مسبار دقيق للقياس الإشعاعي داخل الأنسجة لقياس الإشعاع في الموقع في الأنسجة الحية

Summary

في هذا البحث ، تم وصف طريقة لقياس الإشراق في الموقع في الأنسجة الحية. يتضمن هذا العمل تفاصيل عن بناء مجسات صغيرة الحجم لقياسات مختلفة للإشعاع والإشعاع ، ويوفر إرشادات لتركيب الأنسجة لتوصيف الإشعاع ، ويحدد الطرق الحسابية لتحليل البيانات الناتجة.

Abstract

تبدو الكائنات الحية معتمة إلى حد كبير لأن طبقات أنسجتها الخارجية تتشتت بقوة للضوء الساقط. عادة ما يكون للصبغات الممتصة بقوة ، مثل الدم ، امتصاص ضيق ، بحيث يمكن أن يكون متوسط المسار الحر للضوء خارج قمم الامتصاص طويلا جدا. نظرا لأن الناس لا يستطيعون الرؤية من خلال الأنسجة ، فإنهم يتخيلون عموما أن الأنسجة مثل الدماغ والدهون والعظام تحتوي على القليل من الضوء أو لا تحتوي على أي ضوء. ومع ذلك ، يتم التعبير عن بروتينات أوبسين المستجيبة للضوء داخل العديد من هذه الأنسجة ، ووظائفها غير مفهومة بشكل جيد. الإشراق الداخلي للأنسجة مهم أيضا لفهم التمثيل الضوئي. على سبيل المثال ، يمتص المحار العملاق بقوة ولكنه يحافظ على عدد كثيف من الطحالب في عمق الأنسجة. يمكن أن يكون انتشار الضوء من خلال أنظمة مثل الرواسب والأغشية الحيوية معقدا ، ويمكن أن تكون هذه المجتمعات مساهما رئيسيا في إنتاجية النظام الإيكولوجي. لذلك ، تم تطوير طريقة لبناء مجسات دقيقة ضوئية لقياس الإشعاع القياسي (تدفق الفوتون يتقاطع مع نقطة) وإشعاع هبوط البئر (تدفق الفوتون الذي يعبر المستوى بشكل عمودي) لفهم هذه الظواهر داخل الأنسجة الحية بشكل أفضل. هذه التقنية قابلة للتتبع أيضا في المختبرات الميدانية. هذه المجسات الدقيقة مصنوعة من ألياف بصرية مسحوبة بالحرارة يتم تثبيتها بعد ذلك في ماصات زجاجية مسحوبة. لتغيير القبول الزاوي للمسبار ، يتم بعد ذلك تثبيت كرة بحجم 10-100 ميكرومتر من الإيبوكسي القابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية الممزوج بثاني أكسيد التيتانيوم في نهاية الألياف المسحوبة والمشذبة. يتم إدخال المسبار في الأنسجة الحية ، ويتم التحكم في موضعه باستخدام micromanipulator. هذه المجسات قادرة على قياس إشعاع الأنسجة في الموقع بدقة مكانية تتراوح بين 10 و 100 ميكرومتر أو على مقياس الخلايا المفردة. تم استخدام هذه المسابير لتوصيف الضوء الذي يصل إلى الخلايا الدهنية وخلايا الدماغ 4 مم تحت جلد الفأر الحي ولتوصيف الضوء الذي يصل إلى أعماق مماثلة داخل أنسجة البطلينوس العملاقة الغنية بالطحالب الحية.

Introduction

والمثير للدهشة أن الحيوانات البرية وسكان المحيطات الضحلة لديهم ما يكفي من الضوء داخل أجسامهم لعلم وظائف الأعضاء البصرية وحتى التمثيل الضوئي. على سبيل المثال ، يتم تخفيف مستويات الضوء في وسط رأس الفأر (خارج نطاقات امتصاص الهيموغلوبين القوية) بثلاثة أو أربعة أوامر من حيث الحجم بالنسبة للعالم الخارجي. هذا هو الفرق تقريبا بين مستويات الإضاءة في الداخل والخارج. لذا ، فإن عتامة الأنسجة أو المواد بسبب التشتت القوي ليست هي نفسها العتامة بسبب امتصاص الضوء القوي. يمكن للضوء أن يستمر في الانتشار لمسافات طويلة في نظام تشتت قوي إلى الأمام ، على غرار الضوء الذي ينتشر عبر الأنظمة المائية ذات التركيزات العالية من الخلايا والجسيمات¹. هذه الملاحظة بارزة بشكل خاص في ضوء حقيقة أن بروتينات الأوبسين يتم التعبير عنها في كل مكان تقريبا في جميع أنسجة جميع الحيوانات. وبالتالي ، من المهم أن نفهم كيف وأين يتم تخفيف الضوء وتشتيته داخل الأنسجة الحية. ومع ذلك ، على عكس الأنظمة المائية ، مع الأنسجة الحية ، من المستحيل غمر أداة في عمود الماء والحصول على قياسات الإشعاع والإشعاع ، ومن الضروري استخدام تقنية جديدة.

تشمل الطرق الأخرى المستخدمة سابقا لتوصيف خصائص الامتصاص والتشتت للأنسجة الحية قياس مجسات انعكاس الأنسجة و / أو دمج المجالات²،³ ، والطرق المجهرية مثل المسح المجهري متحد البؤر⁴ ، وقياس انتشار ضوء الليزر على السطح^{5 ،} وتقنيات النمذجة مثل النقل الإشعاعي لمونت كارلو⁶. غالبا ما تتطلب الطرق التجريبية المذكورة معدات محددة وكبيرة ومكلفة أو معرفة مفصلة حول بنية الأنسجة وهي محدودة بشكل عام في قدرتها على توصيف البنية المكانية للضوء في عمق الأنسجة.

هناك أيضا طرق مماثلة قائمة على المسبار تستخدم إبرة تحت الجلد لإدخال ألياف بصرية من خلال الأنسجة⁷،^8،9. في تجربتنا ، الإبر المعدلة فعالة في ثقب الأنسجة ولكنها تتطلب قوة كبيرة وتمزق الأنسجة الحساسة بشكل عام عند المرور عبر الخلايا المعبأة بكثافة. لذلك ، تتطلب هذه الإبر عموما إجراء جراحيا لإدخال أكثر من ملليمتر أو نحو ذلك في طبقة الأنسجة. الطريقة الموصوفة هنا ، باستخدام دعامة زجاجية مشحمة ومسحوبة ، قادرة على الانزلاق بين الخلايا مع الحد الأدنى من جرح الأنسجة وبدون جراحة إضافية.

تقدم هذه المخطوطة طريقة مستوحاة من عمل يورغنسون وزملائه على قياس الضوء داخل حصائر الطحالب¹⁰،^11، باستخدام مجسات مجهرية بصرية مدعومة بالزجاج وإلكترونيات محمولة قابلة للسبر العميق في الأنسجة الكثيفة والبناء والاستخدام في هذا المجال. يمكن بناء هذه المجسات لتوصيف الإشعاع القياسي (الضوء الذي يضرب نقطة من جميع الاتجاهات) وإشعاع هبوط القاع (الضوء الذي يتقاطع مع مستوى أفقي) داخل الأنسجة الحية بدقة مكانية عالية. تم تطوير هذه المسابير في الأصل لقياس الانتقال الإشعاعي داخل أنسجة المحار العملاق الضوئي¹². لم تكن القياسات القياسية لامتصاص وانتقال الأنسجة الكلية كافية لتوصيف أداء التمثيل الضوئي للأنسجة ، لأنه يحدث فرقا كبيرا سواء تم امتصاص كل الضوء الساقط من قبل عدد قليل من الخلايا التي تعاني من كثافة عالية على سطح النسيج أو العديد من الخلايا التي تعاني من كثافة منخفضة في جميع أنحاء حجم النسيج. في مشروع ثان ، تم استخدام هذه المجسات لقياس الإشعاع في الجسم الحي داخل دماغ الفأر^13,14 ، وبالتالي تمييز البيئة الضوئية للأوبسينات المعبر عنها في أعماق الدماغ. هذه المجسات الدقيقة صغيرة وحساسة بما يكفي لقياس الإشعاع داخل أنسجة دماغ الفأر مع سلامة جميع الفراء والجلد والعظام وإثبات أن مستويات الضوء الفسيولوجي مرتفعة بسهولة بما يكفي لتحفيز عمليات الدماغ العميقة.

يمكن أن يكون هذا المسبار البصري الدقيق وإعداد القياس مفيدا للباحثين الذين يحتاجون إلى تحديد وتوصيف الضوء الداخلي للأنسجة البيولوجية ، خاصة من أجل فهم أكثر دقة لعملية التمثيل الضوئي أو وظائف الأصباغ البصرية المعبر عنها خارج العينين. يمكن استخدام هذه الطريقة بمفردها أو بالاقتران مع تقنيات أخرى لتوصيف الخصائص البصرية وانتشار الضوء داخل الأنسجة الحية بشكل كامل بتكلفة منخفضة ، مع معدات محمولة صغيرة مدمجة داخليا وذات معلمات قابلة للتعديل تعتمد على المهام.

Protocol

تتوافق هذه الدراسة مع جميع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة بجامعة ييل فيما يتعلق بأبحاث الحيوانات الفقارية واللافقارية.

1. بناء المسبار البصري الدقيق

1. بناء الغلاف الزجاجي ، المادة: ماصة باستور ، 5.75 بوصة (انظر جدول المواد)
   1. باستخدام مشبك تمساح قابل للتركيب (جدول المواد) ، قم بتركيب الماصة الزجاجية من الطرف العريض بحيث يكون الطرف المدبب متجها لأسفل نحو الأرض ويكون اتجاه الماصة عموديا على الأرض.
   2. قبضة بلاستيكية 50 جم (جدول المواد) من الطرف المدبب للماصة. ضع وسادة من الشريط الكهربائي بين الماصة ومقبض الرذيلة للمساعدة في منع الانزلاق.
   3. قم بتسخين الطرف المدبب من الماصة باستخدام شعلة البوتان الصغيرة (جدول المواد). ضع اللهب 1 سم فوق قبضة الرذيلة. امسك الشعلة بحيث يكون ألمع جزء من اللهب على بعد 3 سم من الزجاج والزجاج عند طرف اللهب. عندما يزداد طول الماصة بحوالي 5 بوصات ، قم بإزالة اللهب على الفور.
   4. استخدم مقصا صغيرا أو قاطعا زجاجيا لتقليم الطرف المسحوب من الماصة عند النقطة التي يكون فيها القطر المسحوب الجديد ضعف قطر الألياف الضوئية المستخدمة في القسم التالي تقريبا (انظر الخطوة 1.2). قم بحفظ أي مناطق حادة من الطرف المشذب باستخدام ورق الكربوروندوم (جدول المواد). اشطف أي شظايا زجاجية صغيرة ناتجة أو غبار باستخدام زجاجة بخ من كحول الأيزوبروبيل متبوعة بالهواء المضغوط.
2. سحب الألياف الضوئية (الشكل 1 د)
   1. استخدم شفرة حلاقة لقطع الألياف الضوئية ، وإزالة موصل SMA واحد من الألياف الضوئية المنتهية SMA بقطر 200 ميكرومتر (جدول المواد). قطع بالقرب من أحد نهايات SMA. بعد ذلك ، استخدم شفرة الحلاقة لإزالة 5 سم التالية من الغلاف البلاستيكي والألياف الزجاجية بحيث تتعرض الألياف الضوئية العارية وتبرز من بقية المجموعة السليمة.
   2. استخدم شعلة البوتان لحرق طلاء بوليمر بوليميد من الألياف الزجاجية. شطف مع الأيزوبروبانول. امسح الألياف الزجاجية العارية نظيفة باستخدام منديل خال من النسالة.
   3. الخطوة التالية هي تركيب الألياف العارية بحيث يمكن أيضا سحبها باللهب. قم بتركيب الطرف العاري للألياف الضوئية مباشرة في مشبك ذو طيات (جدول المواد) على طاولة أو حافة رف ، مع ترك الطرف المنتهي من SMA للألياف يتدلى نحو الأرض. أضف الأوزان للسحب على شكل مشبكين صغيرين (الوزن الإجمالي: 10 جم) على الطرف المغلف للألياف حوالي 12 بوصة لأسفل من حيث يتم تثبيت الألياف الضوئية العارية في المشبك ذو الكماة.
   4. لسحب الألياف ، ابدأ بشعلة شعلة البوتان. مع تشغيل اللهب ، أمسك شعلة البوتان على بعد 1 سم من الألياف العارية بحيث يكون اللهب عموديا على الألياف الضوئية و 3 سم لأسفل عموديا من حيث يحمل المشبك ذو الكماشة الألياف العارية. اسمح للألياف بالتمدد والسحب والانفصال والسقوط على الأرض.
   5. افحص نهاية الألياف الضوئية المسحوبة الناتجة. قم بصنفرة أي مخالفات برفق باستخدام ورق الكربوروندوم ، ونظف بكحول الأيزوبروبيل ومنديل خال من النسالة ، وجففه بالهواء المضغوط.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن للمرء استخدام المجهر لتوصيف وتوثيق حجم وشكل الألياف المسحوبة.
   6. استخدم قلما معتما للفيلم لتغميق جوانب الألياف ومنع دخول الضوء الشارد (جدول المواد). اسحب الألياف برفق عبر طرف القلم ، مع ترك مساحة صغيرة فقط عند الطرف مكشوفة.
3. تركيب الألياف المسحوبة داخل غلاف الماصة الزجاجي (الشكل 1 أ)
   1. من خلال العمل تحت المجهر المجسم ، أدخل بعناية الألياف الضوئية المدببة من الخطوة 1.2 في الطرف العريض من الماصة الزجاجية المعدلة من الخطوة 1.1 ، وادفع الألياف حتى ~ 1 مم من الألياف العارية تخرج من الطرف المدبب للماصة.
   2. باستخدام الشريط الكهربائي ، قم بتأمين الطرف المغلف من الألياف الضوئية إلى الطرف العريض من الماصة.
   3. ضع قطرة من لاصق cyanoacrylate على إبرة صغيرة (جدول المواد). المس بعناية قطرة المادة اللاصقة على الحافة المقطوعة للماصة المسحوبة ، وتجنب النهاية العارية للألياف المسحوبة.
   4. اسمح للعمل الشعري بفتل المادة اللاصقة في الماصة ، مما يؤدي إلى ترطيب المنطقة الواقعة بين جدار الماصة والألياف الضوئية. اترك المادة اللاصقة تعالج لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل تحريك مجموعة المسبار.
4. تعديل طرف الألياف بكرة تشتت (الشكل 1C)
   1. قم بإنشاء المادة الخام لطرف الكرة المتناثر عن طريق خلط قطرة من مادة لاصقة قابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية مع مسحوق ثاني أكسيد التيتانيوم (جدول المواد) عند ~ 1: 1 فولت / حجم.
   2. قم بتوصيل المسبار بجهاز مناولة دقيقة بحامل قضيب تثبيت (جدول المواد) بحيث يكون المسبار في اتجاه أفقي. قم بإعداد خزان عامل لمادة التشتت عن طريق غمس طرف سلك أو إبرة في خليط المادة اللاصقة / TiO₂ المحضر أعلاه بحيث تتشكل قطرة من المادة اللاصقة. قم بتركيب السلك أو الإبرة مع القطرة بالقرب من طرف المسبار الأفقي. من الملائم القيام بذلك باستخدام مشبك تمساح مثبت على المقعد.
   3. إيداع كرة مبعثرة على طرف المسبار. استخدم المعالج الدقيق لدفع طرف الألياف الضوئية للمسبار ببطء وبعناية إلى قطرة المادة اللاصقة / TiO₂. ثم ، اسحب الحافة بسرعة من الغراء. كرر مرتين إلى ثلاث مرات حتى يتم ترسيب قطرة كروية من المادة اللاصقة بالحجم المطلوب على طرف الألياف الضوئية.
      ملاحظة: ستكون كرة التشتت مستقرة بأقطار أكبر من مرتين إلى ثماني مرات من قطر الألياف الضوئية المدببة. يعتمد الحجم الأمثل النهائي على التطبيق النهائي المطلوب.
   4. عالج الكرة عن طريق توصيل الطرف المنتهي SMA للألياف الضوئية بمصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية المقترن بالألياف (جدول المواد).
      ملاحظة: كان مصدر الضوء المستخدم في هذه الدراسة بقوة 5.3 ميغاواط. عند هذه القوة ، يكون وقت العلاج الموصى به 12 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها. بعد المعالجة هو الوقت المناسب لتوصيف وقياس حجم طرف المسبار البصري النهائي.

2. تحضير وتركيب الأنسجة للقياسات البصرية (الشكل 2 والشكل 3)

1. تحضير الأطباق لتركيب العينات للتجربة. قم بتسخين الطرف الكبير من ماصة باستور باستخدام شعلة البوتان لعمل ثقب لإذابة ثقب قطره 0.5 سم في قاع طبق بتري بلاستيكي 35 مم × 10 مم. أغلق الفتحة الموجودة على الجانب السفلي من الطبق بشريط كهربائي أو شريط مختبر. اصنع عدة في وقت واحد لتحقيق الكفاءة.
2. تحضير الجيلاتين السائل (جدول المواد) وفقا للتعليمات الموجودة على العبوة.
   ملاحظة: الجيلاتين التجاري عديم النكهة من متجر البقالة أفضل لهذا الغرض من الجيلاتين الكيميائي من موردي المواد الكيميائية لأن الجيلاتين الكيميائي أقل وضوحا بصريا وأقل موثوقية ميكانيكيا من المنتج الغذائي.
3. أداء تشريح وإعداد الأنسجة التي سيتم استخدامها.
   ملاحظة: من التجربة ، يمكن قياس أي نسيج مسطح يصل سمكه إلى 1 سم بنجاح في هذه التجربة باستخدام أي تقنية تشريح مناسبة لنظام الاهتمام. بالنسبة لأنسجة البطلينوس العملاقة ، تم استخدام خزعة 8 مم لعمل دائرة مسطحة ومنتظمة من أنسجة البطلينوس لاستخدامها في التجربة¹². بالنسبة لهذا النظام ، يمكن تحضير عينة واحدة فقط بشكل فعال في كل مرة نظرا لطول الوقت اللازم لإكمال القياس للتأكد من أن العينة لا تزال في حالة نابضة بالحياة في نهاية التجربة.
4. املأ طبقين من طبق بتري من الخطوة 2.1 ربع الطريق بالجيلاتين السائل ، واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل قليل من الهلام. في طبق واحد ، ضع الخزعة في وسادة الجيلاتين اللزج الذي يتشكل في الفتحة الموجودة في قاع الطبق. استخدم ماصة باستور لإضافة جيلاتين RT برفق حول الخزعة حتى يمتلئ طبق بتري (الشكل 3). املأ الطبق الثاني بالجيلاتين لعمل عينة فارغة.
5. ضع أطباق العينة في الثلاجة لمدة 10-30 دقيقة حتى يتم علاج الجيلاتين بالكامل ومرونة طفيفة عند لمسها.
   ملاحظة: في غرفة باردة ، قد لا يكون هذا ضروريا ؛ عند العمل في المناطق الاستوائية ، هذه الخطوة مطلوبة لعلاج الجيلاتين بالكامل.
6. صنع حامل لطبق بتري على المناور الدقيق (الشكل 2)
   1. قطع مربع 6 سم × 6 سم من 1/4 في زجاج شبكي سميك (جدول المواد).
   2. حفر أو إذابة حفرة في مربع البلاستيك بنفس قطر طبق بتري (~ 35 مم). تأكد من أن طبق بتري يناسب هذه الحفرة بشكل مريح ويتم تثبيته في مكانه مع الاحتكاك. أضف شريطا إلى حواف الطبق لزيادة الحجم والاتصال الاحتكاكي قليلا.
   3. حفر أو إذابة حفرة قطرها 1/4 في زاوية المربع البلاستيكي. استخدم هذه الفتحة لربط المربع بالمناور الدقيق باستخدام 1/4 بوصة برغي ومسمار.
   4. قم بتغطية المربع البلاستيكي بشريط كهربائي أسود لتقليل الضوء الشارد الذي يصل إلى المسبار. وبالمثل ، استخدم الشريط لإنشاء تنورة حول جوانب المربع تمتد أسفل الجزء السفلي من الطبق المدرج (>10 مم) لتقليل الضوء الشارد (الشكل 2 ب).
   5. استخدم مسمارا وأجهزة مناسبة لتوصيل حامل أطباق بتري بمعالج دقيق يسمح بإجراء تعديلات ثلاثية الأبعاد وحركة رأسية جيدة الحل على مدى أكبر من سمك العينات (الجزء 1 والجزء 2 من المناور المذكور في جدول المواد أمثلة جيدة). قم بتثبيت هذا المكيف الدقيق على لوح تجارب بصري.

3. إعداد القياس لخزعات الأنسجة

1. قم بتركيب مصدر ضوء فوق المنطقة التي يتم فيها القياس بحيث يتم موازاة الضوء عندما يصل إلى المستوى حيث سيتم وضع العينة (الشكل 2 أ). على سبيل المثال ، قم بتوصيل عدسة موازية مقاس 5 سم (جدول المواد) بدليل ضوء سائل 5 مم (جدول المواد) ، وارفعها فوق العينة بمقدار >0.6 متر باستخدام رذيلة وإطار متصلين بلوح تجارب بصري (جدول المواد). بعد ذلك، قم بتوصيل دليل الضوء بمصدر ضوء واسع النطاق، مثل مصدر ضوء البلازما المدرج في جدول المواد.
2. قم بتوصيل المسبار بحامل موجه رأسيا بحيث يشير نحو مصدر الضوء. قم بتأمين المسبار بمشابك أو مشابك خرطوم أو شريط لاصق على عمود طاولة بصري.
   ملاحظة: في تجربة البطلينوس العملاق، يتم استخدام حامل قضيب مصمم خصيصا، مثل المناور الدقيق المدرج في جدول المواد. في هذا العمل ، تم تأمينه بواسطة مغناطيس إلى لوح بصري (جدول المواد). درجات الحرية الإضافية للمحاذاة التي تم الحصول عليها من خلال وجود كل من المسبار والعينة على المتلاعبين مريحة ولكنها ليست مطلوبة. احرص على عدم الإفراط في التثبيت على المنشور ، لأن هذا يمكن أن يكسر غلاف الماصة.
3. ضع مناور العينة بالقرب من المسبار المثبت رأسيا. استخدم مناور العينة لضبط موضع مرحلة العينة بحيث يتمركز المسبار في فتحة 0.5 سم في الجزء السفلي من طبق بتري. توخ الحذر الشديد لتجنب لمس طرف المسبار المثبت أو ارتطامه.
   ملاحظة: يمكن أن يكون المجهر المجسم المثبت على ذراع الرافعة موضوعا فوق منطقة العينة مفيدا. بهذه الطريقة ، يمكن عرض المحاذاة من أعلى إلى أسفل لطرف المسبار والمرحلة والعينة قبل بدء التجربة (الشكل 2 أ).
4. قم بتوصيل الطرف المنتهي ب SMA للألياف الضوئية للمسبار بمطياف الألياف الضوئية USB (جدول المواد) ، وقم بتوصيل مقياس الطيف بالكمبيوتر باستخدام كابل USB.

4. جمع البيانات

1. الإعداد التجريبي
   1. اجعل المسبار والمتلاعبين في الموضع المحاذي الدقيق الذي سيتم فيه جمع البيانات ، كما في الخطوة 3.4.
   2. استخدم قطعة قطن أو إبرة قياس دقيقة لتطبيق كمية صغيرة من مواد تشحيم السيليكون بعناية (جدول المواد) على جزء المسبار الذي سيتم إدخاله في الأنسجة لتقليل الاحتكاك بين جوانب المسبار وعينة الأنسجة. أعد وضع مادة تشحيم السيليكون قبل كل قياس لخط الأساس أو الأنسجة.
   3. قم بإزالة الشريط الذي يغطي الفتحة الموجودة في طبق بتري للعينة الفارغة ، وضعه في حامل العينة (الخطوة 2.7) ، مع التأكد من تثبيته بإحكام في مكانه عن طريق الاحتكاك.
   4. استخدم المعالج الدقيق لخفض العينة على المسبار. اسمح للمسبار بدخول الجيلاتين عبر الفتحة الموجودة على الجانب السفلي من طبق بتري. استمر حتى يصبح المسبار حوالي 5 مم من أسفل طبقة الجيلاتين.
   5. قم بتشغيل مصدر الضوء. باستخدام برنامج مقياس الطيف ، اضبط وقت تكامل مقياس الطيف حتى تكون الإشارة عالية قدر الإمكان ولكنها غير مشبعة. اضبط متوسط عدد عمليات المسح الضوئي بين اثنين وخمسة وقيمة وحدات بكسل التجانس على ستة. يمكن أن تختلف أوقات التكامل القابلة للاستخدام في هذه المرحلة بين 1-50 مللي ثانية لهذا خط الأساس.
2. جمع الأطياف المرجعية
   1. جمع قياس الظلام.
      1. بمجرد ضبط معلمات مقياس الطيف مع العينة الفارغة ، افصل ألياف المسبار عن مقياس الطيف ، وقم بتغطية المنفذ بالغطاء المعدني غير الشفاف المرفق مع مقياس الطيف.
      2. احصل على قياس مظلم من مقياس الطيف (غالبا باستخدام رمز المصباح الداكن في واجهة المستخدم الرسومية) لتوصيف ضوضاء مقياس الطيف بدون ضوء دخل. احفظ هذا القياس وفقا لاستراتيجية الحصول على البيانات.
   2. جمع قياس المصباح. أعد توصيل ألياف المسبار بمقياس الطيف ، وانتظر حتى تستقر الإشارة ، واحصل على طيف آخر. يميز هذا القياس الضوء الذي يصل إلى المسبار من خلال الجيلاتين في غياب الأنسجة.
3. جمع أطياف الأنسجة
   1. قم بإزالة الشريط الموجود أسفل طبق بتري الخاص بالعينة، وضعه في حامل العينة.
   2. قم بمحاذاة طبق العينة مع المسبار باستخدام معالجة ثلاثية الأبعاد بحيث تتمركز خزعة الأنسجة فوق طرف المسبار.
   3. ضع هلام السيليكون على المسبار (انظر 4.1.2) ، وقم بخفض العينة ببطء على المسبار حتى يمر طرف المسبار عبر الجيلاتين الذي يدعم عينة الأنسجة ويدخل للتو عينة الأنسجة.
      ملاحظة: تسمح بعض أجهزة قياس الطيف وبرامج الكمبيوتر بمراقبة الضوء المكتشف في الوقت الفعلي. استخدم هذا لتحديد متى يدخل المسبار الأنسجة. ستنخفض شدة الطيف فجأة بمجرد أن يكون طرف المسبار على اتصال مباشر بالأنسجة.
   4. تحقق من أن وقت التكامل مناسب للقياس من خلال التأكد من أن الطيف المقاس ليس صاخبا جدا ولا مشبعا. قم بتغيير وقت التكامل إذا لزم الأمر.
      1. في أي وقت يتم ضبط وقت التكامل ، قم بإجراء وتخزين قياس مظلم جديد (الخطوة 4.2.1). لا تقم بتغيير عدد عمليات المسح الضوئي المتوسطة أو عدد وحدات البكسل الناعمة.
      2. بعد العثور على معلمات القياس المناسبة ، خذ القياسات واحفظ الطيف.
   5. حرك العينة لأسفل مسافة محددة باستخدام المعالج الدقيق. بالنسبة للمناور المستخدم في هذه الدراسة ، كانت كل علامة علامة صغيرة 0.001 بوصة أو 25.4 ميكرومتر. تم نقل العينة لأسفل من خلال خمس علامات تجزئة ، أو 127 ميكرومتر ، لكل قياس. كرر الخطوة 4.3.4.
   6. استمر في حفظ الأطياف في كل موضع رأسي داخل الأنسجة.
      ملاحظة: بالنسبة للنظام الموصوف هنا ، تراوحت أوقات التكامل المطلوبة بين 1 مللي ثانية إلى 5 ثوان للقياسات داخل عينة نسيج واحدة. في النهاية ، سيخرج طرف المسبار من الجزء العلوي من الأنسجة ويكون مرئيا هناك (الشكل 4 أ). هذا هو القياس النهائي ويميز الضوء الساقط في الجزء العلوي من الأنسجة.
4. تحميل ومعالجة البيانات
   1. استخدم برنامج مقياس الطيف لتحويل جميع الأطياف المجمعة (الأطياف المظلمة وأطياف المصباح وقياسات الأنسجة) إلى ملفات نصية محددة.
   2. باستخدام Matlab أو لغة ترميز من اختيارك ، قم بتحميل جميع ملفات القياس للعينة. لكل طيف قياس الأنسجة ، اطرح الطيف المظلم مع وقت التكامل المطابق ، ثم قسمه على وقت التكامل.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام نص Matlab لتحميل ومعالجة البيانات (الملف التكميلي 1).
   3. احسب النسبة المئوية للضوء الساقط الذي يصل إلى كل موضع في الأنسجة بقسمة الأطياف التي تم الحصول عليها باستخدام المسبار داخل النسيج على طيف خط الأساس الذي تم الحصول عليه في الجيلاتين الفارغ.
      ملاحظة: يجب أن يكون القياس في الجزء العلوي من النسيج (الخطوة 4.3.6) مشابها جدا لقياس خط الأساس في الجيلاتين (الخطوة 4.1) ، وعند تقسيمه ، يجب أن يكون قريبا من 100٪. اعتمادا على السياق التجريبي ، يمكن استخدام طيف المصباح (الطيف من الجيلاتين الفارغ أو ذلك من أعلى الأنسجة) كمرجع. ومع ذلك ، لا يزال من المهم جمع طيف المصباح قبل بدء التجربة. هذا لأنه إذا انكسر المسبار أو فشلت التجربة بطريقة أخرى قبل الوصول إلى الجزء العلوي من الأنسجة ، فإن البيانات التي تم الحصول عليها قبل الفشل لا تزال قابلة للاستخدام ، وهذا ليس هو الحال إذا لم يكن هناك طيف مرجعي أولي مطابق للمصباح.
   4. تصور البيانات ؛ يمكن أن تكون المؤامرات الكنتورية مفيدة (الشكل 4 ب).

النتائج

يصف هذا البروتوكول الإجراء الخاص ببناء مسبار بصري دقيق يمكن استخدامه لقياس إشعاع هبوط القاع (وصول الضوء إلى نقطة من اتجاه واحد) أو ، مع إضافة طرف كروي مشتت للضوء ، لقياس الإشعاع القياسي (الضوء الذي يصل إلى نقطة من جميع الاتجاهات). يمكن لهذه المجسات قياس الإشعاع بدقة مكانية تقترب من مقاييس ط?...

Discussion

يصف هذا البروتوكول تقنية لتوصيف البيئة البصرية بشكل منهجي من خلال حجم كبير من الأنسجة الحية بدقة مكانية تقريبا على نطاق الخلايا المفردة. يمكن أن تكون هذه الطريقة غير المكلفة والمرنة والقابلة للتتبع الميداني مفيدة لأي باحث يدرس انتشار الضوء داخل الأنظمة الحية. من التجربة ، مقارنة بالطرق ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere