تصوير الفاصل الزمني 3-D لديناميات جدار الخلية باستخدام Calcofluor في الطحالب Physcomitrium patens

Summary

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتصوير ديناميكيات جدار الخلية 3-D لأنسجة الطحالب الحية ، مما يسمح بتصور انفصال جدران الخلايا في طفرات ggb وأنماط جدار الخلية السميكة في النوع البري أثناء التطور على مدى فترة طويلة.

Abstract

يسمح التصوير بفاصل زمني باستخدام الفحص المجهري الفلوري بمراقبة التغيرات الديناميكية للنمو والتطور على المستويين الخلوي ودون الخلوي. بشكل عام ، بالنسبة للملاحظات على مدى فترة طويلة ، تتطلب التقنية تحويل بروتين الفلورسنت. ومع ذلك ، بالنسبة لمعظم الأنظمة ، يكون التحول الجيني إما مستهلكا للوقت أو غير متاح تقنيا. تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا للتصوير ثلاثي الأبعاد بفاصل زمني لديناميكيات جدار الخلية على مدار 3 أيام باستخدام صبغة كالكوفلور (التي تلطخ السليلوز في جدار الخلية النباتية) ، والتي تم تطويرها في الطحالب Physcomitrium patens. إشارة صبغة calcofluor من جدار الخلية مستقرة ويمكن أن تستمر لمدة 1 أسبوع دون تسوس واضح. باستخدام هذه الطريقة ، فقد ثبت أن انفصال الخلايا في طفرات ggb (حيث يتم التخلص من الوحدة الفرعية بيتا للبروتين geranylgeranyltransferase-I) ناتج عن توسع الخلية غير المنظم وعيوب سلامة جدار الخلية. علاوة على ذلك ، تتغير أنماط تلطيخ الكلكوفلور بمرور الوقت. ترتبط المناطق الأقل تلطيخا بشكل مكثف بمواقع توسع / تفرع الخلايا المستقبلية في النوع البري. يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الأنظمة الأخرى التي تحتوي على جدران خلوية والتي يمكن تلطيخها بواسطة الكلكوفلور.

Introduction

تخضع جدران الخلايا النباتية لتغيرات ديناميكية أثناء تمدد الخلايا وتطورها^1،2،3. يعد الحفاظ على سلامة جدار الخلية أمرا بالغ الأهمية للالتصاق الخلايا النباتية أثناء النمو والتطور ، وكذلك للاستجابة للإشارات البيئية. على الرغم من أن تصور ديناميكيات جدار الخلية للخلايا الحية على مدى فترة طويلة من الزمن أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية الحفاظ على التصاق الخلايا أثناء التطور والتكيف مع التغيرات البيئية ، إلا أن الطرق الحالية لمراقبة ديناميكيات جدار الخلية مباشرة لا تزال صعبة.

يمكن أن يوفر التصوير بفاصل زمني للتغيرات الخلوية ديناميكيات تنموية مفيدة للكائن الحي باستخدام مجهر مضان عالي الدقة⁴،⁵،^6،7. في حين أن التصوير ثلاثي الأبعاد بفاصل زمني لديه قدر كبير من الإمكانات لدراسة التغيرات الديناميكية لشكل الخلية أثناء النمو والتطور ، فإن التقنية تتطلب عادة تحويل بروتين الفلورسنت⁴،⁵،^6،7. ومع ذلك ، بالنسبة لمعظم الأنظمة ، فإن التحولات الجينية إما تستغرق وقتا طويلا أو تمثل تحديا تقنيا. كبديل ، كانت الأصباغ الفلورية التي ترتبط بالمكونات الخلوية متاحة منذ فترة طويلة. يمكن أن تنبعث الأصباغ الفلورية من ضوء الفلورسنت بعد التشعيع بضوء بطول موجي معين. الأمثلة الشائعة هي Edu و DAPI و PI و FM4-64 و calcofluor white⁸،^9،10. ومع ذلك ، فإن أحد العيوب الرئيسية هو أن هذه الأصباغ لا يمكن استخدامها عادة إلا في الأنسجة الثابتة أو للتجارب القصيرة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الضرر الذي تسببه للخلية⁸،^9،10.

مع البروتوكول المقدم هنا ، تكون إشارات calcofluor مستقرة عندما يتم خلط كالكوفلور الأبيض داخل الوسط أثناء تجارب الفاصل الزمني في الطحالب P. patens. باستخدام هذه الطريقة ، لوحظ انفصال الخلايا في طفرات ggb باستخدام التصوير بفاصل زمني ثلاثي الأبعاد على مدى فترة 3 أيام³ (الشكل 1). يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الأنظمة الأخرى التي تحتوي على جدران خلوية والتي يمكن تلطيخها بواسطة الكلكوفلور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على قائمة المواد والمعدات والجدول 1 للحصول على قائمة الحلول التي سيتم استخدامها في هذا البروتوكول.

1. تحضير النباتات لأطباق القاع الزجاجي

1. قم بزراعة الأنسجة البدائية الطحلبية في وسط أجار BCDAT في طبق بتري 13 سم تحت ضوء أبيض ثابت (~ 50 ميكرومول ^{m-2 s-1}) لمدة 7 أيام عند 25 درجة مئوية في غرفة النمو.
2. قم بتصفية وتعقيم الكالكوفلور الأبيض وخزنه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. الكاشف مستقر لعدة أشهر.
3. قم بتفريق أنسجة الطحالب البالغة من العمر 7 أيام في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 20 ميكرولتر من الماء المعقم. تأكد من تشتيت الأنسجة البدائية الطحلبية بشكل كاف كقطع صغيرة في الماء. بالنسبة للنوع البري (WT) ، استخدم الملقط لفصل البروتونيماتا ؛ بالنسبة لمتحولة GGB ، استخدم ماصة P-1000.
4. أضف 10 ميكرولتر من الكالكوفلور الأبيض المعقم إلى الأنبوب الصغير سعة 1.5 مل واترك الأنبوب الصغير في وضع مستقيم في غطاء المحرك لمدة دقيقتين للتلطيخ.
5. مباشرة بعد التلوين ، امزج النباتات مع 200 ميكرولتر من BCDATG المبرد ، الذي يحتوي على وسط BCDAT المكمل ب 0.5٪ (وزن / حجم) جلوكوز و 0.4٪ (وزن / حجم) صمغ جيلان ، عن طريق السحب خمس مرات باستخدام ماصة P-1000.
   ملاحظة: تأكد من تبريد وسط BCDATG بدرجة كافية (قبل أن يصلب الوسط مباشرة) لتجنب إجهاد النباتات.
6. انقل الخليط الذي يحتوي على النباتات ووسط BCDATG إلى طبق قاعدة زجاجي بقطر 27 مم. تأكد من أن حجم BCDATG لخلط الخلايا لا يزيد عن 200 ميكرولتر وأن 200 ميكرولتر من BCDATG مع العينات موزعة بالتساوي على سطح الطبق السفلي الزجاجي 7 مم لإنتاج طبقة رقيقة من الفيلم ، بحيث تكون العينات ضمن مسافة العمل الموضوعية أثناء التصوير.
7. بعد التصلب لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بتغطية الطبقة الرقيقة ب 3 مل من BCDATG المبرد واتركها لمدة 10 دقائق لتتصلب مرة أخرى.
   ملاحظة: تأكد من إجراء الخطوات 1.2-1.5 في غطاء معقم لتجنب التلوث.
8. في الجزء السفلي من الطبق ، ارسم تسعة خطوط في اتجاهات متوازية ومتعامدة (الشكل 2). ضع علامة على الصفوف بأحرف من a إلى h ، وقم بتمييز الأعمدة بأرقام من 1 إلى 8. استخدم العلوي والسفلي والأيمن والأوسط والأيسر لتمييز المواضع داخل كل مربع. على سبيل المثال ، إذا كان النبات في مربع في الصف الثاني والعمود السادس وتم وضعه في الجزء الأيسر العلوي من المربع ، إعطاء هذا النبات اسم "b6_upper_left".
9. قبل زراعة طبق القاع الزجاجي الذي يحتوي على النباتات تحت الضوء الأحمر لمدة 5 أيام عند 25 درجة مئوية في غرفة النمو ، ثم تحت الضوء الأبيض لمدة 1-2 أيام قبل الخضوع لتصوير الفاصل الزمني كل يوم لمدة تصل إلى 3 أيام. بالنسبة ل WT ، قم بزراعة النباتات في ضوء أحمر ضعيف (0.5 μmol ^{m-2 s-1}) مما سبق لمدة 5 أيام للحث على الاستجابة الضوئية للبروتونيماتا ، بحيث يمكن للنباتات أن تلتصق بقاع الأطباق¹¹.
   ملاحظة: يتم توفير الضوء الأحمر الضعيف عن طريق تمرير ضوء أبيض من خلال مرشح بلاستيكي أكريليك أحمر بسمك 3 مم إلى صناديق مقاومة للضوء. بالنسبة لمتحولات ggb ، يكون الاستزراع المسبق في الضوء الأحمر اختياريا ، حيث لا تحتوي طفرات ggb على استجابة انتحاء ضوئي 3.

2. التصوير وإعادة الإعمار 3-D

1. ضع طبق القاع الزجاجي الذي يحتوي على نباتات على مرحلة مجهر متحد البؤر مقلوب ، بحيث يكون القاع الزجاجي مواجها للهدف. استخدم مجهرا متحد البؤر لتصور الكالكوفلور بعدسة موضوعية 20x. التقط صورا باستخدام ليزر 405 نانومتر ، والثقب عند 1.0 ، وكسب HV عند 100 ، وضبط خلفية الإزاحة عند 0 ، وطاقة الليزر عند 5٪ -7٪ ، وحجم مسح ضوئي يبلغ 1024 × 1024 ، وسرعة مسح ضوئي تبلغ 1/2 إطار / ثانية. اجمع 17-30 قسما بصريا من سلسلة z بحجم خطوة 1.0 ميكرومتر. قم بتسمية الصور باستخدام التعليمات البرمجية في الخطوة 1.6، مثل "b6_upper_left-day0"، واحفظها.
   1. حدد قناة DAPI في الاستحواذ وحدد مربع Z في اكتساب ND. لتعيين الحدود الدنيا والعليا لمكدس Z، انقر فوق الزرين العلوي والسفلي.
2. لإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد ، افتح ملف .nd2 (الشكل 3 أ ؛ انظر جدول المواد) وانقر فوق المجلد (الشكل 3 ب).

3. تصوير نفس النباتات في نقاط زمنية مختلفة

1. بعد كل تصوير ، ضع طبق القاعدة الزجاجية مرة أخرى في غرفة النمو.
2. كرر من الخطوة 2.1 للتصوير وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد.
   ملاحظة: للعثور على نفس النباتات ، استخدم الرمز المذكور في الخطوة 1.6 وقم بإعطاء الاسم "b6_upper_left-day1" أو "b6_upper_left-day2" ، وفقا لعمر النباتات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تسمح هذه الطريقة بمراقبة ديناميكيات جدار الخلية أثناء التطور في النوع البري وطفرات ggb (الشكل 1). أظهرت النتائج أن المناطق ذات السماكة الأقل لجدار الخلية ترتبط بمواقع تمدد / تفرع الخلية ، مما يسمح بالتنبؤ بمواقع التوسع / التفرع في النوع البري (الشكل 1 أ). ت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

إعادة بناء 3-D بفاصل زمني ، أو تصوير 4-D ، هي أداة قوية لمراقبة ديناميات التشكل الخلوي أثناء العمليات التنموية. في هذا البروتوكول ، عن طريق خلط الكلس الأبيض في الوسط ، يمكن ملاحظة ديناميات التشكل الخلوي 3-D في الطحلب P. patens. باستخدام هذه الطريقة ، لاحظنا أن سطح جدران الخلايا في طفرات ggb ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-mm-thick red plastic light filter	Mitsubishi	no.102
27 mm diameter glass base dish	Iwaki	3930-035
Agar	Sigma	A6924
Calcofluor white	Sigma	18909-100ML-F	Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L
Confocal microscope	Nikon	A1	NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer
Fluorescence microscope	Nikon	TE200	Equipped with a DS-U3 camera;
Gellan gum	Nacali Tesque	12389-96
Plant Growth Chambers	SANYO	Sanyo MLR-350H
Sterilized syringe 0.22 μm filter	Millipore	SLGV033RS