JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يناقش هذا البروتوكول نهجا لتوليد العضويات الظهارية من الأنسجة الثديية الطبيعية الأولية والأورام من خلال الطرد المركزي التفاضلي. علاوة على ذلك ، يتم تضمين تعليمات للزراعة ثلاثية الأبعاد وكذلك التصوير المناعي للعضويات المدمجة.

Abstract

تعتبر المواد العضوية طريقة موثوقة لنمذجة أنسجة الأعضاء نظرا لخصائصها ذاتية التنظيم والاحتفاظ بالوظيفة والبنية بعد الانتشار من الأنسجة الأولية أو الخلايا الجذعية. تتخلى طريقة توليد الخلايا العضوية هذه عن تمايز الخلية الواحدة من خلال ممرات متعددة وتستخدم بدلا من ذلك الطرد المركزي التفاضلي لعزل الكائنات العضوية الظهارية الثديية عن الأنسجة المنفصلة ميكانيكيا وإنزيميا. يوفر هذا البروتوكول تقنية مبسطة لإنتاج المواد العضوية الظهارية الصغيرة والكبيرة بسرعة من كل من أنسجة الفئران والأنسجة الثديية البشرية بالإضافة إلى تقنيات التضمين العضوي في الكولاجين والمصفوفة خارج الخلية القاعدية. علاوة على ذلك ، يتم توفير تعليمات للتثبيت داخل الهلام وتلطيخ الفلورسنت المناعي لغرض تصور مورفولوجيا العضوية وكثافتها. هذه المنهجيات مناسبة لعدد لا يحصى من التحليلات النهائية ، مثل الزراعة المشتركة مع الخلايا المناعية ونمذجة ورم خبيث خارج الجسم الحي عبر مقايسة غزو الكولاجين. تعمل هذه التحليلات على توضيح سلوك الخلايا الخلوية بشكل أفضل وخلق فهم أكثر اكتمالا للتفاعلات داخل البيئة المكروية للورم.

Introduction

كانت القدرة على نمذجة الخلايا الظهارية في المختبر أساس البحوث الطبية الحيوية الحديثة لأنها تلتقط الميزات الخلوية التي لا يمكن الوصول إليها في الجسم الحي. على سبيل المثال ، يمكن أن توفر خطوط الخلايا الظهارية المتنامية في مستوى ثنائي الأبعاد تقييما للتغيرات الجزيئية التي تحدث في الخلية الظهارية أثناء الانتشار1. علاوة على ذلك ، فإن قياس التنظيم الديناميكي بين الإشارات والتعبير الجيني محدود في أنظمة الجسم الحي 2. في أبحاث السرطان ، مكنت نمذجة خط الخلايا الظهارية السرطانية من تحديد الدوافع الجزيئية لتطور المرض وأهداف الأدوية المحتملة3. ومع ذلك ، فإن نمو خطوط الخلايا الظهارية السرطانية على مستوى ثنائي الأبعاد له قيود ، حيث أن معظمها يتم تخليده وتعديله وراثيا ، وغالبا ما يكون نسيليا بطبيعته ، ويتم اختياره لقدرته على النمو في ظروف غير فسيولوجية ، ومحدود في تقييمه لبنية أنسجة الورم ثلاثية الأبعاد (3D) ، ولا يقوم بنمذجة تفاعلات البيئة المكروية بشكل كاف داخل بيئة أنسجة واقعية4. هذه القيود واضحة بشكل خاص في نمذجة ورم خبيث ، والذي يتضمن في الجسم الحي عدة مراحل بيولوجية متميزة ، بما في ذلك الغزو والانتشار والدورة الدموية والاستعمار في موقع العضو البعيد5.

تم تطوير الكائنات العضوية الظهارية للسرطان لتلخيص بيئة 3D وسلوك الأورام6،7،8 بشكل أفضل. تم تطوير المواد العضوية لأول مرة من خلايا سرداب معوية LRG5 + مفردة ومتباينة لتمثيل البنية ثلاثية الأبعاد لوحدات crypt-villus التي حافظت على الهيكل الهرمي للأمعاء الدقيقة في المختبر9. سمح هذا النهج بالتصور والتوصيف في الوقت الفعلي لبنية الأنسجة ذاتية التنظيم في ظل ظروف الاستتباب والإجهاد. كامتداد طبيعي ، تم تطوير العضويات الظهارية للسرطان لنمذجة العديد من أنواع السرطان المختلفة ، بما في ذلك القولون والمستقيم 10 ، والبنكرياس 11 ، والثدي 12 ، والكبد 13 ، والرئة 14 ، والدماغ 15 ، وسرطان المعدة 16. تم استغلال العضويات الظهارية السرطانية لتوصيف تطور السرطان17,18 والسلوكيات الزمانية المكانيةالنقيلي 19,20 واستجواب عدم تجانس الورم 21 ، واختبار العلاجات الكيميائية 22. كما تم عزل الكائنات العضوية الظهارية للسرطان وجمعها خلال التجارب السريرية الجارية للتنبؤ باستجابة المريض للعوامل المضادة للسرطان والعلاج الإشعاعي خارج الجسم الحي8،23،24،25. علاوة على ذلك ، يمكن دمج الأنظمة التي تتضمن عضويات ظهارية سرطانية مع خلايا أخرى غير سرطانية ، مثل الخلايا المناعية ، لتشكيل نموذج أكثر شمولا للبيئة المكروية للورم لتصور التفاعلات في الوقت الفعلي ، والكشف عن كيفية تغيير الخلايا الظهارية السرطانية للطبيعة الأساسية للخلايا المناعية المستجيبة السامة للخلايا مثل الخلايا القاتلة الطبيعية ، واختبار العلاجات المناعية المحتملة والنشاط السام للخلايا المعتمد على الأجسام المضادة26 ، 27,28. توضح هذه المقالة طريقة لتوليد المواد العضوية الظهارية دون المرور والتضمين في الكولاجين والمصفوفة خارج الخلية القاعدية (ECM). بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا مشاركة تقنيات التصوير النهائي للعضويات المعزولة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم جمع جميع أنسجة الفئران المستخدمة في هذه المخطوطة بشكل أخلاقي وفقا للوائح وإرشادات اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) للمركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس. وبالمثل ، وافق جميع المرضى قبل التبرع بالأنسجة تحت إشراف مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) ، وتم تحديد العينات.

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول توليد المواد العضوية من الأنسجة الأولية.

1. إعداد المواد بين عشية وضحاها

  1. للتضمين في المصفوفة خارج الخلية في الطابق السفلي (BECM) ، قم بإذابة قسامة BECM عن طريق تركها عند 4 درجات مئوية.

2. تحضير محلول طلاء كولاجيناز وألبومين مصل البقر (BSA)

  1. تحضير محلول طلاء 2.64٪ BSA / PBS (محلول BSA): مرشح معقم 50 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) و 4.10 مل من محلول BSA 30٪ باستخدام دورق مرشح 50 مل / 0.2 ميكرومتر. يمكن تصفية حل BSA هذا واستخدامه مرة أخرى.
  2. تحضير محلول كولاجيناز للأنسجة الثديية للفئران: مرشح معقم 27 مل من وسط الخلايا القاعدية ، 1.5 مل من مصل الجنين البقري (FBS) ، 30 ميكرولتر من 50 مجم / مل جنتاميسين ، 15 ميكرولتر من 10 مجم / مل أنسولين ، 600 ميكرولتر من 0.1 جم / مل كولاجيناز أ ، و 600 ميكرولتر من 0.1 جم / مل من التربسين باستخدام دورق مرشح 50 مل / 0.2 ميكرومتر. خصص ما بين 10 مل و 30 مل من محلول كولاجيناز لكل ماوس ، اعتمادا على كتلة الأنسجة.
  3. تحضير محلول كولاجيناز لأنسجة الثدي البشرية: مرشح معقم 18 مل من RPMI-1640 ، 200 ميكرولتر من محلول 100x البنسلين والستربتومايسين (قلم / جرطة) ، 200 ميكرولتر من 10 مللي مول 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينإيثان سلفونيك حمض (HEPES) عازلة ، 1 مل من FBS ، و 400 ميكرولتر من 0.1 جم / مل كولاجيناز أ باستخدام دورق مرشح 50 مل / 0.2 ميكرومتر. خصص ما بين 10 مل و 20 مل لكل عينة من الأنسجة ، اعتمادا على كتلة الأنسجة.

3. إعداد وسائل الإعلام

  1. تحضير الوسائط العضوية: وسط الخلية القاعدية للمرشح المعقم مع 1٪ قلم / بكتيريا ، و 1٪ أنسولين-ترانسفيرين-سيلينيوم (ITS) باستخدام قارورة مرشح 50 مل / 0.2 ميكرومتر. لجعل وسائط عامل النمو العضوي ، أضف عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) إلى تركيز نهائي يبلغ 2.5 نانومتر.
  2. تحضير الوسائط الظهارية الثديية: لصنع 100 مل من الوسائط الظهارية الثديية ، مرشح معقم وسط قاعدي مشترك عالي الجلوكوز مع 1 مل من مكمل الجلوتامين 100x ، 1 مل من القلم / البكتيريا ، 1 مل من 10 مللي مول HEPES buffer (7.3 درجة حموضة) ، 250 ميكرولتر من مخزون 30٪ BSA ، 1 ميكرولتر من 1 مجم / مل مخزون توكسين الكوليرا ، 1 مل من 50 ميكروغرام / مل من مخزون الهيدروكورتيزون في برنامج تلفزيوني ، 50 ميكرولتر من محلول الأنسولين البشري 10 مجم / مل ، و 10 ميكرولتر من مخزون عامل نمو البشرة (EGF) 50 ميكروغرام / مل ، و 1٪ FBS باستخدام دورق مرشح 150 مل / 0.2 ميكرومتر. تخزين الوسائط في 4 درجة مئوية واستخدامها لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  3. تحضير غسل الأمفوتريسين: مرشح معقم PBS مع 2٪ قلم / بكتيريا و 2٪ أمفوتريسين ب. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

4. جمع وهضم الأنسجة

  1. الأنسجة الثديية الفأر
    1. القتل الرحيم للفأر عن طريق وضعه في غرفة CO 2 لمدة2-5 دقائق ، ثم يتبع ذلك بخلع عنق الرحم. مع توجيه الجانب البطني لأعلى ، قم بتحريك أطراف الماوس واستخدم أربع إبر 19 G لتثبيت الماوس من الكفوف على لوح مغطى بوسادة ماصة. رش بالإيثانول بنسبة 70٪ لتنعيم الفراء وتعقيم البشرة. امسح البراز بقطعة شاش أو منديل.
    2. بدءا من المنطقة التناسلية مباشرة ، قم بقطع خط الوسط لأعلى باستخدام مقص جراحي ، مع الحرص على عدم اختراق الصفاق. عند الوصول إلى الذقن ، قم بعمل قطع جانبية لكل من الترقوة والساقين الخلفيتين لأسفل ، وقم بتثبيت جلد الفأر مشدودا على اللوحة لفضح منصات الدهون الثديية.
    3. حدد موقع منصات الدهون الثديية الأربية على الفئران البرية عن طريق تحديد العقدة الليمفاوية الأربية الموجودة بالقرب من الأطراف الخلفية. حدد موقع منصات الدهون الثديية الصدرية على الفئران البرية مثل الأنسجة الوعائية الأكثر سمكا تحت الأطراف الأمامية.
    4. استخدم الملقط لرفع وسادة الدهون الثديية. تجنب جمع العضلات الكامنة. باستخدام الطرف الحاد للمقص الحاد الحاد ، قم بإنشاء جيب أسفل وسادة الدهون الثديية ، بعيدا عن الجلد. قطع وسادة الدهون الثديية في قطعة واحدة كاملة.
    5. بمجرد إزالة ضمادات الدهون الثديية ، اشطفها في برنامج تلفزيوني قبل وضعها في طبق زراعة الأنسجة المعقمة. نقل بسرعة إلى غطاء زراعة الأنسجة.
      ملاحظة: بالنسبة لأورام الثدي ، استخدم قطعة قطن مبللة ب PBS لدحرجة الورم برفق بعيدا عن الجلد. تأكد من تجنب المناطق الداكنة أو الناعمة ، حيث يشير تغير اللون الداكن إلى النخر ، والذي لن ينتج عنه عضويات صحية.
    6. فرم أورام الثدي بمشرط # 10 أو # 11 لتخفيف الأنسجة حتى تصل إلى قوام يشبه العجينة. انقل المنديل المفروم إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 10-30 مل من محلول كولاجيناز باستخدام مشرط. لضمان جمع جميع الأنسجة ، ماصة 1 مل من محلول كولاجيناز على لوحة زراعة الأنسجة والعودة إلى الأنبوب المخروطي.
      ملاحظة: لإنتاج عضويات أكبر ، يجب تقليل الهضم الميكانيكي ، وترك بعض القطع الصغيرة المرئية من الأنسجة سليمة. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين الأنسجة مجمدة لإعدادها لاحقا مع الحد الأدنى من الخسارة في البقاء. للقيام بذلك ، اغسل الأنسجة في محلول من PBS أو وسائط الخلايا القاعدية + 1٪ FBS ، ثم فرم خشن لزيادة مساحة السطح (الحفاظ على الأنسجة في قطعة واحدة أو قطعتين صلبتين). انقل المنديل إلى قنينة باردة ، مع وسائط تجميد (90٪ FBS + 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)). قم بتجميد القوارير في حاوية تجميد ذات معدل متحكم فيه طوال الليل قبل الانتقال إلى التخزين في النيتروجين السائل.
    7. ضع الأنبوب المخروطي في حاضنة اهتزاز منضدية 37 درجة مئوية عند 180 دورة في الدقيقة حتى يصبح النسيج خيطيا ويصبح محلول كولاجيناز غائما. على سبيل المثال ، تستغرق كتلة الأنسجة الكبيرة (حوالي 500-800 ملغ) من الورم 30-60 دقيقة. تستغرق كتلة الأنسجة الأصغر (حوالي 100-300 مجم) من منصات الدهون الثديية من النوع البري حوالي 20-30 دقيقة. إذا لم تكن متأكدا ، فتحقق على فترات 5 دقائق.
    8. بعد الحضانة ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالأنبوب المخروطي لمدة 10 دقائق عند 550 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT).
    9. نضح بعناية طاف من الأنبوب المخروطي.
      ملاحظة: من الآن فصاعدا ، قم بتغطية جميع أطراف الماصة والماصات المصلية والأنابيب المخروطية مسبقا بمحلول BSA لتجنب فقدان المواد العضوية بسبب الالتصاق بالبلاستيك.
    10. أضف 8 مل من وسائط الخلايا القاعدية و 80 ميكرولتر من محلول DNase [2 وحدة / ميكرولتر] إلى الأنبوب. اقلب برفق لمدة 1-3 دقائق.
    11. أضف 12 مل من وسائط الخلايا القاعدية إلى الأنبوب واخلطها بعناية عن طريق سحب الأنبوب أو تدويره برفق 15 مرة للخلط.
    12. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 550 × ز في RT.
    13. نضح المادة الطافية ، ثم أعد تعليق الحبيبات في 12 مل من وسائط الخلايا القاعدية.
    14. دع أثقل شظايا الأنسجة تستقر في القاع. جمع طافت مع ماصة مصلية ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل. يحتوي هذا المعلق على عضويات ظهارية وخلايا انسجة / مناعية.
  2. أنسجة الثدي البشرية
    1. معالجة عينات أنسجة الثدي البشرية للعضويات أو تخزينها في غضون 24 ساعة من جمعها. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية في وسائط CO2-Independent مع 1٪ 100x مضاد حيوي ومضاد للفطريات.
    2. نقل الأنسجة إلى لوحة زراعة الأنسجة. قم بإمالة اللوحة وشفط وسائط التخزين الزائدة ، ثم اشطف المنديل ب 5 مل من غسل الأمفوتريسين ب. قم بإزالة غسول الأمفوتريسين B على الفور.
    3. فرم عينة الأنسجة بمشرط # 10 أو # 11 لفك الأنسجة حتى تصل إلى قوام يشبه العجينة. انقل المنديل المفروم إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 10-30 مل من محلول كولاجيناز باستخدام مشرط. لضمان جمع جميع الأنسجة ، ماصة 1 مل من محلول كولاجيناز على لوحة زراعة الأنسجة والعودة إلى الأنبوب المخروطي.
      ملاحظة: لإنتاج عضويات أكبر ، يجب تقليل الهضم الميكانيكي ، وترك بعض القطع الصغيرة المرئية من الأنسجة سليمة. تراوحت كتلة الأنسجة الأولية لهذا البروتوكول بين 100-250 ملغ. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين الأنسجة مجمدة لتحضيرها لاحقا مع الحد الأدنى من الخسارة في الجدوى بعد الخطوة 4.2.2 في 90٪ FBS + 10٪ DMSO على النحو الوارد أعلاه.
    4. ضع الأنبوب المخروطي في حاضنة اهتزاز منضدية 37 درجة مئوية عند 180 دورة في الدقيقة حتى يصبح النسيج أصغر ويصبح كولاجيناز غائما. افحص المنديل على فترات 5 دقائق. يستغرق تفكك كولاجيناز العينات البشرية حوالي 5-20 دقيقة.
    5. بعد الحضانة ، قم بتدوير الأنبوب المخروطي لمدة 10 دقائق عند 550 × جم في RT.
    6. نضح بعناية طاف من الأنبوب المخروطي.
      ملاحظة: من الآن فصاعدا ، قم بطلاء جميع أطراف الماصة والماصات المصلية والأنابيب المخروطية مسبقا بمحلول BSA لتجنب فقدان المواد العضوية بسبب الالتصاق بالبلاستيك.
    7. أضف 4 مل من وسائط الخلايا القاعدية و 40 ميكرولتر من محلول DNase [2 وحدة / ميكرولتر] إلى الأنبوب المخروطي. اقلب برفق لمدة 3 دقائق.
    8. أضف 6 مل من وسائط الخلايا القاعدية إلى الأنبوب واخلطها بعناية عن طريق سحب الأنبوب المخروطي أو تدويره برفق 15 مرة للخلط.
    9. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 550 × ز في RT.
    10. نضح المادة الطافية ، ثم أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسائط الخلايا القاعدية.
    11. دع أثقل شظايا الأنسجة تستقر في القاع. اجمع المادة الطافية وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. يحتوي هذا المعلق على عضويات ظهارية وخلايا انسجة / مناعية.

5. الطرد المركزي التفاضلي

  1. نبض إلى 550 × جم لمدة 3-4 ثوان في RT ، ونضح المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسائط الخلايا القاعدية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أخرى (ما مجموعه أربع دورات).
  2. بعد كل طرد مركزي, تأكد من أن الحبيبات تصبح معتمة بشكل متزايد. هذه الحبيبات المتبقية ستكون عضويات ظهارية.

6. جمع المواد العضوية الصغيرة

  1. نبض إلى 80-100 × جم لمدة 3 ثوان في RT. اجمع المادة الطافية في أنبوب جديد مطلي ب BSA ، ثم اخفقه إلى 550 × جم لمدة 3 ثوان في RT لحبيبات الكائنات العضوية الصغيرة.

7. تضمين المواد العضوية في BECM

  1. تعليق مناسب للقسمة من المواد العضوية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وفقا لكثافة العضوية بالنسبة لكمية BECM لكل بئر (الجدول 1). على سبيل المثال ، استخدم 50-100 عضوي مقابل 20 ميكرولتر من BECM في بئر واحد من صفيحة 96 بئرا.
    ملاحظة: يمكن حساب كثافة المواد العضوية باستخدام الصيغة التالية: ((متوسط عدد الكائنات العضوية) / 50 ميكرولتر) × عامل التخفيف.
  2. نفذ جميع الخطوات على الجليد. ضع BECM المذاب على الثلج في غطاء زراعة الأنسجة. أثناء تحضير الغطاء ، ضع جميع أطراف الماصة على الثلج لتبرد.
  3. أجهزة الطرد المركزي أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 300 × جم في RT. تخلص من المادة الطافية من الأنابيب. انقل الأنابيب ذات الكريات العضوية إلى الثلج وأضف الحجم المناسب من BECM إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق (الجدول 1).
    ملاحظة: نظرا لأن BECM لزج ، أضف كميات إضافية (حوالي 10٪ -20٪ إضافية من حجم القبة) من BECM لحساب الخسارة في طرف الماصة.
  4. ماصة بلطف لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق المواد العضوية في BECM ، مع الحرص على عدم إنتاج فقاعات.
  5. قم ببطء وبعناية بسحب المواد العضوية المعلقة BECM على سطح الطلاء. أثناء السحب ، قم بإحضار الماصة ببطء لإنشاء قبة. املأ جميع الآبار الفارغة ب PBS للحفاظ على الرطوبة.
  6. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح ل BECM بالتصلب ، ثم قم بتغطيتها بالحجم المناسب من الوسائط (الجدول 1).

8. تضمين المواد العضوية في الكولاجين

  1. نفذ جميع الخطوات على الجليد. تحضير محلول الكولاجين عن طريق الجمع ، بترتيب تسلسلي ، 375 ميكرولتر من 10x DMEM ، 100 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ، و 3 مل من محلول الكولاجين I ذيل الفئران في أنبوب مخروطي 15 مل. مزيج ماصة ، مع الحرص على عدم صنع فقاعات. قم بمعايرة المحلول إلى درجة حموضة 7.2-7.4 بكميات صغيرة (زيادات 1-3 ميكرولتر) من هيدروكسيد الصوديوم أو 10x DMEM حسب الحاجة.
  2. قم بتغطية قاع الآبار بأقل كمية من الكولاجين المطلوبة لتغطية قاع البئر بالكامل. تتمثل إحدى الطرق في وضع كمية صغيرة من الكولاجين وهز الطبق من جانب إلى آخر لتغطيته. اترك طبقات الكولاجين السفلية ثابتة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة -2 ساعة.
  3. القسمة التعليق المناسب للعضويات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وفقا لكثافة العضو بالنسبة لكمية الكولاجين لكل بئر (الجدول 1). ضعه في حاضنة 37 درجة مئوية.
  4. قم بتخزين محلول الكولاجين في درجة حرارة 4 درجات مئوية ومراقبة البلمرة عن طريق التحقق من تكوين الألياف تحت المجهر كل 10 دقائق. سيصل الكولاجين إلى البلمرة المناسبة بين 30 دقيقة و 2 ساعة.
    ملاحظة: يمكن تحديد البلمرة المناسبة من خلال وجود ألياف متفرعة في جميع أنحاء المصفوفة. انتقل إلى الخطوة 8.5 على الفور بمجرد ملاحظة بعض الألياف في مجال الرؤية.
  5. أجهزة الطرد المركزي أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في 300 × غرام لمدة 10 دقائق في RT. تخلص من المادة الطافية من الأنابيب. انقل الكريات العضوية إلى الثلج وأضف الحجم المناسب من الكولاجين إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق (الجدول 1).
    ملاحظة: نظرا لأن الكولاجين لزج ، أضف كميات إضافية (حوالي 10٪ -20٪ إضافية من حجم القبة) من الكولاجين لحساب الخسارة في طرف الماصة.
  6. ماصة بلطف صعودا وهبوطا لإعادة تعليق المواد العضوية في الكولاجين ، مع الحرص على عدم إنتاج فقاعات.
  7. قم ببطء وبعناية بسحب المواد العضوية المعلقة بالكولاجين على سطح الطلاء. أثناء السحب ، قم بإحضار الماصة ببطء لإنشاء قبة. املأ جميع الآبار الفارغة ب PBS للحفاظ على الرطوبة.
  8. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح للكولاجين بالتصلب ، ثم قم بتغطيتها بالحجم المناسب من الوسائط (الجدول 1).
  9. ملاحظة: تحافظ المواد العضوية على الصلاحية في مصفوفة 3D لمدة تصل إلى 7 أيام. إذا تم استخدام التصوير للتحليل ، فانتقل إلى الخطوتين 9 و 10.

9. إصلاح المواد العضوية المضمنة

  1. استخدم ماصة لإزالة جميع الوسائط من الآبار دون الاتصال بقباب ECM.
  2. ثبت بمحلول بارافورمالدهايد 4٪ (PFA) / PBS لمدة 5 دقائق.
  3. اغسل مرتين إلى ثلاث مرات عن طريق تطبيق برنامج تلفزيوني على الآبار بعد وضعها على شاكر يتحرك ببطء. بعد الغسيل ، ضعي برنامج تلفزيوني طازج على القباب وخزني الطبق على حرارة 4 درجات مئوية.

10. تلطيخ مناعي من المواد العضوية المدمجة

  1. تحضير حلول للتلطيخ المناعي
    1. المخزن المؤقت للنفاذية: قم بإعداد حل PBS بنسبة 10٪ Triton X-100.
    2. حظر المخزن المؤقت: قم بإعداد حل PBS بنسبة 10٪ FBS و 0.2٪ Triton X-100.
    3. المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة: قم بإعداد محلول PBS باستخدام 2٪ FBS و 0.2٪ Triton X-100.
  2. النفاذية والحجب
    1. ماصة كافية العازلة نفاذية لتغطية قباب ECM. احتضان لمدة 1 ساعة في RT على شاكر يتحرك ببطء.
    2. قم بإزالة المخزن المؤقت للنفاذية باستخدام ماصة وقم بتطبيق نفس الحجم من المخزن المؤقت للحظر لمدة 3 ساعات.
  3. حضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. قم بإزالة المخزن المؤقت المانع باستخدام ماصة وقم بتطبيق المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة الذي يحتوي على الجسم المضاد الأساسي بتركيزات محددة من قبل الشركة المصنعة. احتضان العينة عند 4 درجات مئوية لمدة 12-16 ساعة على شاكر بطيء الحركة.
    2. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل العينات ثلاث مرات لمدة 10 دقائق باستخدام PBS في RT على شاكر يتحرك ببطء.
  4. حضانة الأجسام المضادة الثانوية والبقع النووية
    1. قم بنضح غسول PBS المتبقي وقم بتطبيق المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة الذي يحتوي على جسم مضاد ثانوي بتركيزات محددة من قبل الشركة المصنعة. بالإضافة إلى ذلك ، أضف DAPI أو Hoechst (لتسمية النوى) أو phalloidin (لتسمية الأكتين) إلى المخزن المؤقت بنسبة 1: 250. احتضان لمدة 2-4 ساعات في RT على شاكر بطيء الحركة.
    2. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوي واغسل العينات ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في برنامج تلفزيوني في RT على شاكر. قم بتخزين العينات في برنامج تلفزيوني عند 4 درجات مئوية حتى التصوير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تقدم الصور الموضحة في الشكل 1 مثالا على العضويات الطلائية الثديية من النوع البري والورم من أنسجة الإنسان والفئران. يتم توفير رسم توضيحي سريع لطريقة عزل الكائنات العضوية الظهارية من خلال الطرد المركزي التفاضلي في سير عمل الرسوم المتحركة في الشكل 1 أ ، مما يد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تم وصف طرق مختلفة في الأدبيات لتوليد عضويات الورم. يسلط هذا البروتوكول الضوء على طريقة لتوليد عضويات الورم مباشرة من الورم دون المرور. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن إنتاج عضويات الورم في غضون ساعات من بدء الإجراء وتوليد ما يقرب من 100٪ من المواد العضوية القابلة للحياة مقارنة ب 70٪ المبلغ عنها ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة بتمويل مقدم من METAvivor ، و Peter Carlson Trust ، ومؤسسة أبحاث تيريزا ، ومركز NCI/UTSW Simmons للسرطان P30 CA142543. نحن نعترف بمساعدة المورد المشترك لإدارة الأنسجة بجامعة تكساس الجنوبية الغربية ، وهو مورد مشترك في مركز سيمونز الشامل للسرطان ، والذي يدعمه جزئيا المعهد الوطني للسرطان بموجب رقم الجائزة P30 CA142543. شكر خاص لجميع أعضاء مختبر تشان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mM HEPES BufferGibco 15630080
100x Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-096
100x GlutamaxLife Technologies 35050-061Glutamine supplement
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) Life Technologies 51500-056
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)Sigma P4333
10x DMEMSigma D2429
50 mL/0.2 µm filter flaskFisher #564-0020
Amphotericin BLife Technologies 15290-018
bFGFSigmaF0291
BSA Solution (32%)Sigma #A9576
Cholera Toxin Sigma C8052
CO2-Independent Medium Gibco18045-088
Collagenase A Sigma C2139
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)SigmaD4263
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell cultureSigmaD6546Common basal medium
D-MEM/F12 Life Technologies #10565-018Basal cell medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) Sigma#D8662PBS
Fetal bovine serum (FBS)Sigma #F0926
Gentamicin Life Technologies #15750-060
Human epidermal growth factor (EGF)Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0396
Insulin Sigma #I9278
Matrigel Corning #354230Basement Extracellular Matrix (BECM)
NaOH (1 N)Sigma S2770
Rat Tail Collagen ICorning 354236
RPMI-1640 mediaFisher SH3002701
Trypsin Life Technologies 27250-018

References

  1. Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  2. Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698(2021).
  3. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  4. Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
  5. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  6. Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  7. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  8. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  9. Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
  10. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  11. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  12. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  13. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  14. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991(2019).
  15. Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
  16. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  17. Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285(2017).
  18. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  19. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  20. Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
  21. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  23. Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  24. Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398(2021).
  25. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  26. Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134(2020).
  27. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  28. Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762(2022).
  29. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  30. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  31. LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
  32. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
  33. Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved