تحديد الذوبان في المختبر للمكونات متعددة المؤشرات في حبيبات رهوديولا الطب التبتي

Summary

هنا ، نختبر انحلال حبيبات رهوديولا (RG) في المختبر ، ونرسم منحنيات ذوبان الساليدروسيد وحمض الغال وإيثيل غالات في الماء فائق النقاء ، ونلائم المنحنيات مع النماذج الرياضية المختلفة. يوفر هذا البروتوكول معلومات وإرشادات لدراسات التكافؤ الحيوي في الجسم الحي وفي الجسم الحي في المختبر ل RG.

Abstract

تكوين حبيبات رهوديولا الطب التبتي (RG) معقد ، ومن الصعب تحديد الجودة الشاملة ل RG. لذلك ، فإن إنشاء طريقة لتحديد حل RG متعدد المكونات في المختبر له أهمية كبيرة لمراقبة الجودة. تستخدم هذه الدراسة طريقة المجداف الثانية للقاعدة العامة الرابعة 0931 من دستور الأدوية الصيني (إصدار 2020) ، المتوافق مع الجهاز 2 من دستور الأدوية الأمريكي (USP). تم ضبط جهاز الذوبان على سرعة دوران تبلغ 100 دورة في الدقيقة مع ماء فائق النقاء كوسيط ذوبان. تم جمع حجم عينة من 1 مل في كل نقطة زمنية. علاوة على ذلك ، تم تحديد الذوبان التراكمي لحمض الغال والساليدروسيد وحمض الغال الإيثيلي في RG في نقاط زمنية مختلفة بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC). أخيرا ، تم رسم منحنيات الذوبان ، وتم تركيب المنحنيات على معادلات GompertzMod و Gompertz و Logistics و Weibull. أظهرت النتائج أن الذوبان التراكمي لحمض الغال في RG كان أكثر من 80٪ عند 1 دقيقة ، وكان الذوبان التراكمي للساليدروسيد وحمض إيثيل الغاليك أكثر من 65٪ عند 5 دقائق ، وانخفض الذوبان التراكمي لكل مكون من مكونات المؤشر بعد 30 دقيقة. أظهر تركيب المنحنى أن معادلة GompertzMod كانت النموذج الأنسب لكل مكون من مكونات مؤشر RG. في الختام ، طريقة اختبار الذوبان الموضحة في هذا البروتوكول بسيطة ودقيقة وموثوقة. يمكن أن يميز سلوك الذوبان لمكونات المؤشر في RG في المختبر ، والذي يوفر مرجعا منهجيا لمراقبة جودة RG وتقييم جودة المركبات العرقية الأخرى.

Introduction

في الصين ، يستمر انتشار أمراض القلب والأوعية الدموية في الارتفاع ، وتحتل معدلات المراضة والوفيات الناجمة عن أمراض القلب والأوعية الدموية المرتبة الأولى بين السكان الصينيين¹. الذبحة الصدرية لمرض القلب التاجي ناتجة عن تضيق اللمعية بسبب تصلب الشرايين التاجية ، مما يؤدي إلى عدم كفاية إمدادات الدم التاجية نسبيا ونقص تروية عضلة القلب^ونقص الأكسجة 2. في السنوات الأخيرة ، تم التعرف على التأثير العلاجي للطب الصيني التقليدي في علاج أمراض القلب التاجية من قبل العديد من الأطباء³.

يلعب الطب الصيني التقليدي دورا مهما في تخفيف الأعراض السريرية وتحسين نوعية حياة المرضى⁴. يتم استخراج حبيبات رهوديولا (RG) وتكريرها من النبات الطبي لهضبة التبت رهوديولا الوردية L. المكونات الرئيسية ل RG هي ساليدروسيد ، روديوسين ، والفلافونويد ^5,6. RG له تأثير مكمل Qi⁷ وتنشيط وتعزيز الدورة الدموية لتخفيف الألم. سريريا ، يتم استخدامه لعلاج انسداد الصدر الناجم عن نقص Qi وركود الدم ، وأمراض القلب التاجية ، والذبحة الصدرية⁸. لا يعكس تحديد المحتوى وحده الجودة الجوهرية للأدوية بشكل كامل ، حيث يمكن أن يؤثر كل من التفكك والذوبان في المختبر على التوافر البيولوجي وفعالية الأدوية ^9,10. تشمل طرق التفتيش لحل الطب الصيني طريقة السلة الدوارة وطريقة المجداف وطريقة الكوب الصغير. عيب طريقة السلة الدوارة هو أن الجزء الخارجي فقط من السلة الدوارة يتلامس مع وسيط الذوبان أثناء الدوران ، والذي لا يعكس سلوك الذوبان في العالم الحقيقي. يمكن لطريقة المجداف التغلب على النقص أعلاه ، مما يجعلها أكثر ملاءمة من طريقة السلة لبعض مستحضرات الطب الصيني الصلب¹¹. في الوقت الحاضر ، لا يوجد تقرير عن تحليل الذوبان في المختبر ل RG. من أجل التحكم في جودة RG بشكل أكثر شمولا ، تم فحص سلوك الذوبان لمكونات المؤشر الثلاثة (حمض الغال ، الساليدروسيد ، وإيثيل غالات) في RG. توفر هذه الدراسة بيانات لمراقبة جودة RG ومرجع منهجي لتقييم جودة مستحضرات المركبات العرقية الأخرى.

Protocol

1. إعداد الحل

1. تحضير محلول مخزون المادة المرجعية: قم بوزن 10.6 مجم من الساليدروسيد و 5.24 مجم من حمض الغاليك و 5.21 مجم من حمض إيثيل غاليك بشكل منفصل على ميزان تحليلي إلكتروني وأضفهم بشكل فردي إلى دورق حجمي سعة 5 مل. ثم أضف الميثانول من فئة HPLC ليذوب ويخفف إلى 5 مل. أخيرا ، رج العبوة جيدا للحصول على محلول مخزون المادة المرجعي بتركيزات كتلة تبلغ 2.120 مجم / مل و 1.048 مجم / مل و 1.042 مجم / مل على التوالي.
   ملاحظة: يحتوي محلول مخزون المادة المرجعية على 2.120 مجم / مل ساليدروسيد ، و 1.048 مجم / مل من حمض الغال ، و 1.042 مجم / مل من إيثيل غالات كمحلول مخزون لكل محلول في المنحنى القياسي اللاحق.
2. تحضير محلول عينة الاختبار. استخرج 2.8 جم من RG (جدول المواد) مع 10 مل من الميثانول من فئة HPLC باستخدام آلة تنظيف بالموجات فوق الصوتية (الطاقة: 200 واط ، التردد: 40 كيلو هرتز) لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بترشيحه باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر لاختبار قدرة النظام على التكيف.
3. تحضير محلول مرجعي مختلط يحتوي على 0.590 ملغم/مل ساليدروسيد، 2.030 ملغم/مل حمض الغال، و1.930 ملغم/مل من إيثيل غالات.
   ملاحظة: يتم إذابة كل معيار (2.950 ملغ من ساليدروسيد ، 10.150 ملغ من حمض الغال ، و 9.650 ملغ من حمض الغال الإيثيل) في دورق حجمي سعة 5 مل في الميثانول من الدرجة HPLC كوسيط ذوبان.
4. احصل على المحتوى النظري لكل مكون مميز من RG لاستخراج المياه فائقة النقاء.
   1. ضع 2.8 جم من RG في دورق مخروطي سعة 500 مل ، وأضف 200 مل من الماء عالي النقاء ، واستخلصه بالموجات فوق الصوتية (الطاقة: 200 واط ، التردد: 40 كيلو هرتز) لمدة 60 دقيقة. ثم قم بترشيحه بمرشح 0.22 ميكرومتر.
   2. حدد محتوى حل الاختبار وفقا للمعادلة الخطية التي تم الحصول عليها في التجربة التالية.

2. حالة الكروماتوغرافيا

1. اضبط الظروف الكروماتوغرافية كما هو موضح في الجدول 1 للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء. للحصول على تفاصيل حول الأداة المستخدمة ، راجع جدول المواد.

3. اختبار قدرة النظام على التكيف

1. تحقق من العلاقة الخطية.
   1. تمييع محاليل المخزون المرجعية لحمض الغال وإيثيل غالات بمقدار 5 و 10 و 25 و 50 و 125 مرة ، ومحاليل المخزون المرجعية للساليدروسيد بمقدار 2 و 4 و 8 و 16 و 32 مرة للحصول على محلول تركيز التدرج لرسم منحنى قياسي.
      ملاحظة: اضبط نسبة التخفيف للمنحنى القياسي وفقا للتجربة الأولية لمعالجة العينة. في التجربة الأولية ، تم تخفيف حلول الأسهم للمعايير الثلاثة أولا 5 و 10 و 25 و 50 و 125 مرة ، ثم تم رسم المنحنى القياسي الأول. ومع ذلك ، عندما تم الكشف عن تركيز عينة الاختبار ، وجد أن تركيزات الساليدروسيد لا تقع ضمن النطاق الخطي لهذا المنحنى القياسي ، وبالتالي ، تم تعديل التركيزات لتضمينها في المنحنى. باختصار ، تم استخدام التجارب الأولية المذكورة أعلاه لتحديد تركيزات التخفيف النهائية لعينات الاختبار الثلاثة للدراسات التجريبية اللاحقة.
2. اختبار الدقة: حقن 10 ميكرولتر من المحلول المرجعي المختلط في نظام HPLC ست مرات يوميا وتشغيل العينات بنفس ظروف HPLC الموضحة في الخطوة 2.1. سجل منطقة الذروة لكل مكون معلم.
3. تجارب اختبار الثبات: حقن 10 ميكرولتر من محلول العينة المحضر وتحديد مناطق الذروة في HPLC وفقا للظروف الكروماتوغرافية بعد 0 ساعة و 6 ساعات و 10 ساعات و 12 ساعة و 14 ساعة و 16 ساعة و 18 ساعة و 20 ساعة و 24 ساعة على التوالي.
   ملاحظة: يتم تسجيل مناطق الذروة تلقائيا بواسطة نظام HPLC.
4. اختبار الاستنساخ: خذ ست عينات من نفس الدفعة من RG لإعداد محلول عينة الاختبار وفقا للطريقة الواردة في الخطوة 1.2. حقن 10 ميكرولتر من كل عينة في نظام HPLC. قم بتشغيل العينات كما هو موضح في الخطوة 2.1 وحدد قابلية التكاثر.
   ملاحظة: تم تقييم قابلية التكرار من خلال مقارنة فروق التركيز بين العينات الست.
5. تجربة الاسترداد
   1. قم بإعداد ستة أجزاء من نفس الدفعة من RG لحل الاختبار. بعد ذلك ، أضف حوالي 50٪ من المادة المرجعية لكل مكون فهرس في حل الاختبار لحساب معدل الاسترداد. قم بتشغيل هذه العينات في نظام HPLC بنفس الشروط الموضحة في الخطوة 2.1.
   2. احسب معدل الاسترداد.
      ملاحظة: معدل الاسترداد = (C - A) / B × 100 ، حيث A هي كمية المكون المراد قياسها في محلول الاختبار ، B هي كمية المادة المرجعية المضافة ، و C هي القيمة المقاسة للمحلول الذي يحتوي على المادة المرجعية وعينة RG. راجع الخطوة 2.1 لمعرفة الظروف الكروماتوغرافية لتنفيذ الخطوات المذكورة أعلاه (أي الخطوات 3.1-3.5).

4. اختبار الذوبان في المختبر

1. قم بإجراء اختبار الذوبان باستخدام طريقة مجداف الطريقة الثانية للقاعدة العامة 0931 من دستور الأدوية الصيني (إصدار 2020)¹².
   ملاحظة: تقنية ومعدات أخذ العينات: يحتوي جهاز إذابة الدواء (جدول المواد) على كوب ذوبان ، مجداف ، نظام للتحكم في درجة الحرارة ، ونظام ضبط السرعة. قبل البدء في تجربة الذوبان ، يتم تسخين الماء إلى درجة حرارة محددة ، ثم يتم ضبط السرعة المقابلة. ابدأ في تسجيل الوقت فورا بعد إضافة RG.
2. أضف 100 مل من الماء عالي النقاء إلى كوب الذوبان بجهاز إذابة الدواء وحافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية. اضبط سرعة الدوران على 100 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: يحتوي جهاز الذوبان على جهاز تسخين يسمح بضبط درجة الحرارة داخل النظام. لم يكن هناك فرق كبير في معدل ذوبان الساليدروسيد في الماء ، وعصير المعدة الاصطناعي (16.4 مل من حمض الهيدروكلوريك المخفف [234 مل من حمض الهيدروكلوريك المركز المخفف إلى 1000 مل بالماء] مع حوالي 800 مل من الماء و 10 غرام من البيبسين ، مهتز جيدا ، ومخفف بالماء إلى 1000 مل) ، وعصير الأمعاء الاصطناعي (محلول الفوسفات [درجة الحموضة 6.8] التي تحتوي على التربسين) ¹³. تم اختيار المياه الأكثر سهولة (فائقة النقاء) كوسيط ذوبان.
3. أضف 2.8 جم من RG إلى كوب الذوبان وابدأ في تسجيل مدة الذوبان على الفور. اجمع ما مجموعه 1 مل من العينة باستخدام حاقن (انظر جدول المواد) في 1 دقيقة و 5 دقائق و 10 دقائق و 20 دقيقة و 30 دقيقة و 60 دقيقة ، وقم بتكوين الحجم في كوب الذوبان باستخدام وسط الذوبان بنفس درجة الحرارة على الفور.
   ملاحظة: لا يمكن لأنبوب أخذ العينات في كوب الذوبان جمع أحجام عينات صغيرة ، لذلك يتم استخدام الحاقن لجمع العينة. يجب جمع العينات بسرعة لتجنب فقدان النقاط الزمنية المحددة للتجميع.
4. قم بتصفية العينات التي تم جمعها على الفور من خلال غشاء صغير يسهل اختراقه 0.22 ميكرومتر وأخذ المرشح اللاحق. حدد محتوى كل مكون في كل نقطة زمنية بواسطة HPLC (وفقا للخطوة 2.1) واحسب الحل التراكمي.
   1. لحساب الذوبان التراكمي ، احسب حل كل نقطة زمنية (X_n):
      X_n = A / B x 100 ، حيث A هي كمية المكونات المقاسة في كل نقطة زمنية و B هي المحتوى النظري لكل مكون.
   2. ثم احسب الذوبان التراكمي (Y):
      Y = X n + (X 1 + ... + X _n-1) x V 2 / V 1 ، حيث V₁ هو الحجم الكلي لوسط الذوبان و V ₂ هو حجم المذاب المضاف بعد كل عينة.
      ملاحظة: نظرا لقيم الاستجابة المنخفضة للساليدروسيد وحمض الغال في الكروماتوجرام ، لم يتم رسم الذوبان التراكمي للساليدروسيد والإيثيل غالات عند نقطة زمنية 1 دقيقة في منحنى الذوبان.

5. تركيب نموذج الذوبان

1. استيراد بيانات الحل التراكمي في كل نقطة زمنية إلى برنامج تحليل البيانات.
2. استخدم المكون الإضافي لتحليل إذابة الدواء في برنامج تحليل البيانات لتناسب معادلة GompertzMod ومعادلة Gompertz والمعادلة اللوجستية ومعادلة Weibull¹⁴. كلما زادت قيمة R² ، كان تأثير تركيب المنحنى أفضل.
   1. ابدأ تشغيل البرنامج ، وحدد نافذة Book1 للدخول إلى نافذة تحرير بيانات الأصل .
   2. في العمود الأول A (X) - وقت إدخال الاسم الطويل ، حدد الوقت كوقت ، وأدخل كل وقت تحديد الحل. إدخال البيانات في العمود الثاني B (Y) - الاسم الطويل ، وتعريف البيانات على أنها الحل التراكمي ، وإدخال النسبة المئوية للحل التراكمي لكل وقت تحديد الحل.
   3. بعد إدخال البيانات ، حدد العمود A (X ) و B (Y) ، وحدد المكون الإضافي لتحليل ذوبان الدواء في شريط قائمة البرنامج وانقر فوق Fit Dissolution Data > Concatenate Fit > OK. البرنامج يولد النتائج المناسبة لكل نموذج.

النتائج

في هذه الدراسة ، كانت الدقة والاستقرار والتكرار واستعادة عينة RG كلها ضمن النطاق المنهجي المحدد في دستور الأدوية الصيني (المجلد 4 ، 2020) ¹² ، مما يشير إلى أن الطريقة كانت ممكنة. بعد تصحيح الأخطاء المتكرر ، تم تحديد أن تدرج الشطف المستخدم في هذه الدراسة كان له دقة جيدة (ا?...

Discussion

اختبار الذوبان هو طريقة مثالية في المختبر لمحاكاة تفكك وانحلال المستحضرات الفموية الصلبة في الجهاز الهضمي¹⁵. إنه مؤشر مهم لتقييم ومراقبة جودة المستحضرات الفموية الصلبة. لذلك ، يلعب اختبار الذوبان دورا أساسيا في تطوير المستحضرات الفموية للأدوية الصلبة¹⁶. على...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromatographic column	ZORBAX Eclipse	XDB-C18	4.6 mm x 250 mm, 5 µm
Drug dissolution tester	Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd.	RCZ-6B3
Electronic analytical balance	Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd.	FA1004
Ethyl gallate (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM006301
Function drawing software	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2022
Gallic acid (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM000802
High performance liquid chromatography	Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd.	Agilent 1260 Infinity
HPLC grade methanol	Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.	216565
Injector	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrument Co., Ltd.	0.7 (22 G)
Millipore filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	φ13 0.22 Nylon66
Rhodiola granules	Tibet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd.	210501
Salidroside (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DST200425-037
Ultra pure water systemic	Merck Millipore Ltd.	Milli-Q
Ultrasonic cleansing machine	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB-8200 DTS