ارتفاع الحرارة الناتج عن الموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة الموجهة بالرنين المغناطيسي: طريقة علاج مجدية في نموذج الساركوما العضلية المخططة للفئران

Summary

يظهر هنا بروتوكول لاستخدام ارتفاع الحرارة المتحكم فيه ، الناتج عن الموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة الموجهة بالرنين المغناطيسي ، لتحفيز إطلاق الدواء من الجسيمات الشحمية الحساسة للحرارة في نموذج فأر الساركوما العضلية المخططة.

Abstract

الموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة الموجهة بالرنين المغناطيسي (MRgHIFU) هي طريقة راسخة لإنتاج ارتفاع الحرارة الموضعي. نظرا للتصوير في الوقت الفعلي وتعديل الطاقة الصوتية ، تتيح هذه الطريقة التحكم الدقيق في درجة الحرارة داخل منطقة محددة. يتم استكشاف العديد من التطبيقات الحرارية باستخدام هذه التكنولوجيا غير الغازية وغير المؤينة ، مثل توليد ارتفاع الحرارة ، لإطلاق الأدوية من ناقلات الجسيمات الشحمية الحساسة للحرارة. يمكن أن تشمل هذه الأدوية العلاجات الكيميائية مثل دوكسوروبيسين ، والتي يكون إطلاقها المستهدف مرغوبا فيه بسبب الآثار الجانبية الجهازية التي تحد من الجرعة ، وهي السمية القلبية. دوكسوروبيسين هو الدعامة الأساسية لعلاج مجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة ويستخدم عادة في الساركوما العضلية المخططة المنتكسة أو المتكررة (RMS). RMS هو الورم الرخو خارج الجمجمة في الأنسجة الصلبة الأكثر شيوعا لدى الأطفال والشباب. على الرغم من العلاج العدواني متعدد الوسائط ، ظلت معدلات البقاء على قيد الحياة RMS كما هي على مدى السنوات ال 30 الماضية. لاستكشاف حل لتلبية هذه الحاجة غير الملباة ، تم تطوير بروتوكول تجريبي لتقييم إطلاق دوكسوروبيسين الشحمي الحساس للحرارة (TLD) في نموذج فأر RMS متوافق مع المناعة باستخدام MRgHIFU كمصدر لارتفاع الحرارة لإطلاق الدواء.

Introduction

الساركوما العضلية المخططة (RMS) هي ورم عضلي هيكلي يحدث بشكل شائع عند الأطفال والشباب¹. غالبا ما يتم علاج المرض الموضعي بالعلاج متعدد الوسائط ، بما في ذلك العلاج الكيميائي والإشعاع المؤين والجراحة. استخدام أنظمة العلاج الكيميائي متعدد الأدوية أكثر انتشارا في مرضى الأطفال ، مع نتائج محسنة مقارنة بنظرائهم البالغين² ؛ ومع ذلك ، على الرغم من الجهود البحثية المستمرة ، لا يزال معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات عند حوالي 30 ٪ في الشكل الأكثر عدوانية من المرض ^3,4. معيار الرعاية الكيميائي هو نظام متعدد الأدوية يتضمن فينكريستين وسيكلوفوسفاميد وأكتينومايسين د. في حالات المرض الانتكاسي أو المتكرر ، يتم استخدام العلاجات الكيميائية البديلة ، بما في ذلك دوكسوروبيسين القياسي (الحر) (FD) وإيفوسفاميد¹. في حين أن كل هذه العلاجات الكيميائية لها سمية جهازية ، فإن السمية القلبية للدوكسوروبيسين تفرض قيودا على الجرعة مدى الحياة ^5-7. لزيادة كمية الدواء الذي يتم تسليمه إلى الورم وتقليل السمية الجهازية ، تم تطوير تركيبات بديلة ، بما في ذلك تغليف الدهون. يمكن أن تكون هذه دوكسوروبيسين غير حساس للحرارة ، والذي تمت الموافقة عليه لعلاج سرطان الثدي وسرطان الخلايا الكبدية ، أو دوكسوروبيسين حساس للحرارة ، والذي تجري التجارب السريرية له⁸،⁹،^10،11،^12،13. تم تقييم الطرق البديلة لتوصيل الأدوية المغلفة بالجسيمات الشحمية مثل الجسيمات الشحمية متعددة الحويصلات والجسيمات الشحمية المستهدفة لليجند وتظهر نتائج واعدة لعلاج الأورام⁹. في هذه الدراسة ، فإن إضافة الحرارة لها تأثيرات متعددة العوامل ، بما في ذلك إطلاق الدواء¹⁴. إن الجمع بين ارتفاع الحرارة (HT) الناتج عن الموجات فوق الصوتية المركزة عالية الكثافة الموجهة بالرنين المغناطيسي (MRgHIFU) ودوكسوروبيسين الشحمي الحساس للحرارة (TLD) هو نهج علاجي جديد متعدد الوسائط لاستخدام هذا الدواء السام والفعال لعلاج RMS ، مع تقليل السمية التي تحد من الجرعة وربما زيادة الاستجابة المناعية للورم.

يطلق دوكسوروبيسين بسرعة من TLD عند درجات حرارة >39 درجة مئوية ، أعلى بكثير من متوسط درجة حرارة جسم الإنسان البالغ 37 درجة مئوية ولكنه ليس مرتفعا بما يكفي للتسبب في تلف الأنسجة أو الاجتثاث ؛ يبدأ هذا في الحدوث عند 43 درجة مئوية ، ولكنه يحدث بسرعة أكبر مع اقتراب درجات الحرارة من 60 درجة مئوية¹⁵. تم استخدام طرق مختلفة لتوليد HT في الجسم الحي ، بما في ذلك الليزر وأفران الميكروويف والاجتثاث بالترددات الراديوية والموجات فوق الصوتية المركزة ، والعديد منها طرق تسخين غازية¹⁶. MRgHIFU هي طريقة تسخين غير جراحية وغير مؤينة تسهل إعدادات درجة الحرارة الدقيقة داخل الأنسجة المستهدفة في الموقع. يوفر التصوير بالرنين المغناطيسي (MR) بشكل حاسم التصوير في الوقت الفعلي ، حيث يمكن استخدام برامج الكمبيوتر ، لحساب قياس الحرارة للأنسجة طوال فترة العلاج. بعد ذلك ، يمكن استخدام هذه البيانات للتحكم في العلاج بالموجات فوق الصوتية في الوقت الفعلي للوصول إلى نقطة ضبط درجة الحرارة^{المطلوبة 17} والحفاظ عليها. تم اختبار MRgHIFU في أنواع مختلفة من الأنسجة ويمكن استخدامه لمجموعة واسعة من علاجات درجة الحرارة ، من HT الخفيف إلى الاستئصال ، وكذلك سريريا لعلاج النقائل العظمية المؤلمة^{بنجاح 18}. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن HT يسبب السمية الخلوية للورم ، ويعدل تعبير البروتين ، ويغير الاستجابة المناعية في البيئة المكروية للورم¹⁹،^20،21،22. جمعت إحدى الدراسات بين HT الخفيف و TLD ، يليه الاستئصال باستخدام MRgHIFU ، في نموذج الفئران R1^{التآزري 23} ، مما أدى إلى نخر في قلب الورم وتوصيل الدواء إلى الأطراف. تقليديا ، تم استخدام العلاج الإشعاعي كعلاج مساعد لتلف الخلايا السرطانية وتقليل تكرار المرض الموضعي. ومع ذلك ، فإن استخدامه محدود بسبب الجرعات مدى الحياة والضرر خارج الهدف¹. وبالتالي ، فإن HT فريد من نوعه من حيث أنه يمكن أن يسبب بعض التأثيرات نفسها دون نفس السمية أو القيود.

تشمل النماذج الحيوانية قبل السريرية ل RMS نماذج الكفاءة المناعية الاصطناعية والطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX) في المضيفين الذين يعانون من نقص المناعة. في حين أن النماذج التي تعاني من نقص المناعة تسمح بنمو الأورام البشرية ، إلا أنها تفتقر إلى البيئة المكروية المناسبة للورم ومحدودة في قدرتها على دراسة الاستجابة المناعية²⁴. تعد الطفرة المنشطة ل FGFR4 علامة واعدة لسوء التشخيص وهدفا علاجيا محتملا في RMS ^1,25 للبالغين والأطفال. في نماذج RMS syngeneic التي تم تطويرها في مختبر Gladdy ، تكون الأورام قادرة على النمو في مضيف مناعي ، والذي يطور استجابات مناعية فطرية وتكيفية للورم²⁶. نظرا لأن HT يؤثر على الاستجابة المناعية ، فإن ملاحظة التغيير في الاستجابة المناعية للفئران هي ميزة قيمة لنموذج الورم هذا. لاختبار كل من استجابة الورم ل TLD مقارنة ب FD ، بالإضافة إلى التغيير في الاستجابة المناعية للورم لكل من العلاج الكيميائي و HT ، تم تطوير بروتوكول واستخدامه لعلاج أورام الفئران الاصطناعية RMS في الجسم الحي باستخدام MRgHIFU و TLD ، وهو محور هذه الدراسة.

Protocol

تم إجراء البحث وفقا للجان رعاية الحيوان مع بروتوكولات استخدام الحيوانات المعتمدة تحت إشراف طبيب بيطري مشرف في مرافق البحوث الحيوانية لمركز الظواهر (TCP) ومركز الموارد الحيوانية التابع لشبكة الصحة الجامعية (UHN). تم تنفيذ جميع الإجراءات ، باستثناء MRgHIFU ، التي تشمل الحيوانات في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) لتقليل تعرض الحيوانات للهواء الخارجي أو العدوى الحساسة.

1. تربية الفأر

ملاحظة: تم تضمين ما مجموعه 65 فأرا (السلالة B6.129S2-Trp53tm1Tyj / J) في الدراسة التجريبية (ذكر: ن = 23 ؛ أنثى: ن = 42). تم استخدام كل من الفئران الذكور والإناث في عمر 7-9 أسابيع. تم فطام صغارهم وتصنيفهم الجيني ، وتم استخدام الفئران غير المتجانسة p53 في التجارب.

1. إيواء اثنين من الفئران الإناث مع كل فأر ذكر لإنشاء أقفاص تربية. احسب أعمار صغارهم منذ الولادة (الولادة = اليوم 0).
2. في اليوم 10 ، حدد الجراء بشق الأذن. اجمع قصاصات الذيل للتنميط الجيني قبل حقن خط الخلية.

2. التنميط الجيني للفأر

1. استخرج الحمض النووي من قصاصات الذيل التي تم جمعها مقاس 2 مم باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية (انظر جدول المواد) ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
2. تحديد تركيز الحمض النووي ونقاوته عن طريق قياس الامتصاص عند 260-280 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد).
3. أداء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).
   1. قم بإنشاء مزيج رئيسي يحتوي على مزيج PCR تجاري (يحتوي على Taq polymerase و dNTPS و MgCl 2 ؛ انظر جدول المواد) ، والتمهيدي ، و dH₂O بنسبة 12.5: 0.25: 10.75 (μL) للعدد المطلوب من العينات. أضف 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي إلى كل أنبوب PCR وقم بتضمين dH₂O ، وعينة فارغة (متماثل الزيجوت لطفرة p53) ، وعينة متغايرة الزيجوت (متغاير الزيجوت لطفرة p53) ، وعينة من النوع البري (متماثل الزيجوت ل p53 العادي) كضوابط PCR.
   2. أضف 24 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل أنبوب PCR يحتوي على الحمض النووي. ماصة المحلول في كل أنبوب PCR لأعلى ولأسفل لتوزيع الحمض النووي في جميع أنحاء المزيج الرئيسي.
   3. ضع أنابيب التفاعل في دورة حرارية وقم بتدويرها وفقا للمواصفات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، ثم احتفظ بها عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للتحليل على الجل.
4. تحليل منتجات PCR باستخدام هلام الاغاروز الكهربائي.
   1. تحضير هلام 2 ٪ (50 مل من 1x TAE و 1 غرام من الأغاروز) عن طريق تسخين الأغاروز في TAE والخلط حتى يذوب. عندما تبرد ولا تزال سائلة ، أضف 2.5 ميكرولتر من صبغة هلام الحمض النووي إلى الأغاروز واخلطها. يلقي الجل في صندوق هلام مع مشط. ضع الجل في الجهاز الكهربائي (انظر جدول المواد) وقم بتغطيته ب 1x TAE.
   2. تحميل 10 ميكرولتر من 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي على الجل. تحميل 12.5 ميكرولتر من كل عينة. قم بتشغيل الجل لمدة 25 دقيقة عند 135 فولت.
   3. قم بتصوير الجل باستخدام الإعدادات المناسبة لصبغة هلام الحمض النووي المستخدمة على جهاز تصوير هلام (انظر جدول المواد) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

3. إعداد نموذج الورم (الشكل 1)

1. قم بزراعة خط خلايا M25FV24C (الممر 12-15) قبل أسبوع واحد من تاريخ الحقن في وسائط نمو كاملة (وسط النسر المعدل من Dulbecco [DMEM] مع إضافات: 10٪ FBS ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 2 مللي مول L-alanyl-L-glutamine dipeptide) في دورق 75 مل ، عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂. بمجرد أن تصبح الخلايا ~ 80٪ متقاربة ، قم بشفط الوسائط وغسل الخلايا 1x مع 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS).
   ملاحظة: M25FV24C هو خط خلايا الفئران المصمم للتعبير المفرط عن FGFR4^V550E الطافر ، والذي لوحظ في RMS ^1,26 للأطفال والبالغين.
2. ارفع الخلايا بإضافة 0.5 مل من محلول التربسين 0.25٪ إلى جانب اللوحة واحتضان الوعاء لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن تظهر الخلايا منفصلة ، أضف 2.5 مل من وسائط النمو الكاملة في درجة حرارة الغرفة لتعطيل التربسين. استخدم حصة عينة 10 ميكرولتر لتحديد تركيز الخلية للخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم واستبعاد التريبان الأزرق.
3. قم بإعداد الحجم الصحيح للخلايا المعلقة DPBS للحقن ووضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل: الحجم إلى جهاز الطرد المركزي = (عدد الفئران × عدد الخلايا لكل فأر) / (تركيز الخلايا) ، حيث عدد الفئران = الفئران المراد حقنها + 10 فئران إضافية للخطأ ، وعدد الخلايا لكل فأر = 10⁴.
4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 153 × جم. أعد تعليق حبيبات الخلية بالحجم المناسب (10 ميكرولتر لكل فأر × عدد الفئران) من المخزن المؤقت لحقن العضل (وسائط F10 + 0.5٪ FBS) وحقن الفئران في غضون 1 ساعة من تحضير هذا التعليق.

4. حقن الخلايا العضلية

ملاحظة: يتم حقن خلايا M25FV24C في الطرف الخلفي الأيمن للفئران التي يتراوح عمرها بين 4 و 6 أسابيع. ينتج عن الحقن في 4 أسابيع فأرا صغيرا مصابا بورم قد يكون من الصعب علاجه نظرا لوجود أنسجة محيطة أقل لتشتت HT. الانتظار حتى 6 أسابيع ينتج عنه فأر أكبر ، مما يسهل علاج الورم.

1. اقلب تعليق الخلية عدة مرات قبل الشفط للمساعدة في توزيع الخلايا بالتساوي داخل المحلول. نضح 10 ميكرولتر (10⁴ خلايا) باستخدام حقنة ميكرولتر (انظر جدول المواد). الماوس. بمجرد ضبط النفس ، يمكن الوصول إلى عضلات الفخذ الذيلية عن طريق تمديد الساق الخلفية. حلق الساق باستخدام كليبرز وامسح بنسبة 70٪ من الإيثانول.
2. حقن معلق الخلايا M25FV24C (10 ميكرولتر ، 10 4 خلايا) في عضلات الفخذ الخلفي الأيمن لفأر يبلغ من العمر^4-6 أسابيع باستخدام حقنة ميكرولتر محكمة الغلق بإبرة 26 ثانية.
   ملاحظة: يجب إدخال الإبرة بالتوازي مع عظم الفخذ باتجاه الركبة ، مع الحرص على عدم إصابة العصب الوركي. أدخل فقط نقطة الإبرة (حوالي 2 مم) بسبب كتلة العضلات الصغيرة للطرف الخلفي.
3. إدارة الحل في حركة ثابتة. قم بإزالة الإبرة وتأكد من عدم حدوث نزيف. أعد الماوس إلى قفص ثان.
4. تقييم الحيوانات يوميا ومراقبة أطرافها الخلفية لنمو الورم من خلال الجس. القتل الرحيم للفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون إذا واجهت أي من نقاط النهاية المبكرة التالية: حجم الورم الذي يتجاوز قطره 1.5 سم ، أو تقرح الورم ، أو العلامات الجهازية للمرض (الانتصاب ، أو الموقف المنحني ، أو الخمول ، أو انخفاض تناول الطعام أو الماء).

5. فحص التصوير بالرنين المغناطيسي

1. تخدير الماوس ، إلى مستوى لا توجد فيه حركة مع ضغط مخلب ، مع isoflurane تحت المعلمات التالية: حث في غرفة مع 4 ٪ في 1.5 LPM ، ثم نقل إلى مخروط الأنف على مزلقة الماسح الضوئي التصوير بالرنين المغناطيسي ومواصلة صيانة isoflurane على مخروط الأنف مع 1.5 ٪ -2 ٪ في 0.75 LPM. نعلق جهاز مراقبة الجهاز التنفسي. استخدم مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
2. تخيل الماوس المخدر باستخدام ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي (انظر جدول المواد). في الصورة المرجحة T2 (اكتساب Ax_Screen ، الجدول 1) ، لاحظ الأبعاد داخل المستوى وعدد الشرائح المحورية التي يظهر الورم بداخلها. لاحظ موقع الورم في إشارة إلى عظم الفخذ والسطح الجانبي للفخذ ، حيث تدخل الموجات فوق الصوتية.
   ملاحظة: يظهر الورم ككتلة شديدة داخل العضلات غير متماثلة من الجانب الآخر. حجم الورم الأولي الجيد للعلاجات المتعددة هو 2 مم × 2 مم × 2 مم للدراسات الحادة أو دراسات البقاء على قيد الحياة. إذا كان أكبر من ذلك بكثير ، فسيكون جيدا فقط للدراسات الحادة حيث سيصل الورم إلى نقطة نهاية الحجم قبل إكمال ثلاثة علاجات أسبوعية. تشمل معايير الاستبعاد لعلاج HIFU: ملفوفة حول عظم الفخذ ، قريبة جدا من عظم الفخذ ، خلفية جدا على الماوس ، وسطية لعظم الفخذ ، قريبة جدا من المستقيم.
3. قم بإزالة الماوس من الماسحة الضوئية واحصل على وزن أساسي. احلق الفأر من منتصف جسمه إلى أقدامه تحت التخدير باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية.
   ملاحظة: من الناحية المثالية ، يتم الحلاقة قبل 1 يوم من العلاج ، لأنها تسمح للفأر بأداء الاستمالة مما يسمح لكريم مزيل الشعر بالعمل بكفاءة أكبر.
4. استعادة الماوس في BSC ، وذلك باستخدام وسادة التدفئة تحت أحد طرفي القفص. أعد الفأر إلى قفصه عندما يستعيد الاستلقاء القصي.

6. التجربة: إعداد الحيوانات يوم علاج HIFU

1. لتحضير نظام HIFU ذو التجويف الصغير (انظر جدول المواد) ، قم بتشغيل المولد واملأ محول الطاقة بما يكفي من الماء منزوع الأيونات حتى يتم توسيع الغشاء أسفل محول الطاقة ، ولكن ليس صلبا لدرجة أنه سيضغط الماوس. قم بإزالة الغاز من الماء في دائرة محول الطاقة لمدة 30 دقيقة لإزالة الأكسجين المذاب من الوسط.
2. قم بإعداد نظام الكمبيوتر المرتبط.
   1. قم بتشغيل الكمبيوتر المتحكم وتأكد من توصيله عبر إيثرنت بمولد HIFU وعبر USB بشاشة المسبار الحراري. ابدأ تشغيل البرنامج وانقر فوق Home to home محول الطاقة قبل إدخال الماوس.
   2. معايرة مجسات الألياف الضوئية الحرارية: احصل على درجات حرارة الغرفة الأساسية ولاحظ تغير درجة الحرارة في غرفة التصوير بالرنين المغناطيسي. لاحظ حجم انحراف درجة الحرارة لكل مسبار بسبب شدة المجال المغناطيسي. أدخل مسبار درجة حرارة أنبوب الانجراف في أنبوب زجاجي مملوء بالجادولينيوم لمعايرة درجة الحرارة أثناء المسح وتأمين أنبوب الانجراف بشريط.
      ملاحظة: تتم إضافة درجة حرارة الغرفة الأساسية (أنبوب الانجراف) يدويا كمعلمة قياس الحرارة في واجهة المستخدم الرسومية في البرنامج. يتم تعيين منطقة الاهتمام (ROI) داخل أنبوب الانجراف في صورة MR لاكتشاف أي انحراف في درجة الحرارة وسيقوم تلقائيا بتصحيح صور قياس الحرارة.
   3. اسحب الدواء المراد حقنه في حقنة سعة 1 مل وضعه في مضخة التوصيل الأوتوماتيكية (انظر جدول المواد). قم بتجهيز الخط الذي سيتصل بقسطرة الوريد الخلفي للفأر حتى يملأ الدواء الخط بالكامل عن طريق الضغط على زر التسليم اليدوي في مضخة التوصيل التلقائي.
   4. استخدم مصباح حراري لتدفئة الفئران في الأقفاص لمدة ~ 20 دقيقة قبل نقلها إلى غرفة التخدير.
      ملاحظة: التسخين المسبق يعزز توسع الأوعية ، والذي سيتم مواجهته بمجرد تخدير الفأر ويساعد في وضع القسطرة.
3. تخدير الفأر بالإيزوفلوران (الحث: 4٪ عند 1.5 LPM ؛ الصيانة: 1.5٪ -2٪ عند 0.75 LPM) ونقله إلى مخروط الأنف. ضع مادة تشحيم القرنية على العينين لمنع التلف بسبب عدم وجود منعكس وميض تحت التخدير.
4. ضع كريم مزيل الشعر على المنطقة المحلوقة ، بما في ذلك الطرف الخلفي الأيمن بالكامل ، واتبع تعليمات الشركة المصنعة لإزالة الشعر.
   ملاحظة: ضع الماوس تحت مصباح حراري أثناء وجودك في BSC للمساعدة في التنظيم الحراري أثناء إزالة الشعر تحت التخدير.
5. بعد غسل كريم مزيل الشعر بالماء الدافئ ، قم بوزن الماوس على مقياس رقمي وسجل جرعات الدواء.
6. حرك الماوس إلى مخروط أنف متوافق مع التصوير بالرنين المغناطيسي على زلاجة التصوير بالرنين المغناطيسي. ضع مصباحا حراريا على الماوس لإبقائه دافئا أثناء التحضير للتصوير بالرنين المغناطيسي. ضع الفأر في وضع الاستلقاء الجانبي مع الجانب غير الحامل للورم لأسفل والورم العلوي داخل حامل فأر مطبوع 3D على الزلاجة (الشكل التكميلي 1 والشكل 2). تأكد من تحديد الموضع الصحيح للورم (أي في وسط الملف أفقيا ورأسيا ، مع الارتفاع فوق حواف حامل الماوس مباشرة لحساب الضغط بواسطة محول الطاقة بالموجات فوق الصوتية).
   ملاحظة: إذا لزم الأمر ، قم بقص قطعة وسادة جل مضغوطة بالموجات فوق الصوتية لوضعها تحت الماوس ، مع تبطين الجزء السفلي من الحامل ، بسمك لتسوية الورم إلى أعلى الحامل.
7. ضع الساق غير المصابة بعيدا عن ساق الورم ، إما تحت الماوس أو ممتدة مع ثني ساق الورم. تأكد من أن القدمين ليست في المجال القريب أو المجال البعيد للورم ومسار شعاع الموجات فوق الصوتية. ضع المصباح الحراري على بعد 15 سم من الذيل للتدفئة لإدخال القسطرة في الوريد الخلفي.
8. أدخل مسبار درجة حرارة المريء.
   1. خيط مسبار المريء من خلال مخروط الأنف عنق الفأر. قم بإمالة أنف الفأر لأعلى لإنشاء خط من فمه مباشرة إلى بطنه عن طريق تمديد الرأس. حرك المسبار الحراري فوق اللسان حوالي 0.5 سم في مريء الفأر واستبدل مخروط الأنف حول أنف الفأر. قم بتأمين مسبار المريء ومخروط الأنف في الجزء العلوي من الزلاجة.
      ملاحظة: راقب علامات الضائقة التنفسية مباشرة بعد إدخالها حيث يمكن إدخالها بشكل غير صحيح في القصبة الهوائية.
9. أدخل مسبار درجة حرارة المستقيم.
   ملاحظة: يجب أن تكون مجسات درجة حرارة المستقيم والمريء في حدود 3 درجات مئوية من بعضها البعض.
10. ضع جهاز مراقبة الجهاز التنفسي مع كابل التوصيل باتجاه رأس الماوس حتى لا يتداخل مع وضع محول الطاقة بالموجات فوق الصوتية. آمن بشريط لاصق.
11. أدخل قسطرة وريد ذيل إبرة الفراشة 27 جيجا في وريد ذيل جانبي متصل بالأنابيب الدقيقة مع 20 ميكرولتر من المساحة الميتة والشريط اللاصق بإحكام. بعد التسجيل ، تأكد من أن القسطرة لا تزال تتدفق جيدا.
12. استخدم شخصين لحمل الماوس المجهز ، وزلاجة الماوس ، وخط التخدير ، وخط الجهاز التنفسي ، وقسطرة الوريد الخلفي ، وأسلاك المسبار الحراري في ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي ، ووضعها في حامل زلاجة التصوير بالرنين المغناطيسي.
13. اطلب من مشغل برنامج HIFU (انظر جدول المواد) تحريك الغضروف المفصلي لمحول الطاقة مباشرة فوق الورم عن طريق الفحص البصري للمحاذاة الأولية²⁷. ضع مادة تشحيم العين أو جل الموجات فوق الصوتية المنزوع الغازات على الجلد الخالي من الشعر فوق الورم وقم بإقران محول HIFU بمنطقة الورم.
14. قم بتوصيل خط توصيل الدواء من المضخة الأوتوماتيكية إلى قسطرة الوريد الذيل. احسب مقدار المساحة الميتة في خط الوريد الخلفي وخط الاتصال. حرك الماوس HIFU الزلاجة على قضبان التصوير بالرنين المغناطيسي في وسط التصوير بالرنين المغناطيسي.
15. اضبط كمية ضخ الدواء على المضخة ، اعتمادا على نوع الدواء وتركيزه ووزن الحيوان ، وأضف مقدار المساحة الميتة. اضبط المضخة على معدل ضخ 200 ميكرولتر / دقيقة.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام FD و TLD بتركيز 2 ملغم / مل وجرعة 5 ملغم / كغم من وزن الجسم.
16. سجل درجات حرارة المسبار الحراري الأساسي.
17. ضع جهاز تسخين الهواء بالحمل الحراري (انظر جدول المواد) على الإعداد الأكثر دفئا. وجه الأنبوب الذي ينفخ الهواء نحو الماوس في وسط تجويف التصوير بالرنين المغناطيسي وثبته بشريط. سيتم تشغيل جهاز الاحترار لاحقا إلى أدنى إعداد له (32 درجة مئوية) لمنع ارتفاع درجة حرارة الماوس أثناء الصوتنة.
18. الحصول على صور المسح MR (Ax_Loc ، Sag_Loc ؛ الجدول 1) لتحديد موقع الورم لاستهداف صوتنة بما في ذلك العمق. اضبط موضع محول الطاقة وفقا لذلك باستخدام برنامج HIFU عن طريق إدخال مسافة الحركة المطلوبة كما تم قياسها على الصورة ثم النقر فوق اتجاه السهم للتحرك (الشكل 3 أ). لاحظ أيضا موقع أنبوب الانجراف. كرر حسب الضرورة.
19. تحديد موقع النقطة البؤرية للمحول في المستوى الإكليلي عن طريق إجراء صوتنة "لقطة اختبار" مستمرة قصيرة السعة 5 ثانية × 50 مللي فولت أثناء اكتساب قياس الحرارة Test_Shot (الجدول 1).
20. قم بمحاذاة صور استطلاع التصوير بالرنين المغناطيسي مع العرض الإكليلي للنقطة البؤرية داخل برنامج HIFU. راجع الصور الخاصة بموقع الورم ، بالنسبة للبنية العظمية والمستقيم ، وراجع موضع محول الطاقة حسب الضرورة.
21. كرر صوتنة لقطة الاختبار أثناء التصوير الحراري بتسعة تكرار (الجدول 1) لتأكيد ما إذا كان هناك تسخين متساو ودقيق في حجم الورم مع الحد الأدنى من التسخين خارج الهدف. اضبط موقع الشريحة وموقع محول الطاقة وعمق التوجيه ، وتأكد من أداء التسخين من خلال تكرار "لقطات الاختبار" حسب الضرورة.
22. باستخدام برنامج مراقبة معالجة HIFU ، حدد عائد الاستثمار لمراقبة قياس الحرارة ضمن ملف تعريف التسخين النهائي عن طريق قياس المسافة للتحرك ثم تغيير إحداثيات الشبكة في البرنامج. قم بتعيين عائد استثمار حول أنبوب الانجراف لتصحيح الانجراف. أدخل درجة حرارة خط الأساس بناء على درجة حرارة مسبار المستقيم لقياسات قياس الحرارة. يستخدم نظام HIFU لبدء صوتنة علاج HIFU ومراقبة قياس الحرارة.
23. افتح مواصفات علاج ارتفاع الحرارة لمدة 20 دقيقة في البرنامج وابدأ الصوتنة بمجرد جمع صور MR المرجعية ويبدأ قياس الحرارة.
24. قم بإجراء علاج لمدة 20 دقيقة (الشكل 3 ب) أثناء التصوير الحراري (الجدول 1) باستخدام برنامج التحكم المدمج في المشتق النسبي التكاملي (PID). حقن الدواء المحدد في 1.5 دقيقة ، بعد ارتفاع درجة الحرارة في عائد الاستثمار إلى درجة الحرارة المطلوبة (40 درجة مئوية).
25. مراقبة درجة الحرارة الأساسية طوال فترة العلاج. إذا كانت درجة حرارة المستقيم تزداد بسرعة أثناء العلاج ، فقد تكون هناك حاجة إلى تغيير موضع الماوس لتجنب ارتفاع درجة حرارة المستقيم خلال مدة العلاج التي تبلغ 10 أو 20 دقيقة. توقف عن العلاج إذا ارتفعت درجة حرارة المستقيم إلى >40 درجة مئوية.

7. التجربة: تصوير نموذج الماوس وإجراء صوتنة للدراسات الحادة

1. بعد الانتهاء من العلاج ، قم بإزالة الماوس من تجويف التصوير بالرنين المغناطيسي ، مما يضمن الإرقاء في موقع إدخال قسطرة الوريد الذيل. انقل الماوس إلى BSC وضعه على مخروط الأنف للتخدير المستمر.
2. ضع الفأر على ظهره على وسادة ماصة زرقاء مع تقييد أطرافه وكشف القلب.
3. القتل الرحيم للفئران من خلال الاستنزاف عن طريق ثقب القلب يليه إزالة القلب. أخذ الدم على الفور وأجهزة الطرد المركزي لفصل البلازما عند 10621 × جم لمدة 10 دقائق.
4. إجراء التشريح وتخزين الأعضاء كما هو مطلوب للتحليل. قم بتجميد الأعضاء في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية لعدة أشهر أو على المدى الطويل في خزان النيتروجين السائل.
5. تجانس أنسجة الورم ميكانيكيا عن طريق إضافة فائض تسعة أضعاف (وزن / وزن) من الماء منزوع الأيونات وتحطيم الأنسجة باستخدام خالط ضرب الخرزة. استخرج دوكسوروبيسين من 600 ميكرولتر من الأنسجة المتجانسة عن طريق إضافة 75 ميكرولتر بالتتابع من 300 مجم / مل نترات الفضة ، و 75 ميكرولتر من 10 مللي مول من حمض الكبريتيك ، و 2.5 مل من 1: 1 إيزوبروبانول: كلوروفورم. دوامة لمدة 20 دقيقة وتخزينها في -20 درجة مئوية طوال الليل.
6. لتحضير عينات للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) ، قم بطرد المحلول من الخطوة 7.5 عند 4500 × جم ، وقم بإزالة طبقة المذيبات العضوية ، وجفف الأيزوبروبانول: الكلوروفورم تحت تيار من غاز النيتروجين. أعد التعليق في 100 ميكرولتر من 2: 1 MeOH:_{H 2}O. قياس تركيز دوكسوروبيسين باستخدام HPLC-MS /^{MS 28}.

8. التجربة: تصوير نموذج الماوس وإجراء صوتنة لدراسات البقاء على قيد الحياة

ملاحظة: لدراسات البقاء على قيد الحياة ، اتبع إجراء إعداد الحيوانات ليوم علاج HIFU (الخطوة 6.1 إلى 6.25).

1. بعد الانتهاء من العلاج ، ضع الفأر تحت مصباح حراري للسماح له بالتعافي ، ومراقبة تنفسه وحركته حتى يستعيد استلقاء القص. ثم أعد الحيوان إلى قفصه.
   ملاحظة: تأكد من أن نصف القفص يتماشى مع مصباح حراري ، حيث يتأثر التنظيم الحراري للحيوانات بالتخدير والعلاج HT.
2. راقب الفئران يوميا بحثا عن السلوك وأنماط التغذية ومعدل التنفس بحثا عن أي علامات ضيق.
3. قم بإجراء العلاجات مرة واحدة أسبوعيا باتباع الخطوات من 6.1 إلى 6.25 لمدة 3 أسابيع متتالية.
4. مرتين أسبوعيا ، قم بإجراء تصوير التصوير بالرنين المغناطيسي للفئران لقياس الورم. خلال الأسابيع أثناء العلاج ، قم بإجراء فحص واحد بالرنين المغناطيسي وفحص واحد بالموجات فوق الصوتية كل أسبوع. بعد اكتمال العلاج ، قم بإجراء التصوير بالموجات فوق الصوتية كل أسبوعين.
5. القتل الرحيم للفأر بعد 60 يوما من الانتهاء من سلسلة العلاجات ، أو عند الوصول إلى نقطة نهاية إنسانية (حجم الورم >1.5 سم³ أو المراضة من الورم) ، يليه التشريح مع إزالة الورم والأعضاء للتحليل.

النتائج

باستخدام بروتوكول ارتفاع الحرارة الناتج عن MRgHIFU ، كانت الأورام في الطرف الخلفي قادرة على تسخينها باستمرار إلى درجة الحرارة المحددة المطلوبة طوال مدة العلاج (يوضح الشكل 4 علاجا تمثيليا ، 10 أو 20 دقيقة ، ن = 65). لاعتبار العلاج ناجحا ، كان لا بد من الحفاظ على عائد الاستثمار فوق 39 ?...

Discussion

تم استخدام البروتوكول الذي تم تطويره هنا لاستهداف أورام الأطراف الخلفية باستخدام MRgHIFU لعلاج HT الخفيف وإطلاق الأدوية المغلفة من الجسيمات الشحمية في الجسم الحي. تمت مصادفة العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول أثناء الدراسة التجريبية ، وكان تحسين هذه الخطوات الحاسمة مسؤولا عن ت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22363204
1kb plus DNA Ladder	Froggabio	DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix)	Wisent	801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec	Bruker	T184931	70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler	Biorad	1851148
Clippers	Whal Peanut	8655
Compressed ultrasound gel	Aquaflex	HF54-004
Convection heating device	3M Bair Hugger	70200791401
Depiliatory cream	Nair	61700222611	Shopper's Drug Mart
DMEM	Wisent	219-065-LK
DNeasy extraction kit	Qiagen	69504
DPBS	Wisent	311-420-CL
Drug injection system	Harvard Apparatus	PY2 70-2131	PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant	Optixcare	50-218-8442
F10 Media	Wisent	318-050-CL
FBS	Wisent	081-105
Froggarose	FroggaBio	A87
Gel Molecular Imager	BioRad	GelDocXR
Glutamax	Wisent	609-065-EL
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100	Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G)	SAI infusion	PE-20-100
Isoflurane	Sigma	792632
M25FV24C Cell line	Gladdy Lab	N/A
Microliter Syringe	Hamilton	01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR	Biorad	170-8170
Mouse holder	The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine	N/A	Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm.
MyRun Machine	Cosmo Bio Co Ltd	CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000-GL
p53 primers	Eurofins	N/A	Custom Primers
PCR tubes	Diamed	SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin	Wisent	450-200-EL
Proteus software	Pichardo lab	N/A
Respiratory monitoring system	SAII	Model 1030	MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS	Image Guided Therapy	N/A	LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter  25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 - 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency  2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe	ThermoFisher Scientific	S33102
TAE	Wisent	811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" )	Terumo Medical Corp	15253
Thermal probes	Rugged Monitoring	L201-08
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin	Wisent	325-052-EL
Ultrasound Gel	Aquasonic	PLI 01-08