine curved scissors	Roboz Surgical	RS-5881
Instruments
FACSJazz Flourescence activated cell sorter	BD
LSM 710 META Confocal microscope	Zeiss