JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الحالي استخراج اللوميكان من الغشاء الأمنيوسي (AM) وظروف تخزينه كمستخلص AM (AME) عند -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية ودرجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 6 و 12 و 20 و 32 يوما لتحديد بروتيناته وتركيز اللوميكان.

Abstract

Lumican هو بروتيوغليكان صغير غني بالليوسين في الغشاء الأمنيوسي البشري (AM) الذي يعزز ظهارة القرنية وتنظيم ألياف الكولاجين ، والحفاظ على شفافية القرنية. في العمل الحالي ، تم اقتراح طريقة لاستخراج البروتين من AM للحصول على lumican. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقييم استقرار lumican في مستخلص AM (AME) المخزن في درجات حرارة وفترات زمنية مختلفة. تم إذابة 100 ملغ من AM وإزالة الظهارة الميكانيكية. تم تجميد AM المنزوع الظهارة وسحقه حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم ، والذي تم إذابته ب 2.5 مل من المحلول الملحي مع مثبطات الأنزيم البروتيني والطرد المركزي لاستخراج البروتين. تم جمع المادة الطافية وتخزينها في -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية ودرجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 6 و 12 و 20 و 32 يوما. بعد ذلك ، تم تحديد كمية lumican في كل AME. تسمح هذه التقنية ببروتوكول يمكن الوصول إليه واكتسابه لاستخراج اللوميكان من AM. تأثر تركيز اللوميكان بوقت التخزين وظروف درجة الحرارة. كان Lumican في AME لمدة 12 يوما مخزنا عند -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية أعلى بكثير من AME الأخرى. يمكن أن يكون استخراج اللوميكان هذا مفيدا لتطوير العلاجات والحلول الصيدلانية. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد استخدامات AME lumican في عملية إعادة الاندمال وشفاء الجروح.

Introduction

واحدة من العلاجات الأكثر استخداما لأمراض القرنية هو زرع الغشاء الأمنيوسي. ومع ذلك ، في السنوات الأخيرة ، ظهرت مقترحات جديدة لاستخدام مكونات مختلفة من الأنسجة الأمنيوسية كعلاجات بديلة ومساعدة. من بين المكونات الأكثر دراسة من AM هي تلك التي تم الحصول عليها من استخراج AM (AME)1،2،3،4،5،6،7. يحتوي AM على العديد من العوامل القابلة للذوبان مثل البروتينات المضادة لتولد الأوعية ، والإنترلوكينات (IL) ، ومثبطات الأنسجة للبروتينات المعدنية (TIMPs) ، والبروتينات المضادة للالتهابات بوساطة TSG-6 التي تمنع مصائد العدلات خارج الخلية ، وعوامل النمو: عامل نمو البشرة (EGF) ، عامل النمو المحول (TGF) (ألفا وبيتا) ، عامل نمو الخلايا الكيراتينية (KGF) ، عامل نمو خلايا الكبد (HGF) ، ولوميكان ، الذي يحافظ على شفافية القرنية من خلال تنظيم تكوين ألياف الكولاجين1 ، 2،3،4،5،6،7،8،9.

Lumican هو بروتيوغليكان صغير غني بالليوسين (SLRP) ، وهو أحد المكونات الرئيسية خارج الخلية للكولاجيناز الخلالي في مصفوفة سدى القرنية ، وهو مسؤول عن تنظيم ألياف الكولاجين والحفاظ على شفافية القرنية4،10،11. البروتيوغليكان هي جزيئات في المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وهي الجزيئات الرئيسية في تنفيذ إشارات الخلية والحفاظ على التوازن داخل الخلايا12. تم الإبلاغ عن بروتينات ECM لدفع العمليات الخلوية للانتشار والتمايز والهجرة أثناء التئام الجروح11.

تشير الأدلة إلى احتمال مشاركة اللوميكان في عملية إعادة الظهارة القرنية. أظهر Saika et al. ، في دراسة ، أنه بعد إصابة القرنية ، يمكن اكتشاف lumican في خلايا القرنية القرنية بين أول 8 ساعات وحتى 3 أيام بعد الإصابة. تقديم أعلى تركيز من lumican في اليوم الثاني والثالث ، وهذا البروتيوغليكان لا يمكن اكتشافه في اليوم السابع13. تشير هذه البيانات إلى مشاركة اللوميكان في تنشيط عملية إعادة الاندمال الظهاري للقرنية. من ناحية أخرى ، في دراسة أخرى ، أفيد أن عدم وجود lumican يؤخر إعادة الاندمال الظهاري. ومن المثير للاهتمام ، أن إضافة Lumican يمكن أن يسرع عملية إعادة الاندمال الظهاري4،11،13. وبالمثل ، أفادت دراسة حديثة أن اللوميكان يمكن أن يعدل الوظائف الالتهابية للخلايا الليفية القرنية14 ، مما يشير إلى دور اللوميكان كمغير للاستجابة الالتهابية والمضادة للتليف وإعادة الاندمال. وبالمثل ، يمكن لوميكان تعديل استجابة القرنية من خلال التفاعل مع جزيئات الإشارة مثل Fas-FasL. أيضا ، أظهر غياب lumican في نموذج Lum-/- mouse بالضربة القاضية أن عدم وجود إشارات lumican يمنع إصلاح القرنية الكافي15.

في المقام الأول ، تهدف هذه الطريقة إلى إظهار طريقة مجدية وسهلة لاستخراج اللوميكان من AM. باستخدام هذه الطريقة المفيدة لاستخراج اللوميكان ، من الممكن الحصول على تركيزات مماثلة من البروتينات ، مما يقلل من وقت المعالجة ويجعلها أكثر ملاءمة للمحققين مقارنة بالدراسات السابقة16. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام AME lumican كمساعد لإصلاح القرنية وعمليات إعادة الاندمال الظهاري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (رقم المشروع. CEI-2020/06/04). تم الحصول على AM من Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana amnion bank (من أشخاص مجهولي الهوية) ، والذي تم إعداده كما وصفه شافيز غارسيا وآخرون 17.

1. إعداد مستخلص الغشاء الأمنيوسي

  1. الحصول على 100 ملغ من AM من بنك السلى.
    ملاحظة: وفقا لتقرير سابق ، يفرز 50 مجم من AM ما مجموعه 10 نانوغرام / مل من اللوميكان14. للحصول على تركيز أعلى من lumican ، استخدم 100 ملغ من AM ، أي ما يعادل مساحة إجمالية قدرها 32 سم2.
  2. إذا تم تجميد AM ، قم بإذابته في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: نفذ الإجراءات التالية تحت غطاء التدفق الصفحي من الفئة II B.
  3. اغسل AM في طبق بتري مع 10 مل من محلول الملح المتوازن المعقم (BSS ، انظر جدول المواد) لمدة 2 دقيقة.
    1. صب BSS في دورق.
    2. كرر الخطوة 3 وتأكد بصريا من أن وسيط الجلسرين غير موجود في طبق بتري BSS.
      ملاحظة: كرر الخطوة 3. حسب الحاجة حتى لا يكون وسط الجلسرين موجودا في طبق بتري BSS.
  4. احتضان AM مع 10 مل من dispase II (1.7 وحدة دولية / مل ، انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: Dispase II هو بروتياز محايد مع نشاط لطيف على الخلايا الظهارية. يفصل هذا الإنزيم بشكل فعال البشرة السليمة عن الأدمة ويعزل الأوراق الظهارية السليمة18.
  5. بعد الحضانة dispase ، قم بإجراء إزالة الظهارة الميكانيكية14 مع شرطي مطاطي (انظر جدول المواد). تأكيد إزالة الظهارة عن طريق التصور المجهري.
    ملاحظة: يتم تأكيد عملية إزالة الظهارة في مجهر مقلوب باستخدام أهداف 4x و 20x. تصور الأنسجة لاستبعاد وجود أي طبقة خلوية.
  6. اغسل AM في طبق بتري مع 10 مل من BSS لمدة 2 دقيقة. صب BSS في دورق.
  7. ضع AM (dAM) غير الظهاري في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل. اغمر dAM في النيتروجين السائل لمدة 40 دقيقة.
  8. قم بتأريض dAM المجمد يدويا لمدة 2-3 دقائق في ملاط مبرد مسبقا عند -85 درجة مئوية حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم.
  9. في الهاون ، قم بإذابة مسحوق dAM ب 2.5 مل من محلول مثبطات الأنزيم البروتيني (BSS مع مثبطات الأنزيم البروتيني).
    ملاحظة: يتكون كل قرص من مثبطات الأنزيم البروتيني من الخليط التالي من الإنزيمات: مستخلص البنكرياس (0.02 مجم / مل) ، ثيرموليزين (ميتالوبروتيز) (0.0005 مجم / مل) ، كيموتريبسين (0.002 مجم / مل) ، تربسين (0.02 مجم / مل) ، وغراء (0.33 مجم / مل) (انظر جدول المواد).
  10. جمع الخليط مع micropipette ، وتنظيف جدران هاون بمساعدة سكين مشرط. ضع الخليط في أنبوب سعة 5 مل.
  11. تخلط جيدا مع دوامة لمدة 30 ثانية.
  12. تجانس خليط الأنسجة عن طريق الطرد المركزي عند 34 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية والطرد المركزي على الفور عند 3360 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  13. الطافت الذي تم جمعه هو AME (الشكل 1). قم بتخزين 0.7 مل من كل AME في أنابيب طرد مركزي دقيقة مختلفة سعة 2 مل لمدة 6 و 12 و 20 و 33 يوما في ظروف درجات حرارة مختلفة تبلغ -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية ودرجة حرارة الغرفة (RT).

figure-protocol-3140
الشكل 1: عملية تحضير AME وقياس تركيز اللوميكان . تم تحضين 100 ملغ من AM مع dispase II عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وإزالة الظهارة ميكانيكيا. تم غسل AM غير الظهاري وغمره في النيتروجين السائل لمدة 40 دقيقة ، ثم سحقه حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم ، والذي تم إذابته ب 2.5 مل من محلول ملحي مع مثبطات الأنزيم البروتيني والطرد المركزي. تم جمع المادة الطافية وتخزينها في -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية و RT لمدة 6 و 12 و 20 و 32 يوما حتى يتم تحديد كمية البروتين واللوميكان الكلي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. تحديد كمية البروتين AME

ملاحظة: يجب إجراء القياس الكمي للبروتين الكلي في AME مباشرة بعد الالتزام. حدد كمية البروتينات باستخدام مقايسة بروتين لوري واتبع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). يوصى بفحص جميع المعايير والعينات في ثلاث نسخ.

  1. ماصة 40 ميكرولتر من كل عينة من AME في صفيحة مجهرية 96 بئر.
    1. قم بإعداد منحنى قياسي في نفس الصفيحة الدقيقة باستخدام معيار ألبومين مصل البقر (BSA) لتركيز BSA النهائي من 0-1500 ميكروغرام / مل (0 ، 1 ، 5 ، 25 ، 125 ، 250 ، 500 ، 750 ، 1000 و 1500 ميكروغرام / مل).
  2. ماصة 200 ميكرولتر من كاشف لوري المعدل لكل بئر. امزجه على الفور على خلاط لوحة لمدة 30 ثانية.
  3. قم بتغطية الصفيحة الدقيقة بورق الألمنيوم واحتضانها في RT لمدة 10 دقائق.
  4. ماصة 20 ميكرولتر من كاشف 1x Folin-Ciocalteu لكل بئر. امزجه على الفور على خلاط لوحة لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: لتحضير كاشف Folin-Ciocalteu 1x ، قم بتخفيف كاشف 2x (2N) 1: 1 بماء فائق النقاء. تحضير 1x كاشف Folin-Ciocalteu في نفس يوم الاستخدام لأن الكاشف المخفف غير مستقر.
  5. قم بتغطية الصفيحة الدقيقة من الضوء بورق الألمنيوم واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
  6. قم بقياس امتصاص العينات عند 660 نانومتر في مطياف لوحة ELISA (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يمكن قياس اللون بأطوال موجية تتراوح بين 650 نانومتر و 750 نانومتر.
  7. متوسط قيمة الامتصاص 660 نانومتر للعينات الفارغة القياسية وطرحها من قيم 660 نانومتر الأخرى للعينات القياسية وغير المعروفة.
    1. قم بقياس الامتصاص باستخدام مطياف لوحة ELISA في وضع نقطة النهاية مع اهتزاز منخفض لمدة 10 ثوان.
  8. استخدم المنحنى القياسي لتحديد تركيز البروتين لكل عينة مجهولة.
  9. لحساب البروتين ، حدد التركيز من الرسم البياني للانحدار الخطي باستخدام قيم الامتصاص على المحور Y مقابل التركيزات في mg / mL على المحور X لكل منحنى BSA قياسي.
    1. الحصول على معادلة الانحدار الخطي وقيمة r لحساب تركيز البروتين.
      ملاحظة: يتم التعبير عن النتائج كقيم تركيز نسبي طبيعية للبروتين الكلي بالنسبة إلى ملغ من AM (ميكروغرام / مل بروتين / ملغ من أنسجة AM).

3. القياس الكمي للوميكان في AME

ملاحظة: يجب قياس تركيز اللوميكان في AME المخزن في ظروف تخزين وفترات زمنية مختلفة. حدد لوميكان باستخدام ساندويتش ELISA واتبع تعليمات الشركة المصنعة. يوصى بفحص جميع المعايير والعينات من نسختين.

  1. قم بتخفيف الجسم المضاد لالتقاط اللوميكان البشري (انظر جدول المواد) إلى التركيز المستخدم في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    ملاحظة: تحتوي قارورة الأجسام المضادة الملتقطة على 120 ميكروغرام من الأجسام المضادة. بعد إعادة التكوين باستخدام 0.5 مل من PBS ، قم بتخفيف الجسم المضاد للالتقاط في محلول عملي يبلغ 2 ميكروغرام / مل.
    1. ماصة على الفور 100 ميكرولتر لكل بئر من الجسم المضاد المخفف للالتقاط إلى صفيحة مجهرية 96 بئرا. أرفق اللوحة واحتضنها طوال الليل في RT.
  2. نضح كل بئر وغسله عن طريق سحب 300 ميكرولتر من محلول الغسيل: 0.05٪ بولي أوكسي إيثيلين سوربيتان مونولورات 20 في PBS ، درجة الحموضة 7.2-7.4 (انظر جدول المواد) باستخدام ماصة متعددة القنوات. كرر ثلاث مرات.
    ملاحظة: بعد آخر غسلة ، قم بإزالة أي مخزن مؤقت متبقي للغسيل عن طريق وضع الطبق واضغط برفق على المناشف الورقية.
  3. لوحات كتلة عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من مخفف الكاشف: 1 ٪ BSA في PBS ، درجة الحموضة 7.2-7.4 ، 0.2 ميكرومتر المصفاة (انظر جدول المواد) لكل بئر. احتضان في RT لمدة 1 ساعة.
  4. كرر الخطوة 2.
  5. قم بإعداد منحنى قياسي في صفيحة دقيقة ذات 96 بئرا باستخدام تخفيفات تسلسلية ثنائية من 0-8000 بيكوغرام / مل للتركيزات النهائية من 125 و 250 و 500 و 1000 و 2000 و 4000 و 8000 بيكوغرام / مل. تحتوي مجموعة ELISA lumican على معيار lumican المؤتلف من 75 نانوغرام (انظر جدول المواد).
  6. أضف 100 ميكرولتر من العينات والمنحنى القياسي في الصفيحة الدقيقة 96 المطلية بالأجسام المضادة بالتقاط.
  7. قم بتغطية الصفيحة الدقيقة واحتضانها لمدة 2 ساعة عند RT مع تحريك منخفض في هزاز مضغوط يحافظ على السرعة بين 2-3 دورة في الدقيقة.
  8. كرر الخطوة 2.
  9. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف عن البيوتينيل (انظر جدول المواد) إلى كل بئر. غطيها من الضوء واحتضنها لمدة 2 ساعة عند RT مع تحريض منخفض في هزاز مضغوط يحافظ على السرعة بين 2-3 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: تحتوي قارورة الجسم المضاد للكشف عن البيوتينيل على 24 ميكروغرام من الجسم المضاد. بعد إعادة التكوين باستخدام 1.0 مل من مخفف الكاشف ، قم بتخفيف الجسم المضاد للكشف عن البيوتينيل في محلول عمل يبلغ 400 نانوغرام / مل.
  10. كرر الخطوة 2.
  11. أضف 100 ميكرولتر من التخفيف العامل لبيروكسيديز الستربتافيدين - الفجل (HRP ، انظر جدول المواد) إلى كل بئر. غطي الصفيحة الدقيقة من الضوء واحتضنها لمدة 20 دقيقة في RT.
    ملاحظة: كان الستربتافيدين التفاعلي HRP مركزا بمقدار 40 ضعفا. تم إجراء حل العمل 1x من streptavidin- HRP مع مخفف الكاشف.
    ملاحظة: تجنب وضع اللوحة في الضوء المباشر.
  12. كرر الخطوة 2.
  13. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من محلول رباعي ميثيل بنزيدين الركيزة (TMB ، انظر جدول المواد) إلى كل بئر.
    ملاحظة: قم بإعداد محلول TMB بحجم متساو من محلول بيروكسيد الهيدروجين المستقر 30٪ المقدم في المجموعة.
    ملاحظة: قم بإعداد المحلول مباشرة قبل الاستخدام واحتفظ به في درجة حرارة الغرفة.
  14. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT في مكان مظلم.
    ملاحظة: تجنب وضع اللوحة في الضوء المباشر. لا تستنشق محلول TMB حيث لا حاجة إلى مزيد من الغسيل.
  15. أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف 1N H2SO4 لإيقاف التفاعل اللوني. اضغط برفق على اللوحة لضمان الخلط الشامل.
  16. حدد على الفور امتصاص كل بئر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة مضبوط على 450 نانومتر في مطياف لوحة ELISA.
  17. قم بقياس الامتصاص باستخدام مطياف لوحة ELISA في وضع نقطة النهاية مع اهتزاز منخفض لمدة 10 ثوان.
  18. متوسط قيمة الامتصاص 450 نانومتر للعينات الفارغة القياسية وطرحها من قيم 450 نانومتر الأخرى للعينات القياسية وغير المعروفة.
  19. استخدم المنحنى القياسي لتحديد تركيز اللوميكان لكل عينة مجهولة.
  20. لحساب تركيز اللوميكان ، قم بعمل رسم بياني للانحدار الخطي باستخدام قيم الامتصاص على المحور Y مقابل التركيزات في pg / mL على المحور X لكل منحنى لوميكان قياسي.
    1. احصل على معادلة الانحدار الخطي وقيمة r لحساب تركيز اللوميكان.
      ملاحظة: تم تطبيع تركيز اللوميكان فيما يتعلق بملغ من الأنسجة المستخرجة. يتم التعبير عن النتائج كقيم تركيز نسبي طبيعية من lumican إلى mg AM (ng / mL lumican / mg AM الأنسجة).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يتم الإبلاغ عن النتائج كقيمة متوسطة ± الانحراف المعياري (SD). تم إجراء اختبارات t للطالب وتحليل التباين (ANOVA). اعتبرت قيم P < 0.05 ذات دلالة إحصائية. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج إحصائي (انظر جدول المواد).

تأثرت كمية البروتين الإجمالية في AME بالوقت و?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه الدراسة ، تم تحليل وجود lumican في AME وعلاقته المباشرة مع ثباته في ظل ظروف التخزين المختلفة. ومن المثير للاهتمام ، عندما تم تحديد تركيز البروتين الكلي في AME ، زاد تركيز البروتين بعد التخزين. تشير الدلائل إلى ثلاث آليات يمكن أن تغير تركيز البروتين في التخزين المجمد: التمسخ البارد ، والترك?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

تم تمويل الدراسة من قبل برنامج دعم مشاريع البحث والابتكار التكنولوجي التابع للجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك (رقم المنحة. PAPIIT IN203821) ، ووزارة التعليم والعلوم والتكنولوجيا والابتكار (رقم المنحة. SECTEI 250/2019).

Acknowledgements

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 N H2SO4 stop solutionR&D SystemsDY994
100 μL micropipetteEppendorf
1000 μL micropipetteEppendorf
15 mm Petri dishSymlaboratorios
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm)BD Becton Dickinson 305211
2 mL microcentrifuge tubeEppendorfZ606340
20 mL plastic syringe BD Becton Dickinson 302562
20 μL micropipetteEppendorf
20-200 μL micropipetteEppendorf
5 mL microcentrifuge tubeEppendorf30119401
96-well microplateSARSTEDT821581
Aluminum foilN/AN/A
Amniotic membraneInstituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank100 mg
Balanced salt solutionBausch + LombBSS-403802
BeakerN/AN/A
BioRender BioRenderfigures design 
Compact RockerBioRad970822DDMod. 5202SD-BIO
complete, EDTA-free, Protease inhibitor
cocktail tablets		Roche11 873 580 001Protease Inhibitor
Daiggner vortex Genie 2A.Daigger & Co. , INC22220A
Dispase IIGibco17105-041
ELISA plate spectrometerThermo Labsystems 35401106Multiscan
Freezer
GraphPad Prism GraphPad Software, Incversion 9statistical analysis and graphic program 
Human lumican DuoSet ELISA kitR&D SystemsDY2846-05includes human Lumican capture antibody
Incubator Forma Scientific 3326 S/N 36481-7002
Inverted light MicroscopeOlympus 6A13921to confirm de-epithelialization  Mod.CK2
Laminar flow hoodForma Scientific 14753-567Mod.1184
Liquid nitrogenN/AN/A
MortarN/AN/A
Multi-channel pipettorEppendorf
Nitrogen TankThermo ScientificMod. Biocan 20
Paper towelsN/AN/A
Phosphate-buffered salineR&D SystemsDY006
Pierce Modified Lowry Protein Assay KitThermo Scientific23240
Plate sealersR&D SystemsDY992
Reagent diluentR&D SystemsDY9951% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered
Refrigerated centrifugecenturion scientific Ltd 15877Mod. K2015R
Rubber policeman cell scraperNEST710001for mechanical de-epithelialization
Scalpel knifeBraunBB521No. 10 or 21
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated R&D Systemspart 893975
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solutionR&D SystemsDY999
Toothed tweezersInvent Germany6binox 
Ultrapure waterPISA
Wash bufferR&D SystemsWA1260.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4

References

  1. Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
  2. Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro. Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).
  3. Ruiz-Cañada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).
  4. Yeh, L., et al. Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479(2005).
  5. Navas, A., et al. Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).
  6. Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6. Scientific Reports. 7, 12426(2017).
  7. Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).
  8. Koob, T., et al. Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing. International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).
  9. Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing. Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).
  10. Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).
  11. Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. Lumican as a multivalent effector in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).
  12. Theocharis, A., et al. Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer. FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).
  13. Saika, S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).
  14. Domínguez-López, A., et al. Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican. Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).
  15. Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88(2005).
  16. Mahbod, M., et al. Amniotic membrane extract preparation: What is the best method. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).
  17. Chávez-García, C., et al. Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).
  18. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
  19. Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).
  20. McClain, A. K., McCarrel, T. M. The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months. BMC Veterinary Research. 15 (1), 292(2019).
  21. Tamhane, A., et al. Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).
  22. Shtein, R., et al. Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease. Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).
  23. Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model. Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).
  24. Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers. Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).
  25. Chen, H., et al. Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis. Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).
  26. Guo, Q., et al. A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model. Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).
  27. Sabater, A., Perez, V. Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).
  28. Ahmad, T., et al. Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin. Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).
  29. Mullegama, S. V., et al. Nucleic acid extraction from human biological samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  30. Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

188

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved