JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يعد الوسط الخالي من الفينول الأحمر / الخالي من مصل الجنين البقري خيارا أفضل من RPMI المتقدم للتخلص من الهرمونات الخارجية دون تغيير الوظيفة الطبيعية لخلايا كأس الملتحمة في دراسة الاختلافات القائمة على الجنس.

Abstract

جفاف العين هو مرض متعدد العوامل يؤثر على صحة سطح العين ، مع انتشار أعلى بشكل كبير لدى النساء. يساهم اضطراب الميوسين المكون للهلام الذي تفرزه الخلايا الكأسية الملتحمة (CGCs) على سطح العين في أمراض سطح العين المتعددة. يعد التخلص من الهرمونات الجنسية الخارجية أمرا ضروريا للحصول على نتائج متسقة أثناء الدراسة المختبرية للاختلافات القائمة على الجنس في CGCs. تصف هذه الورقة طريقة لتقليل وجود الهرمونات الخارجية في دراسة الاختلافات القائمة على الجنس في CGCs مع الحفاظ على وظيفتها الفسيولوجية. تم استزراع CGCs من المتبرعين البشريين بعد الوفاة من كلا الجنسين من قطع من الملتحمة في وسط RPMI مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (يشار إليه باسم الوسط الكامل) حتى التقاء. قبل ما يقرب من 48 ساعة من بدء التجارب ، تم نقل CGCs إلى وسط RPMI بدون الفينول الأحمر أو FBS ولكن مع 1٪ BSA (يشار إليه باسم الوسط الخالي من الفينول الأحمر). تمت دراسة الوظيفة الخلوية الطبيعية عن طريق قياس الزيادة في تحفيز [Ca 2+] ([Ca 2+] i) داخل الخلايا بعد تحفيز الكرباكول (Cch ، 1 × 10-4 M) باستخدام المجهر fura 2 / acetoxymethyl (AM). أظهرت النتيجة أن CGCs حافظت على الوظيفة الطبيعية في الوسائط الخالية من الفينول الأحمر بعد 48 ساعة. لم يلاحظ فرق كبير في استجابة [Ca2+]i بين وسط RPMI الخالي من الفينول الأحمر والوسط الكامل عند تحفيز Cch. لذلك ، نوصي باستخدام وسيط RPMI الخالي من الفينول الأحمر مع 1٪ BSA للتخلص من الهرمونات الخارجية دون تغيير الوظيفة الطبيعية ل CGCs في دراسة الاختلافات القائمة على الجنس.

Introduction

تؤثر الاختلافات القائمة على الجنس على عمليات متعددة لسطح العين1،2،3. المظهر السريري لهذه الاختلافات القائمة على الجنس هو الاختلاف في انتشار العديد من أمراض سطح العين بين الرجال والنساء ، مثل جفاف العين والتهاب الملتحمة4،5،6. تشير الدلائل إلى أن الاختلافات القائمة على الجنس تنشأ من مستويات بيولوجية متعددة ، بما في ذلك الملامح المختلفة للجينات على كروموسومات X و Y7 وتأثيرات الهرمونات8. يمكن أن توفر دراسة الأساس الجزيئي للاختلافات القائمة على الجنس فهما أفضل للمرض ، وفي النهاية ، تحسين الطب الشخصي.

يتكون سطح العين من الغشاء المسيل للدموع والقرنية والملتحمة. لوحظت الاختلافات القائمة على الجنس في مكونات متعددة من سطح العين ، بما في ذلك الفيلم المسيل للدموع9،10 ، والقرنية11 ، والغدة الدمعية 12،13 ، وغدد ميبوميان التي تفرز أيضا الدموع 12. حققت العديد من الدراسات الميكانيكية في تأثير الهرمونات الجنسية على القرنية والمكونات المرتبطة بها14,15 ؛ ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن الاختلافات القائمة على الجنس في الملتحمة وخلاياها الكأسية. الملتحمة هي غشاء مخاطي يغطي الصلبة والسطح الداخلي للجفن. تتكون ظهارة الملتحمة من خلايا حرشفية طبقية غير كيراتينيةمتعددة الطبقات 16.

من بين الخلايا الحرشفية الطبقية للملتحمة ، توجد خلايا كأسية (CGCs) تتخللها على السطح القمي للظهارة. تتميز هذه الخلايا الكأسية بعدد كبير من الحبيبات الإفرازية الموجودة في القطب القمي17. تقوم CGCs بتصنيع وإفراز الميوسين المكون للهلام MUC5AC لترطيب سطح العين وتليينه أثناء الوميض17. يتم تنظيم إفراز الميوسين بإحكام بواسطة [Ca 2+] ([Ca2+] i) وتنشيط كيناز تنظيم الإشارة خارج الخلية المعتمد على Ras (ERK1 / 2) 18. عدم القدرة على إفراز الميوسين يؤدي إلى جفاف سطح العين وعقابيل التشوهات المرضية. ومع ذلك ، على سطح العين الملتهب ، يؤدي إفراز الميوسين المكثف الذي يحفزه الوسطاء الالتهابيون إلى إدراك الالتصاق والحكة في العين19. هذه الظروف مع إفراز الميوسين المضطرب ستؤدي في النهاية إلى تدهور سطح العين.

منذ فترة طويلة تم التعرف على دور الخلايا الكأسية كمصدر رئيسي للميوسين العيني20 ، ومع ذلك ، فإن الاختلافات القائمة على الجنس في تنظيم الميوسين في كل من الحالات الفسيولوجية والمرضية لا تزال غير مكتشفة. سيكون النظام في المختبر مفيدا لمراقبة وظيفة الخلايا الكأسية دون التأثير الهرموني أو بمستوى متحكم فيه بدقة من الهرمونات الجنسية. على الرغم من أن خط الخلية الطلائية الملتحمة قد طور21 ، لا يوجد خط خلية كأسية مع إفراز الميوسين الوظيفي المتاح. لذلك ، قمنا بتعديل ثقافة CGC البشرية الأولية المتقدمة لدينا لإنشاء طريقة لتحليل الاختلاف القائم على الجنس في المختبر16 ، وتقديمه على النحو التالي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم التبرع بجميع الأنسجة البشرية إلى بنك العيون بموافقة مسبقة مستنيرة وإذن من المتبرع لاستخدامها في البحث العلمي. تمت مراجعة استخدام أنسجة الملتحمة البشرية من قبل لجنة الدراسات البشرية للعين والأذن في ماساتشوستس وتقرر أنها معفاة ولا تفي بتعريف البحث مع البشر.

1. زراعة الخلايا الكأسية البشرية الأولية

  1. من بنك العين ، احصل على أنسجة الملتحمة البشرية16.
  2. تحضير وسط الاستزراع ، وسط زراعة RPMI-1640 المكمل بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، 2 مللي مول جلوتامين ، 2 مللي مول أحماض أمينية غير أساسية (NEAA) ، 2 مللي مول بيروفات الصوديوم ، 100 ميكروغرام / مل بنسلين ستربتومايسين ، و 2 مللي مول 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1- حمض بيبيرازينإيثان سلفونيك (HEPES).
  3. نفذ زراعة الخلايا الأولية كما هو موضح أدناه.
    1. فرم الأنسجة إلى قطع 1 مم3 بمشرط معقم والبذور على أطباق الثقافة في غطاء الاستزراع. قم بزرع أربع قطع في كل بئر من صفيحة ذات 6 آبار ، في 1 مل من وسائط RPMI الكاملة. على الرغم من أن اتجاه قطعة الأنسجة لا يؤثر على نمو الخلايا ، تأكد من أن القطع تلتصق بلوحة الثقافة لضمان النمو باستخدام شفرة المشرط.
    2. ضع قطع الأنسجة في الحاضنة التي تحتوي على 95٪ هواء و 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية. قم بتحديث نفس وسط المزرعة كل يومين حتى تصل الخلايا الكأسية إلى التقاء 70٪ -80٪ في حوالي 14 يوما. قم بإزالة سدادة الأنسجة بعد حوالي 72 ساعة من البذر.
      ملاحظة: تحتوي ظهارة الملتحمة البشرية بشكل أساسي على خلايا حرشفية طبقية وخلايا كأسية. RPMI هو وسيط انتقائي للخلايا الكأسية. نادرا في ثقافة CGC البشرية ، قد تنمو الخلايا الليفية في حوالي اليوم 7. تم وصف طريقة تنقية الثقافة في منشور سابق 22.
    3. التحقق من نقاء ثقافة GC باستخدام المجهر المناعي (IFM) الذي يستهدف السيتوكيراتين (CK)7 و Helix pomatia lectin-1 (HPA-1)22 باتباع طريقة IFM القياسية الموصوفة في19 ؛ انظر النتائج التمثيلية.

2. مرور خلية كأس الملتحمة البشرية والتحضير التجريبي

  1. شطف الخلايا مع PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4) وفصل الخلايا مع التربسين باستخدام 0.05 ٪ التربسين في 1x EDTA. مراقبة الخلايا كل دقيقة تحت المجهر. بمجرد فصل الخلايا عن القاع ، قم بإلغاء تنشيط التربسين باستخدام وسائط RPMI كاملة.
  2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 150 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط زراعة RPMI الكامل وأعد زرعها في أطباق الاستزراع ذات القاع الزجاجي لقياس [Ca2+]i . الحجم الإجمالي للوسط هو 300 ميكرولتر لكل طبق. احتفظ بالوسائط في وسط الجزء الزجاجي من الطبق.
  3. القضاء على الهرمونات في وسط الثقافة: قد يحتوي وسط المزرعة على هرمونات جنسية ، وخاصة FBS. نظرا لأن الفينول الأحمر الموجود في RPMI-1640 له نشاط استروجيني 23,24 ، استبدل وسط RPMI بوسط RPMI الخالي من الفينول الأحمر واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.45 باستخدام شرائط الأس الهيدروجيني بعد تحضير الوسط الكامل. يحافظ HEPES الموجود في الوسط الكامل على درجة الحموضة إلى نطاق صغير نسبيا.

3. مقايسة Fura-2 / acetoxymethyl (AM) لقياس [Ca2+] i

  1. قم بإجراء تحميل Fura-2 / AM كما هو موضح أدناه.
    1. احتضان الخلايا في أطباق زجاجية القاع لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، والجو المحيط ، ومحمية من الضوء باستخدام مخزن بيكربونات كريبس رينجر (KRB ؛ يحتوي على 119 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 4.8 مللي متر KCl ، 1.0 مللي متر CaCl2 ، 1.2 mM MgSO 4 ، و 25 mM NaHCO3) مع 0.5٪ HEPES (الجدول 1) ، بالإضافة إلى 0.5٪ BSA ، 0.5 ميكرومتر fura-2 / AM، 8 ميكرومتر حمض بلورونيك F127 ، و 250 ميكرومتر سلفينبيرازوني.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.45 باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني قبل الاستخدام. بعد التحميل باستخدام fura-2 / AM ، اغسل الخلايا باستخدام KRB الذي يحتوي على 250 ميكرومتر سلفينبيرازون مباشرة قبل قياس [Ca2+] i .
  2. قم بإجراء قياس [Ca2+]i كما هو موضح أدناه.
    1. ضع الأطباق التي تحتوي على الخلايا المحملة ب fura-2 تحت المجهر ، وحدد موقع حقل تمثيلي يحتوي على ما بين 20 خلية و 50 خلية بتكبير 200x ، واستخدم وظيفة Freehand لرسم مخطط تفصيلي حول كل خلية للإشارة إلى البرنامج ما هو مضان الخلفية وما هو ليس مضان.
    2. انتظر حتى يقوم البرنامج تلقائيا بطرح مضان الخلفية من القياس وانقر فوق الزر "بدء التجربة ".
    3. بعد ذلك ، انتظر ما بين 8 ثوان و 15 ثانية لتحديد مستويات الكالسيوم الأساسية في الخلايا قبل أن يتم امتصاصها بعناية في ناهض الاهتمام. استمر في القياس لمدة 120 ثانية على الأقل بعد إضافة الناهض أو حتى تعود مستويات الكالسيوم إلى خط الأساس.
  3. قم بإجراء تحليل البيانات كما هو موضح أدناه.
    1. استخدم التغيير في الذروة [Ca2+]i لتمثيل تصرفات المحفزات. احسب متوسط مستوى الكالسيوم الأساسي في كل خلية من أول 8-15 ثانية من القياسات. إذا كان هذا الرقم يساوي أو يزيد عن 500 نانومتر ، فقم بإزالة تلك الخلية من مجموعة البيانات لأنها تخضع لموت الخلايا المبرمج أو النخر.
    2. بمجرد حساب المستوى الأساسي لكل خلية ، اطرح هذا المبلغ من الحد الأقصى المقاس [Ca2+] i لنفس الخلية. متوسط التغير في الذروة [Ca2+]I لجميع الخلايا في طبق معين.
    3. لضمان الاتساق ، سجل استجابات كل حافز في نسختين ، واحسب متوسط قيمة التغييرات في الذروة [Ca2+] i التي تم الحصول عليها من التكرارات كنقطة بيانات واحدة من العينة البشرية الفردية. مقارنة البيانات من مجموعات مختلفة باستخدام طريقة تحليل البيانات المناسبة بناء على تصميم الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تنمو CGCs البشرية في الثقافة الأولية إلى التقاء 80٪ في حوالي 14 يوما. تم تأكيد نوع الخلية من خلال تلطيخ التألق المناعي بالأجسام المضادة لعلامات الخلايا الكأسية CK7 و HPA-125 (الشكل 1). على الرغم من أن إزالة FBS من الوسط يمكن أن يقضي على الهرمونات الجنسية ، إلا أن نقص FBS يمكن...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يساعد التحقيق في الاختلافات القائمة على الجنس في أنسجة العين على فهم عمليات الأمراض ، وخاصة جفاف العين والتهاب الملتحمة التحسسي ، والتي تؤثر بشكل غير متناسب على جنس واحد4،5،6. على الرغم من أنه يمكن استخدام النماذج الحيوانية لهذه الدراسات ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يتم تمويل العمل من قبل منحة المعهد الوطني للعيون EY019470 (D.A.D).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% trypsin with 1x EDTAGibco (Grand Island, NY)25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acidFisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)BP310-500
Advanced RPMI mediaGibco (Grand Island, NY)12633020
carbacholCayman Chemical (Ann Arbor, MI)144.86
Fetal Bovin SerumR&D (Minneapolis, MN)S11150H
Fura-2- acetoxymethyl ester Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)F1221
Human conjunctival tissueEversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)N/A
inorganic salt for KRB bufferSigma-Aldrich (St. Louis, MO)Any brand will work
L-glutamine Lonza Group (Basel, Switzerland)17-605F
non-essential amino acidsGibco (Grand Island, NY)11140-050
penicillin/streptomycinGibco (Grand Island, NY)15140-122
phenol red-free RPMI media Gibco (Grand Island, NY)11835055
Pluronic acid F127MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)P2443-250G
RPMI-1640 culture mediumGibco (Grand Island, NY)21875034
scalpelThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)12460451Any sterile surgical scalpel can work
sodium pyruvateGibco (Grand Island, NY)11360-070
sulfinpyrazoneMilliporeSigma (Burlington, MA, USA)S9509-5G

References

  1. Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
  2. Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
  3. Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
  4. Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
  5. Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
  6. Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
  7. Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3(2020).
  8. Yang, J. -H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
  9. Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
  10. Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
  11. Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
  12. Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
  13. Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
  14. Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
  15. Suzuki, T., et al. Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
  16. Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
  17. Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
  18. Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
  19. Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
  20. Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
  21. García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220(2022).
  22. Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
  23. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
  24. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
  25. García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
  26. Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
  27. Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
  28. Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
  29. Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
  30. Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RPMI FBS BSA Ca2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved