التحكم في جزء الجسيمات في سقالات الجسيمات الملدنة الصغيرة التي يسهل اختراقها لثقافة الخلية 3D

Summary

إن تقليل التباين في جزء الجسيمات داخل السقالات الحبيبية يسهل التجريب القابل للتكرار. يصف هذا العمل طرق توليد سقالات حبيبية مع كسور الجسيمات الخاضعة للرقابة لتطبيقات هندسة الأنسجة في المختبر .

Abstract

الكبسولات الهلامية الدقيقة هي اللبنات الأساسية لسقالات الجسيمات الملدنة الصغيرة التي يسهل اختراقها (MAP) ، والتي تعمل كمنصة لكل من زراعة الخلايا في المختبر وإصلاح الأنسجة الحية . في هذه السقالات الحبيبية ، تتيح المسامية الفطرية الناتجة عن الفراغ الفراغي بين الكبسولات الهلامية الدقيقة تسلل الخلايا والهجرة. يعد التحكم في جزء الفراغ وجزء الجسيمات أمرا بالغ الأهمية لتصميم سقالة MAP ، حيث أن المسامية هي إشارة نشطة بيولوجيا للخلايا. يمكن إنشاء الهلاميات الدقيقة الكروية على جهاز الموائع الدقيقة للتحكم في الحجم والشكل ثم تجفيفها بالتجميد باستخدام طرق تمنع تكسير شبكة البوليمر. عند إعادة الإماهة ، تؤدي الهلاميات الدقيقة المجففة بالتجميد إلى كسور جسيمات خاضعة للرقابة في سقالات MAP. أدى تنفيذ هذه الطرق لتجفيف الميكروجيل إلى دراسات قابلة للتكرار تظهر تأثير جزء الجسيمات على انتشار الجزيئات الكبيرة وانتشار الخلايا. سيغطي البروتوكول التالي تصنيع الكبسولات الهلامية الدقيقة وتجفيفها وإعادة إماهتها للتحكم في جزء الجسيمات في سقالات MAP ، بالإضافة إلى تلدين الهلاميات الدقيقة من خلال الربط الحيوي المتعامد لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد في المختبر.

Introduction

سقالات الجسيمات الملدنة الصغيرة التي يسهل اختراقها (MAP) هي فئة فرعية من المواد الحبيبية التي ترتبط فيها كتل البناء microgel (μgel) لتشكيل سقالة مسامية سائبة. مع البنية الدقيقة الفريدة لهذه السقالات الحبيبية ، فإن المسامية الفطرية الناتجة عن مساحة الفراغ بين الميكروجيل الكروي المترابط تدعم تسلل الخلايا المتسارعة والهجرة¹. يمكن تصنيع اللبنات الأساسية للميكروجيل لسقالات MAP من كل من البوليمرات الاصطناعية والطبيعية مع تعديلات كيميائية². تسلط الطرق الموضحة هنا الضوء على وجه التحديد على استخدام المواد الهلامية الدقيقة المكونة من العمود الفقري لحمض الهيالورونيك (HA) المعدل بمقابض نوربورنين الوظيفية (NB). يدعم المقبض الوظيفي NB على بوليمر HA تفاعلات كيمياء النقر لتشكيل الهلاميات الدقيقة وربطها معا لتوليد سقالات MAP ^3,4. تم استخدام العديد من المخططات لربط الهلاميات الدقيقة معا (أي التلدين) ، مثل تفاعلات الأنزيمية¹ ، ^{5,6 القائمة على الضوء} ، وكيمياء النقر الخالية من المواد المضافة ^3,7. تم وصف كيمياء النقر الخالية من المواد المضافة في هذا العمل ، باستخدام اقتران ديلز-ألدر للطلب العكسي للإلكترون رباعي-نوربورنين لربط الهلاميات الدقيقة HA-NB.

لتصنيع سقالات MAP ، يقوم المستخدمون أولا بإنشاء كتل بناء microgel باستخدام مستحلبات عكسية إما في أنظمة الدفعات أو داخل أجهزة الموائع الدقيقة ، وكذلك مع الرش الكهروهيدروديناميكي أو الطباعة الحجرية أو التجزئة الميكانيكية². تم وصف إنتاج الهلاميات الدقيقة الكروية HA-NB بشكل جيد وتم الإبلاغ عنها سابقا باستخدام كل من مستحلب الدفعات² وتقنيات توليد قطرات الموائع الدقيقة⁸،⁹،^10،11. في هذا العمل ، تم إنشاء كبسولات هلامية كروية HA-NB على منصة موائع دقيقة تركز على التدفق للتحكم في الحجم والشكل ، كما هو موضح سابقا⁸،^9،10. بعد التنقية ، توجد الهلاميات الدقيقة في تعليق مائي ويجب أن تتركز للحث على حالة انحشار. عند التشويش ، تظهر الهلاميات الدقيقة خصائص ترقق القص ، مما يسمح لها بالعمل كمواد قابلة للحقن وملء الفراغ¹. تتمثل إحدى طرق إحداث حالة انحشار في تجفيف الكبسولات الهلامية الدقيقة عن طريق التجفيد ، أو التجفيف بالتجميد ، ثم إعادة ترطيب المنتج المجفف لاحقا في حجم متحكم فيه¹². بدلا من ذلك ، يمكن إزالة المخزن المؤقت الزائد من ملاط microgel عن طريق الطرد المركزي فوق مصفاة أو مع الإزالة اليدوية للمخزن المؤقت من حبيبات microgel إما عن طريق الشفط أو باستخدام مادة ماصة. ومع ذلك ، فإن استخدام الطرد المركزي لتجفيف الهلاميات الدقيقة يمكن أن يولد نطاقا متغيرا للغاية من كسور الجسيمات والكسور الفارغة عند صنع السقالات الحبيبية¹². تم وصف تقنيات تجفيف الكبسولات الهلامية الدقيقة باستخدام 70٪ IPA للكبسولات الهلامية الدقيقة¹³ من البولي إيثيلين جلايكول (PEG) ، والزيوت المفلورة للجيل الجيلاتيني ميثاكريلويل (GelMa)¹⁴ ، و 70٪ من الإيثانول للهلاميات الدقيقة^{HA 12}. يسلط هذا البروتوكول الضوء على طرق تجفيف الهلاميات الدقيقة HA الكروية بالتجميد باستخدام 70٪ من الإيثانول ، وهو كاشف مختبري قياسي ، للاحتفاظ بخصائص microgel الأصلية أثناء عملية التجفيف. يمكن وزن المواد الهلامية الدقيقة HA المجففة بالتجميد وإعادة ترطيبها بنسب وزن يحددها المستخدم للتحكم في كسور الجسيمات النهائية في سقالات MAP¹².

تعتمد الخطوة الأخيرة في تشكيل سقالة MAP على تلدين الكبسولات الهلامية الدقيقة لإنشاء سقالة كبيرة ومسامية¹. من خلال استخدام مكونات المصفوفة خارج الخلية الأصلية واستخدام مخططات التلدين المتعامد الحيوي ، تعمل سقالات MAP كمنصة متوافقة حيويا لكل من زراعة الخلايا في المختبر وإصلاح الأنسجة الحية ³. من خلال هذه الأساليب ، يمكن تصنيع سقالات MAP من كتل بناء HA-NB مع كسور الجسيمات المحددة من قبل المستخدم لاستخدامها في تطبيقات هندسة الأنسجة¹². يصف البروتوكول التالي إنتاج الموائع الدقيقة للكبسولات الهلامية الدقيقة HA-NB متبوعا بالتجفيف بالتجميد والإماهة للتحكم في جزء الجسيمات في سقالات MAP. أخيرا ، يتم وصف خطوات تلدين الهلاميات الدقيقة باستخدام الكيمياء الحيوية المتعامدة لتجارب زراعة الخلايا 3D في المختبر .

Protocol

1. تصنيع جهاز الموائع الدقيقة

1. الطباعة الحجرية الناعمة
   ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تصنيع الجهاز لتصميم جهاز الموائع الدقيقة الذي يركز على التدفق من de Wilson et ^al.9. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول مع أي تصميم جهاز على رقاقة SU-8. يمكن لصق الرقاقة على طبق بتري ، ثم تحتاج إلى أن يتم silanized لمنع التصاق PDMS بميزات الرقاقة¹⁵.
   1. امزج قاعدة المطاط الصناعي polydimethylsiloxane (PDMS) مع عامل المعالجة (انظر جدول المواد) بنسبة 10: 1. تحضير ما يقرب من 100 غرام لتغطية رقاقة مع ~ 5 مم PDMS. يسكب خليط PDMS على الرقاقة ويتخلص من الغازات في مجفف لمدة 30 دقيقة تقريبا. بمجرد اختفاء جميع الفقاعات ، ضعها في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل لعلاج PDMS.
   2. استخدم سكينا لتتبع معلمة الجهاز برفق دون تكسير الرقاقة ؛ ثم ، قشر PDMS بعناية من الرقاقة. استخدم لكمة خزعة 1 مم (انظر جدول المواد) لإنشاء قنوات المدخل والمخرج.
      ملاحظة: كن لطيفا عند ثقب جهاز الموائع الدقيقة. يمكن أن تتسبب التمزقات أو التمزقات حول قنوات المدخل أو المخرج في حدوث تسربات أثناء إنتاج الميكروجيل.
   3. استخدم شريطا لإزالة الغبار من الجهاز على جانب الميزة. ضع الأجهزة ونظف الشرائح الزجاجية على لوح تسخين عند 135 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل لإزالة الرطوبة.
   4. في غطاء الدخان ، استخدم مسدس بلازما الإكليل (انظر جدول المواد) على ارتفاع على كل من الشرائح الزجاجية والأجهزة (الجانب المميز مكشوف) لمدة 30 ثانية تقريبا ، ثم اربطها معا بسرعة. اضغط برفق لضمان إحكام جيد بين الجهاز والشريحة الزجاجية. ضع الأجهزة في فرن 60 درجة مئوية طوال الليل لتأمين السند.

2. إنتاج الموائع الدقيقة من المواد الهلامية الدقيقة لحمض الهيالورونيك (HA) مع مقابض وظيفية نوربورنين (NB)

1. توليف HA-NB
   ملاحظة: تم تكييف تخليق HA-norbornene (HA-NB) من Darling et al.3 باستخدام 79 كيلو دالتون من الصوديوم HA مع المكافئات المولية ل 1: 1.5: 2.5 من وحدات تكرار HA إلى 4- (4،6-ثنائي ميثوكسي-1،³ ،5-تريازين-2-يل) -4-ميثيل مورفولينيوم كلوريد (DMTMM) إلى 5-نوربورنين-2-ميثيل أمين (NMA).
   1. وزن المتفاعلات. قم بإذابة HA عند 20 مجم / مل في محلول MES 200 mM (درجة الحموضة ~ 6) عن طريق التقليب في دورق أو دورق على طبق تقليب. بمجرد الذوبان ، أضف DMTMM إلى محلول HA واتركه يتفاعل لمدة 20 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام 1 جم HA + 1.09 جم DMTMM + 845 ميكرولتر NMA.
   2. أضف NMA قطرة إلى حل HA / DMTMM. أضف البارافيلم إلى فتحة وعاء التفاعل لتقليل التبخر وتغطية وعاء التفاعل بورق الألمنيوم. استمر في التقليب مع السماح للتفاعل بالاستمرار لمدة 24 ساعة تقريبا.
   3. بعد 24 ساعة ، قم بتبريد 200 إيثانول مقاوم (حوالي 10 أضعاف حجم التفاعل). على طبق التحريك ، انقل التفاعل بالتنقيط إلى الإيثانول المبرد لترسيب HA-NB واستمر في التقليب عند 200-300 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
   4. انقل المحلول إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل ، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 5000 × جم لمدة 10 دقائق. اسكب الإيثانول الزائد للتخلص منه كنفايات. في هذه المرحلة ، يجب أن يكون منتج HA-NB عبارة عن كريات بيضاء في الأنابيب المخروطية. اسحب المكنسة الكهربائية على HA-NB في مجففة لتجف طوال الليل.
   5. تنقية HA-NB باستخدام 12-14 كيلو دالتون قطع الوزن الجزيئي أنابيب غسيل الكلى السليلوز (انظر جدول المواد). قم بإذابة HA-NB في محلول كلوريد الصوديوم 2 M وانقله إلى أنبوب غسيل الكلى. اربط الأنبوب وثبته بالمشابك ، إذا لزم الأمر. انقل أنبوب غسيل الكلى المملوء إلى دلو به 5 لتر من الماء عالي النقاء وقم بغسيل HA-NB ضد الماء طوال الليل.
   6. في اليوم التالي ، قم بإزالة الماء واستبدله بمحلول 1 M NaCl لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة محلول كلوريد الصوديوم ، ثم قم بغسيل الكلى ضد الماء عالي النقاء لمدة 3 أيام ، ليحل محل الماء يوميا.
   7. قم بتصفية المنتج الذي تم تحليله باستخدام مرشح مفرغ من الهواء 0.2 ميكرومتر ، ثم انقل المنتج المصفى إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
   8. أضف النيتروجين السائل إلى وعاء مبرد وقم بتجميد أنابيب HA-NB لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنابيب المخروطية بالملقط وقم بإزالة الغطاء والغطاء بسرعة بمنديل من الدرجة المعملية (انظر جدول المواد). قم بتأمين المنديل بشريط مطاطي وانقله إلى حاوية أو غرفة تجفيف بالتجميد (انظر جدول المواد) وقم بتجميد التجميد. قم بتخزين المنتج المجفف بالتجميد في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
      تنبيه: النيتروجين السائل مادة خطرة. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة عند العمل مع النيتروجين السائل.
   9. حدد تعديل النوربورنين عن طريق إذابة HA-NB عند 10 مجم / مل في D₂O والتحليل عبر البروتون NMR (الشكل 1A) ¹⁶.
      1. لتحديد مقدار الأداء الوظيفي ، قم أولا بمعايرة ذروة مذيب D₂O إلى 4.8 جزء في المليون. دمج ذروة بروتونات ميثيل HA (δ2.05) ومعايرة التكامل إلى 3.0. بعد ذلك ، قم بدمج قمم مجموعات نوربورنين المعلقة عند δ6.33 و δ6.02 (بروتونات الفينيل ، إندو). تطبيع تكامل هذه القمم مع العدد المقابل من البروتونات لتحديد متوسط درجة التعديل³.
2. إعداد السلائف ميكروجيل HA-NB
   1. قم بإعداد 50 mM HEPES buffer (درجة الحموضة 7.5) وتصفية المخزن المؤقت المعقم باستخدام مرشح يحركه الفراغ 0.2 ميكرومتر. باستخدام المخزن المؤقت HEPES ، قم بإعداد مخزون 50 مللي مول من فينيل الليثيوم (2،4،6 ، -ثلاثي ميثيل بنزويل) فوسفينات (LAP) وعامل اختزال تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP). احتفظ بمحلول LAP بعيدا عن الضوء.
   2. قم بإعداد مكونات سلائف microgel الأخرى عن طريق تحضير مخزون 50 mM من رابط ثنائي ثيول وببتيد RGD في الماء المقطر المعقم. قم بوزن HA-NB وقم بإذابته في محلول HEPES لتحضير مرق 10 مجم / مل.
      ملاحظة: يمكن استخدام روابط ثنائية ثيول مختلفة للتشابك الداخلي للكبسولات الهلامية الدقيقة بناء على تفضيل المستخدم. تم إدراج كل من الرابط القابل للتحلل (أي MMP-cleavable) وغير القابل للتحلل (dithiothreitol أو DTT) في جدول المواد. يتم تضمين ببتيد RGD في تركيبة microgel لتعزيز التصاق الخلايا في سقالات MAP ، ولكن يمكن إزالة هذا المكون واستبداله بحجم متساو من المخزن المؤقت HEPES.
   3. اجمع مكونات السلائف مع التركيزات النهائية 9.9 mM LAP و 0.9375 mM TCEP (4 thiol / TCEP) و 2.8 mM di-thiol linker و 1 mM RGD peptide و 3.5 wt٪ (w / v) HA-NB عن طريق إضافة مخزن HEPES إضافي للوصول إلى الحجم النهائي المطلوب. امزج السلائف جيدا باستخدام ماصة إزاحة موجبة.
   4. باستخدام ماصة P1000 ، اسحب الخليط بالكامل ببطء. ضع الطرف على نهاية حقنة سعة 1 مل وأخرج الطرف من الماصة. اسحب مكبس المحقنة لتحميل الخليط في المحقنة ، ثم أضف مرشحا 0.2 ميكرومتر في نهاية المحقنة وقم بالتصفية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي لمحلول السلائف المصفى لإزالة الفقاعات الناتجة أثناء التصفية.
   5. مرة أخرى ، باستخدام ماصة P1000 ، اسحب السلائف المفلترة ببطء مع الحرص على عدم إنشاء فقاعات. إذا كانت هناك فقاعات ، فاضغط برفق على الطرف حتى تزيح وتطفو إلى الأعلى.
   6. ضع الطرف على نهاية حقنة سعة 1 مل وأخرج الطرف من الماصة. حافظ على المحقنة عمودية واسحب مكبس المحقنة ببطء حتى يصبح محلول السلائف بالكامل في المحقنة. أضف إبرة ذات طرف حاد إلى المحقنة وادفع السلائف عبر طرف الإبرة. لف المحقنة بورق القصدير لإبعادها عن الضوء.
3. إعداد محلول معسر ميكروجيل
   1. تحضير 5٪ v / v Span-80 في زيت معدني أبيض ثقيل وتخلط جيدا. جفف لإزالة الفقاعات. احتفظ بخليط الفاعل بالسطح / الزيت في درجة حرارة الغرفة ملفوفا بورق الألمنيوم. تخلط جيدا وتجفف قبل كل استخدام.
   2. استخدم حقنة سعة 5 مل لسحب خليط الزيت / الفاعل بالسطح (تقليل الفقاعات) حتى تصبح المسافة بين المكبس وقبضة الإصبع مساوية تقريبا لمسافة حقنة السلائف. أضف إبرة حادة إلى المحقنة وادفع الزيت عبر طرف الإبرة.
4. إعداد جهاز الموائع الدقيقة
   1. أضف إبرة حادة إلى حقنة سعة 1 مل واملأها بمحلول معالجة اصطناعي كاره للماء (انظر جدول المواد). قم بتدفق المحلول برفق عبر جهاز الموائع الدقيقة حتى يتجمع عند كل مدخل / مخرج. اترك المحلول يجف في الجهاز على الطاولة لمدة 30 دقيقة تقريبا ، ثم اسحب المكنسة الكهربائية على المخرج لإزالة المحلول الزائد. تأمين الجهاز مع المشابك على المجهر الطاولة.
   2. لف أنبوبا مخروطيا سعة 15 مل بورق القصدير وضعه في رف أنبوب ليكون بمثابة حاوية تجميع ميكروجيل. استخدم حاملا حلقيا بمشبك لوضع مسبار ضوء الأشعة فوق البنفسجية في فتحة أنبوب التجميع. استخدم كاشف الأشعة فوق البنفسجية (انظر جدول المواد) لقياس شدة الأشعة فوق البنفسجية ، وتحريك المسبار حتى يتم تحقيق 20 ميغاواط / سم² . أطفئ ضوء الأشعة فوق البنفسجية حتى وقت لاحق.
   3. قطع الأنابيب بطول يصل من جهاز الموائع الدقيقة إلى حاوية التجميع. في أحد طرفي الأنبوب ، قم بقطع زاوية 45 درجة. أدخل الطرف المائل للأنبوب برفق في قناة المخرج.
      ملاحظة: كن لطيفا عند إدخال الأنبوب في جهاز الموائع الدقيقة. يمكن أن تتسبب التمزقات أو التمزقات حول قنوات المدخل أو المخرج في حدوث تسربات أثناء إنتاج الميكروجيل.
   4. قم بتأمين كل من محاقن السلائف ومحاقن الطور الزيتي على مضخة مزدوجة المحاقن (انظر جدول المواد). قطع قطعتين أخريين من الأنابيب بطول يصل من نصائح المحاقن إلى جهاز الموائع الدقيقة. في أحد طرفي كل أنبوب ، اقطع زاوية 45 درجة. ثبت بعناية الأنبوب (نهاية حادة) على كل من أطراف المحقنة.
   5. قم بتغيير الإعدادات الموجودة على المضخة للمحقنة سعة 1 مل وقم بتضمين حجم السلائف التقريبي. ادفع المضخة ببطء للأمام حتى يتم تطبيق ضغط كاف على غطاسات المحاقن لدفع كل من الزيت والسلائف إلى نهايات الأنبوب ، وإزالة أي هواء من النظام. دع الضغط يتعادل لمدة 5-10 دقائق قبل الانتقال إلى الخطوة 2.4.6.
   6. أدخل الطرف المائل للأنبوب برفق في قنوات مدخل جهاز الموائع الدقيقة باستخدام محلول سلائف microgel في المدخل الأمامي وزيت القرص في المدخل الخلفي. حرك المضخة للأمام بزيادات صغيرة حتى يبدأ التدفق في الجهاز وتبدأ الهلاميات الدقيقة الكروية في التكون في منطقة تركيز التدفق. ابدأ تشغيل المضخة بمعدل تدفق 0.4 ميكرولتر / دقيقة واترك الجهاز يعمل حتى يستقر. إذا لزم الأمر ، اضبط معدل التدفق ±0.1 ميكرولتر / دقيقة بزيادات صغيرة لتثبيت إنتاج ميكروجيل.
   7. بمجرد استقرار إنتاج الميكروجيل كما هو موضح في الشكل 1 ب ، استبدل أنبوب التجميع بأنبوب جديد ، وقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تحقق من الجري بشكل دوري للتأكد من استقرار إنتاج الهلام الدقيق طوال مدة التشغيل.

الشكل 1: إنتاج الموائع الدقيقة للكبسولات الهلامية الدقيقة لحمض الهيالورونيك (HA) مع مقابض وظيفية نوربورنين (NB). (أ) تم تعديل ما يقرب من 31٪ من وحدات تكرار HA بنجاح باستخدام NB ، كما هو محدد بواسطة تحليل البروتون NMR الذي تم إجراؤه في أكسيد الديوتيريوم. ¹ تمت مقارنة تحولات H NMR للنوربورنين المعلقات عند δ6.33 و δ6.02 (بروتونات الفينيل ، إندو) ، و δ6.26 و δ6.23 جزء في المليون (بروتونات الفينيل ، exo) بمجموعة ميثيل HA δ2.05 جزء في المليون لتحديد الوظيفية. أعيد طبعها من Anderson et ^al.12 بإذن من Elsevier. (ب) رسم تخطيطي لجهاز الموائع الدقيقة الذي يركز على التدفق المستخدم لتوليد ميكروجيلات HA-NB. (ج) تم استخدام إسقاطات الكثافة القصوى من الفحص المجهري متحد البؤر لتصور μgels المسمى بالفلورسنت (شريط المقياس = 500 ميكرومتر). (د) تظهر توزيعات التردد لقطر الهلام الدقيق من عمليات التشغيل المستقلة على إعداد الموائع الدقيقة التحكم في حجم الهلام الدقيق ~ 50 ميكرومتر أو ~ 100 ميكرومتر اعتمادا على الجهاز المستخدم. (ه) يتم الإبلاغ عن قطر Microgel على أنه المتوسط والانحراف المعياري لكل تشغيل مستقل. أعيد طبعها من ويلسون وآخرون ⁹ بإذن من وايلي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. تنقية وتجفيف الهلاميات الدقيقة

1. تنقية microgels
   1. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل microgel (300 mM HEPES ، 50 mM NaCl ، 50 mM CaCl 2) بالإضافة إلى₂٪ (w / v) محلول Pluronic F-127 الخافض للتوتر السطحي في محلول الغسيل. تعقيم المحاليل باستخدام مرشح يعمل بالفراغ 0.2 ميكرومتر.
   2. جهاز طرد مركزي لأنبوب جمع الميكروجيل (5000 × جم) لمدة 5 دقائق. في غطاء معقم ، استنشاق بعناية مرحلة الزيت الزائد. امزج الميكروجيل 1: 1 مع محلول الفاعل بالسطح Pluronic F-127 بنسبة 2٪ والدوامة للخلط جيدا. جهاز طرد مركزي (5000 × جم) لمدة 5 دقائق وشفط محلول الغسيل الطارد.
   3. أضف محلول الغسيل بحجم 4x microgel ودوامة لخلط جيدا. جهاز طرد مركزي (5000 × جم) الخليط لمدة 5 دقائق وشفط محلول الغسيل. أكمل 4-8 غسلات باستخدام مخزن الغسيل المؤقت حتى تتم إزالة الفاعل بالسطح من النظام (أي لا توجد فقاعات).
2. وضع العلامات الفلورية على الكبسولات الهلامية الدقيقة HA-NB
   ملاحظة: يعتمد التوليف الداخلي لرباعي الترازين المسمى بالفلورسنت على تفاعلين إضافة ثيول-مايكل محفزين بالقاعدة في سلسلة تم وصفها جيدا والإبلاغ عنها سابقا³. لهذا العمل ، تم اقتران Alexa Fluor-488 مع tetrazine لوضع العلامات على μgels المعدلة بالنوربورنين. تم إذابة المنتج المجفف بالتجميد (Alexa Flour 488-Tet) في ثنائي ميثيل الفورماميد عند 1 مجم / مل وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
   1. لتسمية الميكروجيل بالفلورسنت ، قم أولا بإعداد محلول عملي من Alexa Fluor 488-Tet عن طريق تخفيف مخزون 1 مجم / مل 1:14 في برنامج تلفزيوني معقم 1x. في غطاء معقم ، ادمج الميكروجيل مع محلول العمل (2: 1 من حيث الحجم).
   2. استخدم ماصة الإزاحة واخلطها جيدا. احتضان الخليط لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   3. جهاز طرد مركزي (5000 × جم) وشفط محلول التلطيخ. اغسل الميكروجيل مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني واحد (1: 1 من حيث الحجم) لإزالة Alexa Fluor 488-Tet غير المتفاعل.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تصوير الميكروجيل المسمى بالفلورسنت على مجهر متحد البؤر لتحديد حجم الهلام الدقيق (الشكل 1C-E)⁹. تم وصف طرق قياس حجم الهلام الدقيق بدقة بواسطة Roosa et ^al.17.
3. تجفيف الهلاميات الدقيقة HA-NB
   1. انقل الميكروجيل المنقى (الشكل 2 أ) إلى أنبوب غطاء لولبي آمن للتبريد باستخدام ماصة إزاحة موجبة. أضف 70٪ إيثانول إلى الميكروجيل المنقى 50٪ (v / v) واخلطه جيدا مع ماصة الإزاحة. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 5000 × جم.
      تنبيه: الإيثانول مادة شديدة الاشتعال.
      ملاحظة: يمكن وزن أنبوب الغطاء اللولبي الآمن من التبريد قبل إضافة الميكروجيل ، ثم وزنه مرة أخرى بعد التجفيد لتحديد كتلة الميكروجيل. يوصى بذلك لتقليل الخطأ عند استخدام كميات أقل من 1 ملغ. تأكد من ضبط الميزان أو معايرته داخليا قبل الاستخدام.
   2. استنشاق السائل الطافي واستبداله ب 70٪ إيثانول (50٪ v / v) (الشكل 2B). تخلط جيدا مع ماصة الإزاحة. احتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الكبسولات الهلامية الدقيقة في 70٪ من الإيثانول عند 4 درجات مئوية قبل التجفيد للتخزين طويل الأجل ، إذا لزم الأمر. تظهر الهلاميات الدقيقة المجففة بالتجميد في الشكل 2C. يمكن استخدام وسائط التجفيد الأخرى في هذه الخطوة إذا كان تكوين cryogel مطلوبا (الشكل 2D).
   3. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة للتأكد من أن الميكروجيل في الجزء السفلي من أنبوب الغطاء اللولبي. أضف النيتروجين السائل إلى حاوية مبردة ، ثم أضف أنبوب μgels إلى التجميد السريع.
   4. بعد 5-10 دقائق ، قم بإزالة أنبوب μgels بالملقط. قم بإزالة الغطاء بسرعة وقم بتغطيته بمنديل من الدرجة المعملية. ثبت المنديل بشريط مطاطي وانقله إلى حاوية أو غرفة التجفيد.
   5. قم بتحميل العينة على جهاز التجفيد باتباع تعليمات الشركة المصنعة. التجفيد عند 0.066 تور و -63 درجة مئوية. قم بتخزين الميكروجيل المجفف بالتجميد (lyo-μgels) مغلقا بإحكام في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يكتمل التجفيد عند إزالة كل السائل من الأنبوب ويبقى منتج جاف. يمكن للمذيبات العضوية أن تقلل من طول عمر تركيبات المطاط في أنظمة التجفيد الشائعة.

الشكل 2: تجفيف الهلاميات الدقيقة HA-NB. (أ) إسقاط الكثافة القصوى للميكروغرام في محلول مائي (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (ب) يمكن تحضين الميكروجيل المنقى بنسبة 1: 1 من حيث الحجم في وسط التجفيد المختار والمجفف بالتجميد. (ج) إسقاط الكثافة القصوى لليو-ميكروجل المجفف (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (د) يعاد تعليق الكبسولات الهلامية الدقيقة بعد التجفيد. يوصى باستخدام EtOH (70٪) للاحتفاظ بالخصائص الأصلية للميكروجل طوال عملية التجفيد ؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام وسائط أخرى مثل كحول الأيزوبروبيل (IPA) والماء والأسيتونيتريل (MeCN) بالتبادل لتسهيل تكوين cryogel (شريط المقياس = 100 أو 50 ميكرومتر كما لوحظ). (ه) قياس قطر الهلام الميكروي HA-NB قبل (الرمادي) وبعد التجفيد (الأخضر) في 70٪ EtOH مبين كتوزيعات متكررة لثلاث مجموعات ميكروجيل. أعيد طبعها من Anderson et ^al.12 بإذن من Elsevier. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. تصنيع سقالة MAP

1. توليف رابط رباعي
   ملاحظة: يمكن استخدام وصلات Tetrazine لربط الميكروجيلات التي تحمل مجموعات نوربورنين الحرة (الشكل 3 أ). تم تكييف إجراء تخليق HA-tetrazine (HA-Tet) من Zhang et al.18 باستخدام 79 كيلو دالتون من الصوديوم HA مع المكافئات المولية من 1: 1: 0.25 من وحدات تكرار HA إلى DMTMM إلى tetrazine-amine (الشكل 3B) ¹².
   1. وزن المتفاعلات. قم بإذابة HA عند 20 مجم / مل في محلول MES 200 mM (درجة الحموضة ~ 6) عن طريق التقليب في دورق أو دورق على طبق تقليب. بمجرد الذوبان ، أضف DMTMM إلى محلول HA واتركه يتفاعل لمدة 20 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام 100 ملغ HA + 72.8 ملغ DMTMM + 14.14 ملغ tetrazine-amine.
   2. قم بإذابة رباعي الأمين عند 15 مجم / مل في محلول MES 200 mM وأضف قطرة قطرة إلى محلول HA / DMTMM. ارجع إلى الشكل 3C لإعداد تفاعل HA-Tet.
   3. أضف البارافيلم إلى فتحة وعاء التفاعل لتقليل التبخر وتغطية وعاء التفاعل بورق الألمنيوم. استمر في التقليب مع السماح للتفاعل بالاستمرار لمدة 24 ساعة تقريبا.
   4. بعد 24 ساعة ، قم بتبريد 200 إيثانول مقاوم (حوالي 10 أضعاف حجم التفاعل). على طبق التحريك ، انقل التفاعل بالتنقيط إلى الإيثانول المبرد لترسيب HA-Tet (الشكل 3D) واستمر في التقليب لمدة 20 دقيقة.
   5. انقل المحلول إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل ، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 5000 × جم لمدة 10 دقائق. اسكب الإيثانول الزائد للتخلص منه كنفايات. اسحب المكنسة الكهربائية على HA-Tet في مجفف لتجف طوال الليل. يمكن العثور على مثال للمنتج المجفف في هذه الخطوة في البروتوكول في الشكل 3E.
   6. تنقية HA-Tet باستخدام غسيل الكلى. قم بإذابة HA-Tet في محلول كلوريد الصوديوم 2 M وانقله إلى أنبوب غسيل الكلى السليلوز مع قطع الوزن الجزيئي 12-14 كيلو دالتون. انقل أنبوب غسيل الكلى المملوء إلى دلو به 5 لتر من الماء عالي النقاء ، وقم بغسيل HA-Tet ضد الماء طوال الليل.
   7. في اليوم التالي ، قم بإزالة الماء واستبدله بمحلول 1 M NaCl لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة محلول كلوريد الصوديوم ، ثم قم بغسيل الكلى ضد الماء عالي النقاء لمدة 3 أيام ، ليحل محل الماء يوميا.
   8. قم بتصفية المنتج الذي تم تحليله باستخدام مرشح مفرغ 0.2 ميكرومتر ، ثم انقل منتج HA-Tet المصفى إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
   9. قم بتجميد الأنابيب المخروطية في النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق ، ثم قم بإزالة الأنابيب المخروطية بالملقط. قم بإزالة الغطاء بسرعة وقم بتغطيته بمنديل من الدرجة المعملية. قم بتأمين المنديل بشريط مطاطي وانقله إلى حاوية أو غرفة تجفيف بالتجميد و lyophilize. قم بتخزين المنتج المجفف بالتجميد (الشكل 3F) في -20 درجة مئوية.
   10. تحديد تعديل التترازين عن طريق إذابة HA-Tet عند 10 مجم / مل في D₂O والتحليل عبر البروتون NMR (الشكل 3G)¹⁶.
       1. لتحديد مقدار الأداء الوظيفي ، قم أولا بمعايرة ذروة مذيب D₂O إلى 4.8 جزء في المليون. دمج ذروة بروتونات ميثيل HA (δ2.05) ومعايرة التكامل إلى 3.0. بعد ذلك ، قم بدمج قمم مجموعات tetrazine المعلقة عند δ8.5 (2H) و δ7.7 (2H) (البروتونات العطرية). تطبيع تكامل هذه القمم مع العدد المقابل من البروتونات لتحديد متوسط درجة التعديل¹².
2. ربط lyo-μgels لتشكيل سقالات MAP للتوصيف
   1. تحضير مكونات سقالة MAP (أي μgels ، HA-Tet ، حجم التهوية). قم بوزن lyo-μgels (الشكل 4 أ) وأعد تكوينه في 84٪ من حجم MAP النهائي البالغ 1x PBS. اترك الهلاميات الدقيقة تنتفخ لمدة 20 دقيقة تقريبا (الشكل 4 ب ، ج). يمكن اختيار WT٪ MAP المستخدم في الإماهة بناء على تفضيل المستخدم لجزء الجسيمات النهائي (راجع الشكل 4D ، E).
   2. قم بإذابة HA-Tet في 1x PBS بالتركيز المختار (انظر الملاحظة أدناه).
      ملاحظة: سيؤدي تغيير كل من جزء التعبئة (عبر wt٪ MAP) وكذلك تركيز HA-Tet إلى تغيير الخواص الميكانيكية للسقالة السائبة. على سبيل المثال ، سقالة MAP بالوزن 3.4٪ متشابكة مع 0.02 مجم / مل HA-Tet (نسبة التلدين 2.6 مول Tet: mol HA-NB) تولد سقالات MAP مع ما يقرب من 700 باسكال معامل تخزين^{القص 12}.
   3. استخدم ماصة الإزاحة للجمع بين HA-Tet و lyo-μgels واخلطها جيدا. في هذه المرحلة ، يمكن نقل الخليط عبر ماصة الإزاحة على شرائح زجاجية أو ألواح بئر أو حاوية من اختيار المستخدم. اترك الميكروجيل يلدن عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة ، ثم استخدم ملعقة لنقل سقالات MAP إلى أطباق جيدة مملوءة ب 1x PBS. احتفظ بسقالات MAP في 1x PBS حتى تصبح جاهزة للتوصيف.
3. حساب جزء جسيمات سقالة MAP
   1. لتحسين جودة الصورة، انقل سقالة MAP إلى غطاء زجاجي باستخدام ملعقة. صورة سقالات MAP على مجهر متحد البؤر باستخدام الليزر لإثارة وانبعاث FITC. سقالات Image MAP على هدف 20x والحصول على مكدس Z يجتاز 250-300 ميكرومتر في الاتجاه Z بحجم خطوة 2.5 ميكرومتر. قم بتدوين معايرة μm / pixel للصورة.
   2. قم باستيراد صورة Z-stack إلى برنامج التحليل (انظر جدول المواد). حدد الزر إضافة أسطح جديدة . حدد المربع لتقسيم منطقة اهتمام فقط، ثم حدد زر السهم الأزرق التالي: منطقة الاهتمام.
   3. حدد منطقة الاهتمام ، وتتبع أبعاد X و Y و Z للحجم الذي يتم تحليله. حدد زر السهم الأزرق التالي: القناة المصدر.
      ملاحظة: الأبعاد X و Y بوحدات البكسل بينما البعد Z هو عدد الخطوات. يجب أن يتضمن ارتفاع Z الموصى به لمنطقة الاهتمام ما لا يقل عن اثنين من μgels.
   4. استخدم القائمة المنسدلة القناة المصدر لتحديد قناة FITC. حدد المربع بجوار أملس وأدخل تفاصيل سطح 2.50 ميكرومتر. ضمن عتبة، حدد الكثافة المطلقة، ثم حدد زر السهم الأزرق التالي: العتبة.
   5. استخدم قيمة العتبة المقترحة لقناة FITC. قم بتدوير إسقاط 3D لتقييم جودة العرض وضبطه حسب الحاجة. حدد التالي: تصنيف الأسطح.
      ملاحظة: يمكن استخدام الزر السابق لتحرير الخطوات السابقة في العملية، مثل البعد Z، حسب الحاجة.
   6. تحقق مما إذا كان عدد Voxels هو 10.0 ، ثم حدد زر السهم المزدوج الأخضر إنهاء: قم بتنفيذ جميع خطوات الإنشاء وإنهاء المعالج.
      ملاحظة: يمكن تخزين معلمات تجسيد الحجم لتحليل الدفعات بحيث يتم تطبيق نفس الإعدادات لتحليل جميع السقالات.
   7. لتصدير البيانات، حدد علامة التبويب إحصائيات ، ثم علامة التبويب مفصل . استخدم المربع المنسدل الثاني لتحديد متغير Volume. حدد زر القرص المرن تصدير الإحصائيات في علامة التبويب عرض إلى ملف وحفظه كملف جدول بيانات (.xls) عندما يطلب منك ذلك.
   8. افتح الملف واستخدم الدالة SUM في العمود A Volume لتحديد الحجم الكلي (ميكرومتر³) للميكروغرام في منطقة الاهتمام.
   9. تحويل أبعاد المنطقة ذات الاهتمام التي تم تحليلها من بكسل إلى ميكرومتر. استخدم معايرة μm / pixel للصورة من الخطوة 4.3.1 لتحويل أبعاد X و Y. اضرب البعد Z (عدد الخطوات) في حجم الخطوة للصورة لتحويل البعد Z إلى μm. احسب حجم منطقة الاهتمام (ميكرومتر³) بضرب أبعاد X و Y و Z.
   10. لتحديد جزء الجسيمات من السقالة ، قسم الحجم الكلي للميكروجيل في منطقة الاهتمام (الموجودة في الخطوة 4.3.8) على حجم منطقة الاهتمام (الموجودة في الخطوة 4.3.9).

الشكل 3: تخليق رابط رباعي الزينة لتصنيع سقالات الجسيمات الملدنة الصغيرة التي يسهل اختراقها (MAP). (أ) رسم تخطيطي لميكروجيلات HA-NB التي يتم ربطها برابط رباعي الأضلاع لتشكيل سقالات MAP. (ب) مخطط التفاعل لتخليق HA-Tet. (ج) تم إعداد تفاعل HA-Tet وسمح له بالتفاعل طوال الليل متبوعا ب (د) ترسيب HA-Tet في الإيثانول. (ه) بمجرد تنقيته وتجفيفه ، تم إعادة ترطيب HA-Tet وتجفيفه بالتجميد لإنتاج (F) منتج وردي فاتح مجفف. (ز) يظهر تحليل الرنين المغناطيسي النووي بالبروتون تعديلا ناجحا ل 11٪ من وحدات تكرار HA. أعيد طبعها من Anderson et ^al.12 بإذن من Elsevier. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: إماهة الهلاميات الدقيقة المجففة بالتجميد لتصنيع سقالة MAP. (أ) إسقاط الكثافة القصوى لل lyo-μgels المجففة (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (ب) بعد التجفيف بالتجميد ، تبين أن معالجة الجفاف في lyo-μgels تستغرق حوالي 20 دقيقة (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (C) يمكن إعادة ترطيب Lyo-μgels بوزن متفاوت٪ MAP لإنتاج كبسولات ميكروجيلية محشورة (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (د) تؤدي زيادة الوزن ٪ MAP عند إعادة إماهة lyo-μgels إلى تغيير جزء الجسيمات في سقالات MAP ، كما هو موضح في شرائح Z المفردة من سقالات MAP وإسقاطات الحجم (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (ه) باستخدام سقالات MAP المحددة من قبل المستخدم ، يمكن تحقيق كسور جسيمات فريدة (NL = μgels غير مجفف بالتجميد). تم إجراء تحليل ANOVA أحادي الاتجاه باستخدام Tukey HSD على العينات (n = 3) ، مع الإبلاغ عن دلالة عند p < 0.05 (*) ، p < 0.01 (**) ، p < 0.005 (***) ، و p < 0.001 (****). أعيد طبعها من Anderson et ^al.12 بإذن من Elsevier. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

5.3D زراعة الخلايا في سقالات الخريطة

1. تحضير أجهزة زراعة الخلايا
   1. لإنشاء جهاز زراعة خلايا مخصص لهذه التجارب (الشكل 5A-C) ، استخدم طابعة ثلاثية الأبعاد لطباعة قالب سلبي باستخدام ملف CAD الموجود في ملف الترميز التكميلي 1.
      ملاحظة: أبعاد جهاز زراعة الخلايا هي كما يلي: 94.9 مم × 94.9 مم × 4.8 مم مع ارتفاع بئر إجمالي 2.6 مم. يبلغ قطر الآبار الداخلية والآبار الخارجية 4 مم و 6 مم على التوالي.
   2. امزج قاعدة المطاط الصناعي polydimethylsiloxane (PDMS) مع عامل المعالجة بنسبة 10: 1 حسب الكتلة. يسكب خليط PDMS في طبق بتري بلاستيكي كبير ويتخلص من الغازات في مجفف لمدة 30 دقيقة تقريبا أو حتى تختفي جميع الفقاعات.
   3. بمجرد اختفاء جميع الفقاعات ، ضع القالب المطبوع 3D بعناية في PDMS لتقليل تكوين فقاعات جديدة. ضعيها في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل لعلاج PDMS.
   4. استخدم سكينا أو شفرة حلاقة لتتبع معلمة جهاز الثقافة برفق ، ثم قم بإزالة القالب بعناية. استخدم لكمة خزعة 4 مم لإزالة أي PDMS من قاع الآبار. قم بقص الأجهزة لتناسب غطاء زجاجي.
      ملاحظة: يمكن أيضا ربط أجهزة زراعة الخلايا بالشرائح الزجاجية ، لكن أغطية الزجاج تعمل على تحسين تصوير العينة.
   5. استخدم الشريط لإزالة الغبار من الجانب السفلي لأجهزة الثقافة. ضع الأغطية الزجاجية النظيفة وأجهزة الاستزراع (الجانب السفلي لأعلى) على طبق ساخن عند 135 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل لإزالة الرطوبة.
   6. في غطاء الدخان ، استخدم مسدس بلازما الإكليل على ارتفاع على كل من الغطاء الزجاجي والجانب السفلي من الجهاز لمدة 30 ثانية ، ثم اربط الأسطح المعالجة معا بسرعة. اضغط برفق لضمان إحكام جيد بين جهاز الثقافة والغطاء الزجاجي.
   7. كرر الخطوة 5.1.6 لجميع الأجهزة ، ثم ضعه في فرن 60 درجة مئوية طوال الليل لتأمين السند. الأوتوكلاف الأجهزة لتعقيمها قبل استخدامها في المختبر.
2. زراعة الخلايا في سقالات MAP
   1. قم بإعداد مكونات سقالة MAP (أي μgels ، HA-Tet ، حجم الوسائط) بناء على جزء الجسيمات المطلوب (راجع الشكل 4D-E). قم بوزن lyo-μgels في غطاء معقم وأعد تكوينه في 84٪ من حجم MAP النهائي لوسائط الخلية بناء على WT٪ MAP المختار. اترك الميكروجيل تنتفخ لمدة 20 دقيقة تقريبا.
      ملاحظة: تتطلب هذه الطرق من المستخدم وزن منتج lyo-microgel لإعادة الجفاف. بالنسبة للكتل الصغيرة (1 ملغ أو أقل) ، يقترح أولا وزن أنبوب التبريد قبل إضافة وتجفيف الميكروجل ، ثم إعادة وزن الأنبوب بعد التجفيد لتحديد كتلة المنتج لتقليل الخطأ.
   2. قم بإذابة HA-Tet في وسائط الخلية في 16٪ من حجم MAP النهائي.
      ملاحظة: يمكن تغيير الخطوات التالية لإعداد الخلايا للبذر في سقالات MAP اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة. في هذا البروتوكول ، نمت خلايا اللحمة المتوسطة للفأر D1 في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع 1٪ بنسلين ستربتومايسين (pen-strep) و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) (انظر جدول المواد). يجب اتباع بروتوكولات زراعة الخلايا الملتصقة القياسية لهذه الخلايا ، مع الحفاظ على المزارع عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ في أوعية الاستزراع المعالجة بزراعة الأنسجة.
   3. بمجرد أن تصل خلايا اللحمة المتوسطة للفأر D1 إلى التقاء 70٪ -80٪ ، استنشق الوسائط واغسل الخلايا باستخدام 1x PBS. ارفع الخلايا بإضافة حجم كاف من 1٪ من التربسين-EDTA لتغطية سطح وعاء زراعة الأنسجة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 دقائق ، ثم إخماد التربسين عن طريق إضافة وسائط DMEM المكملة ب 1٪ من القلم العقدي و 10٪ FBS عند 2x من حجم التربسين-EDTA.
   4. جهاز طرد مركزي لتعليق الخلية عند 100 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لحبيبات الخلايا. قم بشفط الوسائط الطافية وأعد تعليق الخلايا في وسائط DMEM سعة 1 مل مكملة بنسبة 1٪ من التهاب القلم العقدي و 10٪ من FBS.
   5. تأكد من خلط تعليق الخلية جيدا ، ثم انقل 20 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. أضف 20 ميكرولتر من محلول تريبان الأزرق واخلطه جيدا. استخدم 20 ميكرولتر من هذا الخليط لعد الخلايا باستخدام إما مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي مع شرائح غرفة عد الخلايا.
   6. نقل عدد الخلايا اللازمة لبذر 10000 خلية / ميكرولتر MAP إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. جهاز طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا. استنشاق بعناية وسائط الطاف من بيليه الخلية دون استنشاق الخلايا.
   7. أضف μgels و crosslinker إلى بيليه الخلية مع ماصة الإزاحة. تخلط جيدا مع ماصة الإزاحة ، ثم البذور 10 ميكرولتر من الخليط لكل بئر. عند الطلاء ، ماصة في حركة دائرية لتوزيع الخليط بالتساوي في البئر.
   8. اترك الميكروجيل يلدن عند 37 درجة مئوية في حاضنة الخلية لمدة 25 دقيقة قبل إضافة وسائط الخلية لملء الآبار (~ 50 ميكرولتر من الوسائط لكل بئر). الحفاظ على الثقافات 3D عند 37 درجة مئوية وتغيير الوسائط حسب الحاجة. لتجنب استنشاق السقالة عند تغيير الوسائط ، قم بتثبيت طرف الماصة على طول حافة البئر العلوي.
      ملاحظة: عند إضافة أو إزالة السائل من آبار الاستزراع ، ضع نهاية طرف الماصة على الحافة فوق سقالة MAP لتقليل فرصة تعطيل أو شفط السقالة من البئر.
   9. في النقاط الزمنية المطلوبة ، قم بإصلاح العينات عن طريق إزالة الوسائط وإضافة 50 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل العينات 3x مع 50 ميكرولتر من 1x PBS أو المخزن المؤقت المفضل. في هذه المرحلة من البروتوكول ، يمكن اتباع الطرق القياسية للتألق المناعي أو تلطيخ التألق ، باستخدام 50 ميكرولتر لكل بئر حجم العمل.
      ملاحظة: تصف طرق التثبيت وتلطيخ الخلايا هذه على وجه التحديد استخدام بقع الفلورسنت. ومع ذلك ، يمكن إجراء تلطيخ مناعي مع اقتران الأجسام المضادة الأولية و / أو الثانوية في هذه السقالات أيضا باتباع تعليمات الشركة المصنعة باستخدام 50 ميكرولتر كحجم عمل لكل بئر.
   10. خلايا الصورة في سقالات MAP على مجهر متحد البؤر باستخدام هدف 20x والحصول على مكدس Z يجتاز 200-250 ميكرومتر في الاتجاه Z بحجم خطوة 2.5 ميكرومتر. مثال على تلطيخ مضان مع DAPI (صبغة نووية مخففة 1: 1000 في 0.15٪ Triton-X في 1x PBS) و phalloidin-647 (صبغة F-actin مخففة 1:40 في 0.15٪ Triton-X في 1x PBS) موضحة في الشكل 5E ، F مع خلايا D1 ثابتة مستزرعة في سقالات MAP لمدة 3 أيام.
       ملاحظة: تؤدي معالجة الأسطح الزجاجية بالبلازما إلى زيادة المحبة للماء ، والتي ثبت أنها تعزز التصاق الخلايا. من المحتمل أن تلاحظ الخلايا تنتشر على طول قاع آبار زراعة الخلايا ولكن لا ينبغي تضمينها في عدد الخلايا أو القياس الكمي لحجم الخلية لتقييم استجابة الخلية في سقالات MAP.

الشكل 5: زراعة الخلايا في سقالات MAP. (أ) يمكن طباعة قالب إنشاء آبار زراعة الخلايا 3D وصبها باستخدام PDMS. يبلغ قطر القالب بأكمله 95 مم ، وقطر الآبار الكبيرة 6 مم ، وقطر الآبار الداخلية الصغيرة 4 مم. (ب) بمجرد صبها باستخدام PDMS ، يتم ربط أجهزة زراعة الخلايا بالبلازما بأغطية لتحسين قدرات الفحص المجهري. (ج) يصور المقطع العرضي لبئر زراعة الخلايا خزان وسائط الخلية (~ 50 ميكرولتر) وخزان أصغر لبذر سقالة MAP بالخلايا (~ 10 ميكرولتر). (د) تعتمد عملية بذر الخلايا في سقالات MAP أولا على إعادة إماهة lyo-μgels بالوزن المطلوب للمستخدم٪ ، يليها الاختلاط مع الخلايا والرابط المتشابك لربط الميكروجيل. (ه) يمكن تغليف الخلايا في سقالات MAP (خضراء) مع WT٪ MAP متنوعة. الصور التمثيلية هي من اليوم 5 من زراعة الخلايا D1 في سقالات MAP (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (F) تظهر شرائح Z المفردة اختلافات في نمو الخلايا في السقالات التي تضم MAP مختلفة بالوزن (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). أعيد طبعها من Anderson et ^al.12 بإذن من Elsevier. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار تحضير سقالات الجسيمات الملدنة الصغيرة التي يسهل اختراقها (MAP) مع مخطط تشابك متعامد حيوي بالإضافة إلى كسور الجسيمات الخاضعة للرقابة لثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد. أولا ، تم تعديل HA مع مجموعات قلادة نوربورنين لاستخدامها في كل من تكوين microgel والربط لتشكيل سقا?...

Discussion

ثبت أن إنتاج الموائع الدقيقة للكبسولات الهلامية الدقيقة HA-NB يولد هلاميات دقيقة ذات نطاق أضيق لتوزيع الحجم من إنتاج دفعة المستحلب ^3,9. تمت صياغة الكبسولات الهلامية الدقيقة الموصوفة في هذا البروتوكول باستخدام رابط متقاطع قابل للانقسام MMP (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH₂) ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate	BD	309628
5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate	BD	309646
Alexa Fluor 488 C5 maleimide	Invitrogen	A10254	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen	A22287	For staining cell culture samples
Aluminum foil	VWR	89107-726
Biopsy punch with plunger, 1.0 mm	Integra Miltex	69031-01
Biopsy punch, 4 mm	Integra Miltex	33-34
Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped	SAI Infusion Technologies	B23-50
Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm	Corning	CLS430521
Calcium chloride	VWR	1B1110	For microgel washing buffer
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume	Rainin	17008609
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume	Rainin	17008605
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume	Rainin	17008608
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF1000
Centrifuge tube, 15 mL	CELLTREAT	667015B
Centrifuge tube, 50 mL	CELLTREAT	229421
Chloroform, ACS grade, Glass Bottle	Stellar Scientific	CP-C7304	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator	ETP	11011
CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap	Nunc	368632
D1 mouse mesenchymal cells	ATCC	CRL-12424	Example cell line for culture in MAP gels
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	For staining cell culture samples
Deuterium oxide, 99.9 atom% D	Sigma-Aldrich	151882	For NMR spectroscopy
Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off	Spectra/Por	132703	For purifying HA-NB and HA-Tet
Diethyl ether	VWR	BDH1121-4LPC	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Dimethylformamide	Sigma-Aldrich	277056	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM)	TCI-Chemicals	D2919	For modifying HA
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	R0861	Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide)
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	D6429-500ML	For D1 cell culture
EMS Paraformaldehyde, Granular	VWR	100504-162	For making 4% PFA
Ethanol absolute (200 proof)	KOPTEC	89234-850
Fetal bovine serum (FBS)	ATCC	30-2020	For D1 cell culture
Heating Plate	Kopf Instruments	HP-4M
Hemacytometer with coverglass	Daigger Scientific	EF16034F
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg	Contipro	N/A	79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights.
IMARIS Essentials software package	Oxford Instruments	N/A	Microscopy image analysis software
Infusion pump, dual syringe	Chemyx	N/A
Kimwipe	Kimberly-Clark	34120
Laboratory stand with support lab clamp	Geyer	212100
Liquid nitrogen	Airgas	NI 180LT22
Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate	TCI-Chemicals	L0290
Lyophilizer	Labconco	N/A	Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol.
Methyltetrazine-PEG4-maleimide	Kerafast	FCC210	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)	Fisher Scientific	BP300-100	For modifying HA
Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1	VWR	48393-106
Microfluidic device SU8 master wafer	FlowJem		Custom design made either in-house in clean room or outsourced
Mineral oil, heavy	Sigma-Aldrich	330760
MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)	GenScript	N/A
5-Norbornene-2-methylamine	TCI-Chemicals	95-10-3	For HA-NB synthesis
Packing tape	Scotch	3M 1426
Parafilm	Bemis	PM996
PEG(thiol)2	JenKem Technology USA	A4001-1	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL	Thermo Fisher Scientific	15140122	For D1 cell culture
Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm	Corning	351058
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	For washing HMPs
Phosphate buffered saline (PBS) 1x	Gibco	10010023
RainX water repellent glass treatment	Grainger	465D20	Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment
RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2)	GenScript	N/A
Rubber bands	Staples	112417
Sodium chloride	Chem-Impex	30070	For dialysis
Span 80 for synthesis	Sigma-Aldrich	1338-43-8
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Electron Microscopy Science	4019862	polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices
Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter	Cytvia	09-928-066
Tetraview LCD digital microscope	Celestron	44347
Tetrazine-amine HCl salt	Chem-Impex	35098	For HA-Tet synthesis
Triethylamine	Sigma-Aldrich	471283	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Millipore Sigma	51805-45-9
Triton X-100	VWR	97063-864
Trypan blue solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red	Fisher Scientific	25-200-056	For lifting adherent cells to seed in MAP gels
Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in	Thomas Scientific	1204G82
UV curing system controller, LX500 LED	OmniCure	010-00369R
UV curing head, LED spot UV	OmniCure	N/A
UV light meter, Traceable	VWR	61161-386
Vacuum dessicator	Bel-Art	08-594-15C
X-Acto Z Series Precision Utility Knife	Elmer's	XZ3601W