JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يظهر هنا بروتوكول محسن لزراعة الديدان الخيطية الفردية المعزولة على وسائط صلبة في أجهزة متعددة الآبار دقيقة الصنع. يسمح هذا النهج بمراقبة الحيوانات الفردية طوال حياتها لمجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية المتعلقة بالشيخوخة والصحة ، بما في ذلك النشاط وحجم الجسم وشكله وهندسة الحركة والبقاء على قيد الحياة.

Abstract

تعد الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans من بين أكثر الأنظمة النموذجية شيوعا المستخدمة في أبحاث الشيخوخة نظرا لتقنيات الاستزراع البسيطة وغير المكلفة ، ودورة التكاثر السريع (~ 3 أيام) ، والعمر القصير (~ 3 أسابيع) ، والعديد من الأدوات المتاحة للتلاعب الجيني والتحليل الجزيئي. النهج الأكثر شيوعا لإجراء دراسات الشيخوخة في C. elegans ، بما في ذلك تحليل البقاء على قيد الحياة ، ينطوي على زراعة مجموعات من عشرات إلى مئات الحيوانات معا على وسائط نمو الديدان الخيطية الصلبة (NGM) في لوحات بتري. بينما يجمع هذا النهج بيانات عن مجموعة من الحيوانات ، فإن معظم البروتوكولات لا تتعقب الحيوانات الفردية بمرور الوقت. يظهر هنا بروتوكول محسن للاستزراع طويل الأجل للحيوانات الفردية على أجهزة بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) المصنعة تسمى WorMotels. يسمح كل جهاز باستزراع ما يصل إلى 240 حيوانا في آبار صغيرة تحتوي على NGM ، مع عزل كل بئر بواسطة خندق يحتوي على كبريتات النحاس يمنع الحيوانات من الفرار. بناء على وصف WorMotel الأصلي ، توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لقولبة كل جهاز وإعداده وتعبئته ، مع وصف للمضاعفات الفنية الشائعة ونصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. ضمن هذا البروتوكول ، توجد تقنيات للتحميل المتسق ل NGM صغير الحجم ، والتجفيف المتسق لكل من NGM والأغذية البكتيرية ، وخيارات لتقديم التدخلات الدوائية ، والتعليمات والقيود العملية لإعادة استخدام أجهزة PDMS ، ونصائح لتقليل الجفاف ، حتى في البيئات منخفضة الرطوبة. تسمح هذه التقنية بالمراقبة الطولية لمختلف المعلمات الفسيولوجية ، بما في ذلك النشاط المحفز ، والنشاط غير المحفز ، وحجم الجسم ، وهندسة الحركة ، والعمر الصحي ، والبقاء على قيد الحياة ، في بيئة مشابهة للتقنية القياسية للثقافة الجماعية على الوسائط الصلبة في ألواح بتري. تتوافق هذه الطريقة مع جمع البيانات عالية الإنتاجية عند استخدامها جنبا إلى جنب مع برامج الفحص المجهري والتحليل الآلي. أخيرا ، تمت مناقشة قيود هذه التقنية ، بالإضافة إلى مقارنة هذا النهج بطريقة تم تطويرها مؤخرا تستخدم الصواني الدقيقة لاستزراع الديدان الخيطية المعزولة على الوسائط الصلبة.

Introduction

يشيع استخدام Caenorhabditis elegans في دراسات الشيخوخة بسبب وقت جيلها القصير (حوالي 3 أيام) ، وقصر عمرها (حوالي 3 أسابيع) ، وسهولة الزراعة في المختبر ، ودرجة عالية من الحفظ التطوري للعمليات الجزيئية والمسارات مع الثدييات ، والتوافر الواسع لتقنيات التلاعب الجيني. في سياق دراسات الشيخوخة ، تسمح C. elegans بالتوليد السريع لبيانات طول العمر والسكان المسنين لتحليل الأنماط الظاهرية المتأخرة في الحيوانات الحية. يتضمن النهج النموذجي لإجراء دراسات شيخوخة الديدان القياس اليدوي لعمر مجموعة من الديدان المحفوظة في مجموعات من 20 إلى 70 حيوانا على وسائط نمو نيماتودا أجار صلبة (NGM) في ألواح بتري 6 سم1. يسمح استخدام المجموعات المتزامنة مع العمر بقياس العمر أو الأنماط الظاهرية المستعرضة في الحيوانات الفردية عبر السكان ، ولكن هذه الطريقة تمنع مراقبة خصائص الحيوانات الفردية بمرور الوقت. هذا النهج هو أيضا كثيفة العمالة ، وبالتالي تقييد حجم السكان الذين يمكن اختبارهم.

هناك عدد محدود من طرق الاستزراع التي تسمح بالمراقبة الطولية ل C. elegans الفردية طوال حياتها ، ولكل منها مجموعة مميزة من المزايا والعيوب. تسمح أجهزة الموائع الدقيقة ، بما في ذلك WormFarm2 و NemaLife3 وشريحة "السلوك"4 ، من بين أجهزة أخرى5،6،7 ، بمراقبة الحيوانات الفردية بمرور الوقت. وبالمثل ، فإن استزراع الديدان في الاستزراع السائل باستخدام ألواح متعددة الآبار يسمح بمراقبة الحيوانات الفردية أو مجموعات صغيرة من C. elegans بمرور الوقت 8,9. تمثل البيئة السائلة سياقا بيئيا متميزا عن بيئة الثقافة الشائعة على الوسائط الصلبة في ألواح بتري ، والتي يمكن أن تغير جوانب فسيولوجيا الحيوان ذات الصلة بالشيخوخة ، بما في ذلك محتوى الدهون والتعبير عن جينات الاستجابة للإجهاد10،11. القدرة على مقارنة هذه الدراسات مباشرة بغالبية البيانات التي تم جمعها عن الشيخوخة C. elegans محدودة بسبب الاختلافات في المتغيرات البيئية المهمة المحتملة. Worm Corral12 هو أحد الأساليب التي تم تطويرها لإيواء الحيوانات الفردية في بيئة تكرر بشكل أوثق ثقافة الوسائط الصلبة النموذجية. يحتوي Worm Corral على غرفة محكمة الغلق لكل على شريحة مجهرية باستخدام هيدروجيل ، مما يسمح بالمراقبة الطولية للحيوانات المعزولة. تستخدم هذه الطريقة التصوير القياسي برايت فيلد لتسجيل البيانات المورفولوجية ، مثل حجم الجسم ونشاطه. ومع ذلك ، يتم وضع الحيوانات في بيئة هيدروجيل كأجنة ، حيث تظل دون إزعاج طوال حياتها. وهذا يتطلب استخدام خلفيات وراثية متحولة أو محورة وراثيا معقمة مشروطا ، مما يحد من القدرة على الفحص الجيني ، حيث يجب عبور كل طفرة جديدة أو جين تحوير إلى خلفية ذات عقم مشروط ، والقدرة على فحص الأدوية ، حيث لا يمكن تطبيق العلاجات إلا مرة واحدة على الحيوانات كأجنة.

تسمح طريقة بديلة طورها مختبر Fang-Yen بزراعة الديدان على الوسائط الصلبة في الآبار الفردية لجهاز polydimethylsiloxane (PDMS) الدقيق يسمى WorMotel13,14. يتم وضع كل جهاز في صينية بئر واحدة (أي بنفس أبعاد لوحة 96 بئرا) ويحتوي على 240 بئرا مفصولة بخندق مملوء بمحلول مكروه لمنع الديدان من الانتقال بين الآبار. يمكن لكل بئر إيواء دودة واحدة طوال فترة حياتها. الجهاز محاط بكريات جل بولي أكريلاميد الممتصة للماء (يشار إليها باسم "بلورات الماء") ، ويتم إغلاق الدرج بفيلم مختبر Parafilm للحفاظ على الرطوبة وتقليل جفاف الوسائط. يسمح هذا النظام بجمع بيانات الصحة والعمر للحيوانات الفردية ، في حين أن استخدام الوسائط الصلبة يلخص بشكل أفضل البيئة التي تعاني منها الحيوانات في الغالبية العظمى من دراسات عمر C. elegans المنشورة ، مما يسمح بمزيد من المقارنات المباشرة. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير تقنية مماثلة باستخدام صواني البوليسترين الدقيقة التي كانت تستخدم في الأصل لمقايسات السمية المجهرية15 بدلا من جهاز PDMS16. تسمح طريقة microtray بجمع البيانات الفردية للديدان المستزرعة على وسائط صلبة وقد حسنت القدرة على احتواء الديدان في ظل ظروف من شأنها أن تسبب عادة الفرار (على سبيل المثال ، الضغوطات أو القيود الغذائية) ، مع المفاضلة هي أن كل microtray يمكن أن تحتوي فقط على 96 حيوانا16 ، في حين أن الجهاز متعدد الآبار المستخدم هنا يمكن أن يحتوي على ما يصل إلى 240 حيوانا.

يظهر هنا بروتوكول مفصل لإعداد الأجهزة متعددة الآبار التي تم تحسينها من أجل الاتساق من لوحة إلى أخرى وإعداد أجهزة متعددة بالتوازي. تم تكييف هذا البروتوكول من البروتوكول الأصلي من مختبر Fang-Yen13. على وجه التحديد ، هناك أوصاف لتقنيات لتقليل التلوث ، وتحسين التجفيف المتسق لكل من الوسائط الصلبة ومصدر الغذاء البكتيري ، وتقديم RNAi والأدوية. يمكن استخدام هذا النظام لتتبع الصحة الفردية والعمر والأنماط الظاهرية الأخرى ، مثل حجم الجسم وشكله. تتوافق هذه الأجهزة متعددة الآبار مع الأنظمة عالية الإنتاجية الحالية لقياس العمر الافتراضي ، والتي يمكن أن تزيل الكثير من العمل اليدوي المتضمن في تجارب العمر التقليدية وتوفر الفرصة لقياس طول العمر الآلي والمباشر وتتبع الصحة في C. elegans الفردية على نطاق واسع.

Protocol

1. إعداد حلول الأسهم والوسائط

ملاحظة: قبل البدء في إعداد الأجهزة متعددة الآبار ، قم بإعداد حلول ووسائط المخزون التالية.

  1. حلول المخزون لوسائط نمو الديدان الخيطية (NGM) و NGM منخفضة الذوبان (lmNGM):
    1. تحضير 1 M K 2 HPO4: أضف 174.18 جم من K2HPO4 إلى زجاجة سعة 1 لتر ، واملأها حتى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات المعقم. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة ، ويخزن في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. تحضير 1 M KPi ، درجة الحموضة 6.0: أضف 136.09 جم من KH2HPO4 إلى زجاجة سعة 1 لتر ، واملأها حتى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات المعقم. قم بالمعايرة باستخدام 1 M K2HPO4 إلى pH 6.0. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة ، ويخزن في RT.
    3. تحضير 1 م CaCl 2: أضف 73.5 جم من CaCl2 إلى زجاجة سعة 500 مل ، واملأها حتى 500 مل بالماء منزوع الأيونات المعقم. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة ، ويخزن في RT.
    4. تحضير 1 M MgSO 4: أضف 123.25 جم من MgSO4 إلى زجاجة سعة 500 مل ، واملأها حتى 500 مل بالماء منزوع الأيونات المعقم. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة ، ويخزن في RT.
    5. تحضير 5 ملغ / مل من الكوليسترول: الجمع بين 2.5 غرام من الكوليسترول ، 275 مل من الإيثانول 100 ٪ ، و 25 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم في زجاجة 500 مل العنبر. متجر في RT.
    6. تحضير 50 mM floxuridine: الجمع بين 0.1231 غرام من floxuridine و 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم في أنبوب مخروطي 15 مل. قم بتعقيمه بفلتر 0.22 ميكرومتر باستخدام حقنة سعة 10 مل. القسمة 1 مل لكل منها في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة ، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    7. تحضير 50 مجم / مل كاربينيسيلين: في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، امزج 500 مجم من الكربينيسيلين مع 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم. قم بتعقيمه بفلتر 0.22 ميكرومتر باستخدام حقنة سعة 10 مل. القسمة 1 مل لكل منها في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة ، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    8. تحضير 1 mM isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG): في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، ادمج 2.38 جم من IPTG مع 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم. قم بتعقيمه بفلتر 0.22 ميكرومتر باستخدام حقنة سعة 10 مل. القسمة 1 مل لكل منها في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة ، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    9. تحضير 100 مجم / مل أمبيسلين: في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، امزج 1 جم من الأمبيسلين مع 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم. قم بتعقيمه بفلتر 0.22 ميكرومتر باستخدام حقنة سعة 10 مل. القسمة 1 مل لكل منها في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة ، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. تحضير وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM) للصيانة العامة ل C. elegans
    1. لصنع 50 طبقا ، في دورق سعة 1 لتر ، امزج 10 جم من أجار باكتو ، و 1.5 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.25 جم من ببتون باكتو ، و 486 مل من الماء عالي النقاء. الأوتوكلاف على دورة سائلة (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة على الأقل للتعقيم.
    2. بعد الأوتوكلاف ، بعد أن تبرد الوسائط إلى 55 درجة مئوية ، أضف 12.5 مل من 1 M KPi ، و 500 ميكرولتر من 1 M MgSO4 ، و 500 ميكرولتر من 1 M CaCl2 ، و 500 ميكرولتر من 5 مجم / مل كوليسترول.
    3. باستخدام تقنية معقمة ، صب 10 مل من الوسائط في كل لوحة 60 مم (إجمالي 50). بعد أن تصلب الوسائط (بعد 30 دقيقة على الأقل من الصب) ، ماصة 300 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية (المحضرة وفقا للخطوة 4 والخطوة 10) التي نمت بين عشية وضحاها في وسط اللوحة. اترك اللوحة على المقعد ، مما يسمح للثقافة البكتيرية أن تجف وتنمو أكثر سمكا (1-2 أيام). قم بتخزين الأطباق على حرارة 4 درجات مئوية.
  3. تحضير الخليط المسبق لوسائط نمو الديدان الخيطية منخفضة الذوبان (lmNGM):
    1. في دورق سعة 500 مل ، امزج 4 جم من الأغاروز منخفض الذوبان ، و 0.5 جم من باكتو ببتون ، و 195 مل من الماء عالي النقاء. الأوتوكلاف على دورة سائلة (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة على الأقل للتعقيم.
    2. بينما لا تزال الوسائط منصهرة ، قم بتوزيع 10 مل من القسمة في أنابيب اختبار زجاجية معقمة. أغلق كل أنبوب اختبار باستخدام Parafilm متبوعا بغطاء أنبوب اختبار للحفاظ على الخليط المسبق lmNGM ومنع الجفاف. سوف تصلب الوسائط ويمكن تخزينها لمدة ~ 2 أسابيع في RT قبل الاستخدام.
  4. تحضير 142.8 mM كلوريد الصوديوم: في زجاجة 250 مل ، امزج 0.8345 جم من كلوريد الصوديوم و 100 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة ، ويخزن في RT.
  5. تحضير محلول المنظفات: في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، امزج 3 مل من Tween 20 و 7 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم. امزج جيدا ، وقم بتعقيمه بالفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر باستخدام حقنة سعة 10 مل ، وقم بتخزينه في RT.
  6. تحضير محلول كبريتات النحاس: في زجاجة معقمة سعة 50 مل ، امزج 20 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم ، و 0.5 جم من CuSO4 ، و 100 ميكرولتر من محلول المنظف (محضر في الخطوة 1.5). امزج حتى يذوب CuSO4 . متجر في RT.
  7. تحضير بلورات بولي أكريلاميد الممتصة للماء: في زجاجة ضغط آمنة للأوتوكلاف ، امزج 150 مل من الماء منزوع الأيونات و 1 جم من البوليمر فائق الامتصاص من النوع S. تخلط بلطف عن طريق قلب الزجاجة عدة مرات. الأوتوكلاف على دورة سائلة (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 20 دقيقة على الأقل ، ويخزن في RT.
  8. تحضير مرق الليزوجيني (LB): في دورق سعة 1 لتر أو أكبر ، امزج 20 جم من مسحوق LB مع 1 لتر من الماء منزوع الأيونات. القسمة إلى كأسين زجاجية سعة 500 mL. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة ، ويخزن في RT
  9. تحضير لوحات أجار مرق ليسوجيني (LB):
    1. في دورق سعة 1 لتر ، امزج 10 جم من مسحوق LB و 7.5 جم من Bacto Agar و 500 مل من الماء منزوع الأيونات. الأوتوكلاف على دورة سائلة (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة.
    2. إذا رغبت في ذلك، يجب إضافة المضادات الحيوية الاختيارية (بعد الأوتوكلاف، بعد تبريد الوسائط إلى 55 درجة مئوية): 500 ميكرولتر من الأمبيسلين 100 ملغ/مل. باستخدام تقنية معقمة، صب 20 مل من الوسائط في كل لوحة 100 مم (إجمالي 25)، واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. طباعة قالب جهاز متعدد الآبار 3D

ملاحظة: يتم تشكيل كل جهاز من PDMS باستخدام قالب مخصص مطبوع 3D. يمكن أن ينتج قالب واحد العديد من الأجهزة حسب الحاجة ؛ ومع ذلك ، في حالة محاولة إعداد أجهزة متعددة في نفس الوقت ، يلزم وجود قالب واحد مطبوع 3D لكل جهاز ليتم تصنيعه بالتوازي.

  1. قم بتنزيل ملف المحكمة الخاصة بلبنان (انظر الملف التكميلي 1).
  2. طباعة القالب مع طابعة 3D عالية الدقة.
    ملاحظة: يجب أن تكون دقة الطابعة عالية بما يكفي للسماح بأحجام ثابتة للبئر والخندق. دقة الطابعة المقترحة هي دقة XY لا تقل عن ~ 40 ميكرومتر ودقة طبقة تبلغ 28 ميكرومتر. المواد المستخدمة من قبل طابعة 3D لها نفس القدر من الأهمية ، حيث أن العديد من أنواع المواد ستمنع PDMS من المعالجة. من التجربة ، تعمل القوالب التي تنتجها طابعات PolyJet عالية الدقة (الدقة: المحور X = 600 نقطة في البوصة ، المحور Y = 600 نقطة في البوصة ، المحور Z = 1600 نقطة في البوصة) باستخدام مواد الطباعة Vero Black باستمرار. تم الاستعانة بمصادر خارجية للطباعة ثلاثية الأبعاد للقوالب المستخدمة في هذه الدراسة (يمكن العثور على تفاصيل الطباعة في جدول المواد).

3. إعداد جهاز متعدد الآبار

ملاحظة: يصف هذا القسم كيفية استخدام القالب المطبوع 3D لإنشاء جهاز PDMS متعدد الآبار.

  1. اضبطي فرن المعالجة على 55 درجة مئوية للسماح بالتسخين المسبق.
  2. حدد عدد الأجهزة المراد إعدادها دفعة واحدة. لكل جهاز ، امزج 60 جم من قاعدة PDMS و 6 جم من عامل المعالجة في وعاء وزن كبير يمكن التخلص منه (أو حاوية مماثلة يمكن التخلص منها) باستخدام ملعقة يمكن التخلص منها.
  3. ضع خليط PDMS في غرفة مفرغة لمدة 30 دقيقة عند −0.08 ميجا باسكال لإزالة الفقاعات.
  4. صب خليط PDMS في كل قالب مطبوع 3D. املأ القالب بالكامل ، مع امتداد خليط PDMS قليلا فوق الجزء العلوي من القالب. احتفظ بخليط PDMS الزائد لإعادة ملء القالب في حالة الانسكابات.
  5. ضع القالب المملوء وأي خليط PDMS إضافي في غرفة التفريغ لمدة 25 دقيقة عند −0.08 ميجا باسكال لإزالة أي فقاعات تم إنشاؤها أثناء عملية الصب.
  6. قم بإزالة القالب المملوء من غرفة التفريغ ، وقم بفرقعة أي فقاعات متبقية باستخدام ملعقة يمكن التخلص منها. استخدم الملعقة لتنظيف أي حطام مرئي أو فقاعات متبقية على حافة القالب بعيدا عن الآبار. يمكن أن تتداخل أي حطام أو فقاعات متبقية مع التصوير في الخطوات اللاحقة.
  7. تأكد من ملء القالب بالكامل بخليط PDMS ؛ من الشائع أن ينسكب جزء صغير من الخليط أثناء وجوده في غرفة التفريغ أو أثناء النقل. أعد التعبئة باستخدام خليط PDMS الإضافي الذي تم تفريغه في الخطوة 3.5. لا ينبغي أن يؤدي ذلك إلى إنشاء فقاعات ، ولكن إذا كان أي شكل ، فيمكن تنظيفها برفق إلى جانب القالب باستخدام الملعقة.
  8. ضع لوح أكريليك مسطح أعلى القالب المملوء ب PDMS عن طريق وضع حافة واحدة أولا وخفض الأخرى ببطء حتى يستقر الأكريليك بشكل مسطح فوق القالب ، مما يؤدي إلى إزاحة أي خليط PDMS يمتد فوق الحافة. إذا تشكلت فقاعات أثناء وضع لوح الأكريليك ، فقم بإزالة الأكريليك ببطء ، وأعد ملء القالب بخليط PDMS إذا لزم الأمر ، وأعد تشغيل موضع الأكريليك. ستشكل لوح الأكريليك قاعا مسطحا للجهاز المصبوب ويضمن أن جميع الآبار في نفس المستوى بالنسبة للقاعدة.
  9. ضع وزن 2.5 رطل فوق الأكريليك. يمكن تكديس قوالب متعددة ، لكل منها لوح أكريليك منفصل. ضعي القوالب المرجحة في الفرن واتركيها تلتئم على حرارة 55 درجة مئوية طوال الليل.
  10. في اليوم التالي ، قم بإزالة الأوزان والقوالب من الفرن.
  11. اعمل بعناية شفرة حلاقة بين الأكريليك و PDMS المعالج لكسر الختم. قم بإزالة الأكريليك بعناية من أعلى القالب. سيتم تعيين PDMS عند هذه النقطة ، ويمكن أن تستغرق إزالة الأكريليك بعض القوة.
  12. باستخدام ماكينة حلاقة أو ملعقة معدنية ، قم بفك جوانب PDMS المعالجة بعناية من القالب. من السهل تمزيق PDMS في هذه المرحلة ؛ اعمل ببطء ورفق حول الحافة لإزالة جهاز PDMS سليما.
    ملاحظة: القوالب المطبوعة حديثا لزجة بشكل خاص للاستخدامات الثلاثة الأولى ، وغالبا ما يتمزق PDMS أثناء محاولة إزالة الجهاز. مع المزيد من الاستخدامات ، يصبح من الأسهل إزالة PDMS المعالج من القالب.
  13. لف الجهاز بورق الألمنيوم ، وأغلقه بشريط الأوتوكلاف. الأوتوكلاف في دورة جافة لمدة 15 دقيقة على الأقل عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة للتعقيم. بعد التعقيم ، قم بتخزين الأجهزة المغلفة على المقعد ، واستخدمها حسب الحاجة.

4. خطوط البكتيريا

ملاحظة: ابدأ في تحضير البكتيريا التي سيتم استخدامها كمصدر غذاء للديدان أثناء وجودها على الجهاز متعدد الآبار. البكتيريا الأكثر شيوعا هي سلالة الإشريكية القولونية OP50 (أو سلالة HT115 لتجارب RNAi). أكمل هذه الخطوة قبل 2 أيام على الأقل من إضافة الديدان إلى الجهاز.

  1. ضع البكتيريا على طبق LB جديد. تأكد من تضمين أي إضافات انتقائية خاصة بالسلالة (على سبيل المثال ، الأمبيسلين لاختيار البلازميد الذي يمنح مقاومة الأمبيسلين للبكتيريا) في ألواح LB.
  2. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية طوال الليل (~ 18 ساعة) للسماح للمستعمرات بالنمو.

5. إعداد الجهاز متعدد الآبار لتحميل الوسائط

ملاحظة: سطح مادة PDMS المصنوعة من السيليكون التي يتكون منها الجهاز كاره للماء ، مما يمنع ملء الآبار الصغيرة الحجم والخنادق المكروهة ب NGM وكبريتات النحاس ، على التوالي. للتحايل على هذه المشكلة ، يتم استخدام بلازما الأكسجين لتعديل خصائص سطح الجهاز مؤقتا ليكون محبا للماء ، مما يسمح بملء الآبار والخندق في غضون فترة زمنية محدودة (تصل إلى ~ 2 ساعة). يوضح هذا القسم خطوات إكمال عملية تنظيف البلازما. أكمل هذه الخطوة على الأقل 1 يوم قبل اكتشاف آبار الجهاز بالبكتيريا ، حيث يمكن أن تتداخل الآثار المتبقية لتنظيف البلازما مع اكتشافها. بالنظر إلى توقيت الأقسام 5-7 ، فإن الحد العملي لهذه الخطوات لكل فني هو ثلاثة أجهزة بالتوازي.

  1. سخني حاضنة حمام حبة جافة إلى 90 درجة مئوية استعدادا للقسم 6.
  2. نظرا لأن إجمالي حجم الوسائط اللازم لملء آبار جهاز متعدد الآبار صغير مقارنة بألواح بتري ، قم بإعداد دفعة كبيرة من NGM ، وقم بقسمها في أنابيب اختبار (انظر الخطوة 1.3).
    ملاحظة: يمكن القيام بذلك في وقت مبكر ، حيث يمكن تخزين أنابيب الوسائط على مقاعد البدلاء لمدة ~ 2 أسابيع. إذا تم تحضير الوسائط ونقلها إلى أنابيب ، فانتقل إلى الخطوة 5.3.
  3. أثناء ارتداء القفازات ، قم بفك غلاف جهاز متعدد الآبار معقم ؛ تجنب لمس أي من الآبار. قم بقص شق صغير في الزاوية العلوية اليمنى من الجهاز للإشارة إلى عدد المرات التي تم فيها استخدامه / إعادة استخدامه (انظر القسم 15 أدناه للحصول على إرشادات وتوصيات لتنظيف وإعادة استخدام كل جهاز).
  4. ضع ما يصل إلى ثلاثة أجهزة غير مغلفة في منظف البلازما مع توجيه الآبار لأعلى. قم بتشغيل منظف البلازما.
    ملاحظة: التعليمات التفصيلية التالية خاصة بمنظف البلازما Plasma Etch PE-50. يجب تكييف الخطوات والإعدادات المحددة وربما إعادة تحسينها لمنظفات البلازما الأخرى.
    1. تأكد من ضبط مستوى طاقة منظف البلازما على 75٪.
    2. تأكد من أن صمامات التهوية والعزل كلاهما في وضع إيقاف التشغيل .
    3. افتح الصمام الرئيسي على خزان الأكسجين. انتظر حتى ينخفض ضغط المنظم إلى ما بين 15 رطل لكل بوصة مربعة و 20 رطل لكل بوصة مربعة ، ثم أدر صمام العزل إلى وضع التشغيل .
    4. قم بتشغيل مضخة التفريغ ومنظف البلازما.
    5. أدخل الإعدادات التالية على منظف البلازما (الاستخدام الأول)، أو تحقق من صحة الإعدادات المبرمجة مسبقا:
      وقت البلازما: 3:00 دقيقة
      نقطة ضبط الفراغ: 149.5 mTorr
      تنفيس الغلاف الجوي: 45 ثانية
      تنفيس التطهير: 5 ثوان
      استقرار الغاز: 15 ثانية
      إنذار الفراغ: 3:00 دقيقة
      إيقاف تشغيل الدورة تلقائيا: تشغيل
    6. اضغط على Enter للانتقال إلى قائمة الأوامر. استخدم مفتاح السهم لليمين لتحديد قائمة الإعداد، ثم اضغط على مفتاح الإدخال Enter. قم بالتمرير خلال جميع الإعدادات بالضغط على Enter لتأكيد كل إعداد حالي ثم السهم الأيمن للانتقال إلى الإعداد التالي.
    7. ارجع إلى قائمة الأوامر بالضغط على السهم لأعلى ثم السهم الأيسر.
    8. في شاشة قائمة الأوامر ، اضغط على مفتاح الإدخال Enter. حدد أوامر PLASMA بالضغط على Enter. سيتنقل النظام عبر المراحل التالية:
      ضخ البلازما
      استقرار الغاز: خلال هذه المرحلة ، اضبط مقبض Gas 1 على منظف البلازما حتى يصل مقياس التدفق إلى 10 سم مكعب / دقيقة.
      وقت البلازما
      تطهير الضخ
      دورة البلازما كاملة
      تنفيس الغرفة
      ملاحظة: يجب أن تستغرق هذه العملية حوالي 5-10 دقائق حتى تكتمل. عند اكتمال جميع المراحل ، يتم عرض قائمة الأوامر على الشاشة مرة أخرى. إذا لم ينخفض الضغط بدرجة كافية أثناء مرحلة ضخ البلازما ، فلن ينتقل منظف البلازما إلى المرحلة التالية ، وستعرض الشاشة رسالة خطأ. إذا حدث هذا ، تحقق من زيت مضخة التفريغ. إذا كانت مستويات الزيت منخفضة أو كان الزيت غائما / متسخا ، فإن تغيير الزيت يمكن أن يسمح لضغط الفراغ بالوصول إلى المستوى المطلوب.
    9. قم بإيقاف تشغيل الصمام الرئيسي على خزان الأكسجين.
    10. ببطء شديد ، أدر صمام التهوية إلى وضع التشغيل ، واسمح لضغط المنظم لخزان الأكسجين بالعودة إلى الصفر.
    11. أدر صمام العزل إلى وضع إيقاف التشغيل .
    12. قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ ومنظف البلازما.
      ملاحظة: تعديل السطح المحب للماء للجهاز متعدد الآبار بواسطة منظف البلازما مؤقت ويصبح أقل فعالية تدريجيا بمرور الوقت (حتى حوالي 2 ساعة). تابع القسم 6 والقسم 7 في أسرع وقت ممكن.

6. ملء الآبار ب lmNGM

ملاحظة: يجب تشغيل حاضنة حمام الخرزة الجافة وتسخينها مسبقا من الخطوة 5.1. تأكد من وصول الحمام إلى 90 درجة مئوية.

  1. قم بتعقيم صينية بوليسترين واحدة ذات بئر واحد لكل جهاز عن طريق رش الجزء الداخلي من الدرج بإيثانول بنسبة 70٪ ومسحه جافا بمسح المهام.
  2. أخرج كل جهاز من منظف البلازما بيد قفاز ، وضعه في صينية نظيفة.
  3. ضع حوض ماصة سعة 25 مل يمكن التخلص منه في حاضنة حمام الخرز بعد تسخينه إلى 90 درجة مئوية.
  4. اجمع أنبوبا واحدا من الخليط المسبق lmNGM المتصلب لكل جهاز ليتم ملؤه (انظر الخطوة 1.3).
  5. ضع أنابيب اختبار lmNGM قبل الخليط في دورق زجاجي سعة 200 مل ، وقم بإزالة الأغطية و Parafilm. الميكروويف لمدة ~ 20 ثانية حتى تذوب الوسائط بدرجة كافية لتصب (وجود بعض الوسائط الصلبة جيد في هذه المرحلة).
  6. امزج الخليط المسبق lmNGM المنصهر من أنابيب اختبار متعددة في دورق آخر معقم سعة 200 مل. استمر في الميكروويف لمدة 20 ثانية إضافية لتصل إلى إجمالي 40 ثانية. إذا بدأ الخليط المسبق lmNGM في الغليان ، أوقف الميكروويف ، واترك الخليط المسبق lmNGM يستقر قبل المتابعة.
  7. قم بإزالة الخليط المنصهر lmNGM مسبقا من الميكروويف ، واتركه يبرد إلى ~ 60 درجة مئوية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، سوف تبرد الوسائط وتعيد صلابتها بعد ~ 5 دقائق. انتقل فورا إلى الخطوة 6.8 والخطوة 6.9.
  8. لكل 10 مل من الخليط المسبق lmNGM ، أضف ما يلي (بالترتيب): 250 ميكرولتر من 1 M KPi ، 10 ميكرولتر من 1 M MgSO4 ، 10 ميكرولتر من 1 M CaCl2 ، و 10 ميكرولتر من 5 ملغ / مل كوليسترول.
    1. لمنع تفقيس البيض عند مراقبة البالغين على الجهاز ، أضف 10 ميكرولتر من 50 mM floxuridine.
    2. لاختيار بلازميد RNAi وللحث على التعبير عن الحمض النووي الريبي ، أضف 5 ميكرولتر من 50 مجم / مل كاربينيسيلين و 12 ميكرولتر من 1 mM IPTG.
      ملاحظة: يمكن تغيير المضادات الحيوية أو المواد المضافة الأخرى اعتمادا على تصميم التجربة. يمكن أيضا إضافة مركبات الاختبار / الأدوية إلى الوسائط في هذه المرحلة.
  9. صب lmNGM المنصهر في حوض 25 مل في حمام الخرز.
  10. املأ آبار الجهاز باستخدام lmNGM باستخدام ماصة مكرر متعدد القنوات سعة 200 ميكرولتر.
    1. اضبط المكرر لتوزيع حصص 14 ميكرولتر (يمكن الاستغناء عن 14 ميكرولتر حتى 14 مرة في حالة استخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر).
    2. قم بتركيب خمسة أطراف ماصة. آبار الجهاز لها نفس التباعد مثل لوحة 384 بئر. يتم تباعد الماصات القياسية متعددة القنوات بحيث يمكن للمستخدم ماصة في كل بئر أخرى في صف / عمود.
    3. قم بتحميل النصائح باستخدام lmNGM المنصهر. قم بتوزيع أول 14 ميكرولتر مرة أخرى في الحوض المحتوي على lmNGM.
    4. التحرك بسرعة ولكن بعناية ، قم بتوزيع 14 ميكرولتر في الآبار الداخلية (بيضاء في الشكل 1 ب) ، بدءا من تلك المميزة بعلامة "x" في الشكل 1B والانتقال عبر اللوحة إلى اليمين ثم لأسفل ، والاستغناء عن ما مجموعه 12 مرة (60 بئرا).
    5. قم بتوزيع lmNGM المتبقي مرة أخرى في الحوض ، حيث أن القسمة النهائية عادة ما تكون أقل من 14 ميكرولتر.
    6. كرر الخطوات 6.10.3-6.10.5 حتى يتم ملء جميع الآبار الداخلية.
    7. بعد ذلك ، اضبط المكرر على توزيع حصص 15 ميكرولتر. كرر الخطوات 6.10.3-6.10.5 ، ولكن بدلا من الآبار الداخلية ، املأ الحلقة الخارجية للآبار (رمادي في الشكل 1 ب) ، بدءا من الآبار المميزة بعلامة "+" في الشكل 1 ب والتحرك حول الحافة الخارجية للوحة.
      ملاحظة: اعمل بسرعة حتى لا تتجمد الوسائط في أطراف الماصة. تجنب انسكاب أي lmNGM في الخندق. تميل الآبار الخارجية إلى الجفاف بسرعة أكبر. يسمح 1 ميكرولتر إضافي من lmNGM للبئر المجفف النهائي أن يكون له سطح مستو في نفس وقت التجفيف مثل الآبار الداخلية.
  11. كخطوة لمراقبة الجودة ، افحص كل بئر لتحديد تلك التي بها عيوب قد تتداخل مع التصوير ، بما في ذلك الآبار غير المملوءة (سطح lmNGM غارق أسفل حافة البئر) ، مملوء بشكل مفرط (سطح lmNGM له قمة مقببة) ، وتحتوي على فقاعات أو حطام.
  12. قم بإزالة lmNGM المتصلب من الآبار غير المرضية باستخدام معول قصير من أسلاك البلاتين أو شفاط فراغ. أعد ملء الآبار الفارغة ب lmNGM المنصهر الطازج. أيضا ، قم بإزالة أي وسائط تفيض في الخندق باستخدام معول سلك بلاتيني قصير أو شفاط فراغ.

7. إضافة كبريتات النحاس إلى الخندق

ملاحظة: آبار هذا الجهاز محاطة بخندق مستمر. هنا ، يمتلئ الخندق بكبريتات النحاس ، التي تعمل كطارد وتردع الديدان عن الفرار من آبارها.

  1. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من محلول كبريتات النحاس (انظر الخطوة 1.6) في خندق الجهاز في كل زاوية ، 2x لكل زاوية. يجب أن يكون هذا حجما كبيرا بما يكفي لتدفق كبريتات النحاس عبر الخندق بأكمله. احرص على عدم ملء الخندق في أي وقت ؛ يجب ألا تلمس كبريتات النحاس السطح العلوي للآبار.
  2. إذا لم تتدفق كبريتات النحاس بسهولة عبر الخندق بأكمله ، فاستخدم معول سلك بلاتيني قصير للمساعدة في كسر التوتر وسحب كبريتات النحاس عبر الخندق.
  3. بعد أن تتدفق كبريتات النحاس عبر الخندق بأكمله ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من كبريتات النحاس من الخندق باستخدام ماصة 200 ميكرولتر أو شفط مع فراغ. ستكون البقايا المتبقية كافية لردع الديدان عن مغادرة آبارها. إن ترك الخندق مليئا بمحلول كبريتات النحاس يخاطر بتسرب كبريتات النحاس إلى الآبار ، مما قد يتسبب في فرار الديدان.

8. إضافة بلورات الماء المعقمة

ملاحظة: للحفاظ على الرطوبة داخل اللوحة ومنع جفاف lmNGM ، كل جهاز محاط ببلورات بولي أكريلاميد مشبعة تمتص الماء.

  1. تحضير بلورات الماء (انظر الخطوة 1.7).
  2. باستخدام زجاجة ضغط ، أضف بلورات الماء في الفراغات بين الجهاز وجدران الدرج. أغلق غطاء الدرج ، ولف الجوانب الأربعة بقطعة من Parafilm. أضف قطعتين إضافيتين من Parafilm لإغلاق اللوحة تماما.
    ملاحظة: يمكن تحضير بلورات الماء في دورق وغرفها في الدرج باستخدام ملعقة معقمة. ومع ذلك ، فإن هذا يضيف وقتا إلى الإجراء ويزيد من الوقت الذي يكون فيه كل درج مفتوحا ومعرضا للملوثات المحتملة.
  3. اترك الجهاز المختوم على المقعد حتى اليوم التالي عندما تكون البكتيريا جاهزة للرصد. تأكد من تخزين الأجهزة بحيث تكون الآبار متجهة لأعلى بعد إضافة lmNGM.

9. إعداد مجموعة متزامنة مع العمر من الديدان

ملاحظة: تنتج الخطوات التالية مجموعة متزامنة من الديدان الجاهزة للإضافة إلى الجهاز متعدد الآبار في المرحلة اليرقية الرابعة (L4). ومع ذلك ، يمكن أيضا إضافة الديدان في مراحل مختلفة من التطور. يجب إكمال هذه الخطوة قبل يومين من إضافة الديدان إلى الجهاز إذا كانت L4s مطلوبة. ضبط توقيت التزامن لمرحلة الحياة المطلوبة.

  1. لدراسات الشيخوخة المتسقة ، حافظ على C. elegans على ألواح NGM القياسية (انظر الخطوة 1.2 عند 20 درجة مئوية في ظل ظروف التغذية الجيدة).
  2. احصل على مجموعة متزامنة من الحيوانات من صفيحة مخزون عبر الطرق القياسية ، على سبيل المثال ، تبييض17 أو وضع البيضالموقوت 1.
  3. أضف البيض المعزول إلى طبق NGM المرقط بالبكتيريا. سوف يفقس البيض على هذه اللوحة ، وسوف تصل الديدان إلى مرحلة اليرقات L4 في 2 أيام للحيوانات البرية.

10. تلقيح الثقافة البكتيرية

ملاحظة: تستخدم البكتيريا كمصدر غذائي أساسي لسلالات C. elegans ، وأكثرها شيوعا سلالات الإشريكية القولونية OP50 أو HT115. تتركز البكتيريا 10 أضعاف ، والتي ينبغي حسابها في حجم الثقافة المعدة. قم بإعداد مزرعة بكتيرية في اليوم السابق لاكتشاف الجهاز.

  1. من لوحة LB المحضرة في الخطوة 4 ، اختر مستعمرة واحدة ، وقم بتلقيح 12 مل من LB المعقم لكل جهاز ليتم رصده. قم بتضمين عوامل انتقائية إذا لزم الأمر لسلالة البكتيريا المستخدمة.
  2. تنمو الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها (~ 18 ساعة) في حاضنة 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند ~ 250 دورة في الدقيقة.

11. اكتشاف الآبار بالبكتيريا المركزة

ملاحظة: تتم إضافة كمية صغيرة من البكتيريا المركزة إلى كل بئر ، وهو ما يكفي لتغذية الديدان طوال عمرها على الجهاز. يجب تجفيف الثقافة البكتيرية قبل إضافة الديدان إلى الآبار. نظرا لأن حجم الوسائط في كل بئر صغير (14-15 ميكرولتر) بالنسبة لحجم البكتيريا المضافة (5 ميكرولتر) ، يمكن أن يؤثر المحتوى الكيميائي للوسائط البكتيرية على البيئة الكيميائية للبئر. لتفسير ذلك ، يتم تركيز البكتيريا وإعادة تعليقها في الماء المالح لإزالة LB المستنفد مع تجنب الإجهاد الناقص التناضح. لا يوجد ملح مضاف إلى وصفة lmNGM (انظر الخطوات 1.3-1.4) حيث يتم إضافته في هذه المرحلة.

  1. بعد زراعة البكتيريا بين عشية وضحاها كما هو موضح في القسم 10 ، ركز الثقافة البكتيرية 10x. قم بإذابة البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند ~ 3,400 × جم لمدة 20 دقيقة ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 1/10 من حجم الاستزراع الأصلي البالغ 142.8 mM NaCl (انظر الخطوة 1.4). على سبيل المثال ، لاكتشاف جهاز واحد يحتوي على 240 بئرا ، قم بتدوير 12 مل من المزرعة وإعادة التعليق في 1.2 مل من 142.8 مللي مول كلوريد الصوديوم.
    ملاحظة: يمكن إضافة مركبات الاختبار / الأدوية إلى الثقافة البكتيرية المعاد تعليقها قبل اكتشافها.
  2. باستخدام ماصة متكررة ، اكتشف كل بئر مع 5 ميكرولتر من البكتيريا المركزة. تجنب الاتصال المباشر بسطح lmNGM ، حيث يمكن لطرف الماصة أن يخترق lmNGM ويسمح للدودة بالحفر تحت سطح البئر. احرص على عدم ترك البكتيريا تتسرب إلى الخندق لأن الديدان ستنجذب إليه وتهرب إلى الخندق.
  3. جفف البكتيريا المرقطة مع إزالة أغطية الدرج. هذه الخطوة مهمة لسلامة بيئة البئر على المدى الطويل ، وهناك مجموعة متنوعة من الطرق لتجفيف الأجهزة المرقطة. مهما كانت الطريقة المستخدمة ، تأكد من بقاء الجهاز في بيئة معقمة ، حيث يحتاج إلى الجلوس مكشوفا أثناء جفاف البكتيريا. زيادة تدفق الهواء يقلل بشكل كبير من وقت التجفيف. يمكن إجراء التجفيف كما هو موضح في الخطوات أدناه:
    1. اترك الجهاز مكشوفا في حاوية نظيفة ومحكمة الغلق ، مثل صندوق بلاستيكي تم تنظيفه باستخدام مبيض بنسبة 10٪ ، متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول. قد تستغرق طريقة التجفيف هذه عدة ساعات.
    2. ضع الأجهزة مكشوفة في غطاء تدفق رقائقي معقم (على غرار الطريقة المفضلة أدناه).
    3. قم بتجفيف الأجهزة باستخدام "صندوق تجفيف" مصمم خصيصا (الطريقة المثلى المتبعة في هذه الدراسة) ، والذي يمكن بناؤه بأقل تكلفة باستخدام مراوح علبة الكمبيوتر ومرشحات HEPA (انظر الملف التكميلي 1).
      ملاحظة: بغض النظر عن الطريقة المستخدمة ، يجب تحسين خطوة التجفيف للبيئة المحلية. راقب بشكل متكرر مدى سرعة جفاف الآبار حتى يتم تحديد وقت التجفيف النموذجي. في بيئة منخفضة الرطوبة ، يؤدي استخدام صندوق التجفيف إلى وقت تجفيف ~ 30-40 دقيقة. لا تدع الألواح تجف كثيرا ، لأن الوسائط الموجودة في الآبار سوف تتقلص وتغرق. من الأفضل إزالة الجهاز من الجفاف بينما لا تزال بعض الآبار رطبة بدلا من تركه يجف لفترة أطول وربما يفرط في تجفيف عدد كبير من الآبار.
  4. تحقق من بلورات الماء. إذا جفت غالبية بلورات الماء في الدرج وفقدت حجمها أثناء عملية التجفيف ، أضف المزيد إلى الدرج.
  5. بعد أن تجف البكتيريا ، أضف الديدان على الفور (القسم 12) أو أغلق الدرج لاستخدامه لاحقا. لإغلاق ، أغلق غطاء الدرج ، ولف الجوانب الأربعة بقطعة واحدة من Parafilm. كرر مرتين لما مجموعه ثلاث طبقات بارافيلم. بعد لف الدرج بالكامل ، يمكن ترك الجهاز على المقعد في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 4 أيام قبل إضافة الديدان (القسم 12).

12. إضافة الديدان إلى الجهاز متعدد الآبار

  1. أضف يدويا دودة واحدة لكل بئر إلى كل بئر باستخدام معول بلاتيني لنقل الحيوانات من ألواح الديدان المعدة في القسم 9. اختر فقط الديدان التي هي في مرحلة الحياة والعمر المطلوبين.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي أخذ أكثر من 1 ساعة لإضافة الديدان إلى الجهاز إلى جفاف lmNGM ، لذلك يجب إضافة الديدان في أسرع وقت ممكن. يمكن أن يساعد اختيار العديد من الديدان (20+) في وقت واحد قبل إضافتها إلى آبار الجهاز في زيادة السرعة.

13. الانتهاء من إعداد الجهاز للاستخدام على المدى الطويل

ملاحظة: تضمن هذه الخطوات بقاء آبار الجهاز رطبة طوال مدة التجربة.

  1. افحص بلورات الماء. تأكد من أن بلورات الماء مستوية مع الجزء العلوي من الجهاز ولكن لا تفيض عليه. أضف بلورات ماء إضافية إلى الدرج إذا لزم الأمر.
  2. أضف قطرة من محلول المنظف المحضر (انظر الخطوة 1.5) إلى داخل غطاء الدرج ، وافركه بمسح المهمة حتى يجف محلول المنظف. هذا يمنع الضباب على الغطاء بعد إغلاق الجهاز داخل الدرج بحيث تكون الديدان مرئية بوضوح.
  3. لف الصينية بثلاث قطع من Parafilm باستخدام تقنية محددة تعزز سلامة ختم Parafilm على المدى الطويل.
    1. قم بتمديد قطعة من Parafilm قليلا بحيث تغطي جانبين فقط من الدرج. كرر هذا مع قطعة ثانية من Parafilm لتغطية الجانبين الآخرين.
    2. ضع طبقات فوق الطبقة الأولى من Parafilm ، خذ قطعة أخيرة من Parafilm ، وقم بتمديدها بالكامل ، ولف الجوانب الأربعة. إذا تم إغلاقها بشكل صحيح ، يجب أن تظل آبار الجهاز رطبة لمدة ~ 2 أشهر.
      ملاحظة: يجب مراقبة سلامة Parafilm كل 1-2 أسابيع ، ويجب استبدال Parafilm في حالة كسره.
  4. قم بإزالة أي بصمات أصابع من أعلى الدرج باستخدام مسح مهمة مبلل بنسبة 70٪ من الإيثانول.

14. جمع البيانات

ملاحظة: الغرض من هذه الدراسة هو وصف منهجية الثقافة. بمجرد ملئها ، تتوافق الأجهزة متعددة الآبار مع المراقبة الطولية لمجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية. هنا ، يتم توفير إرشادات أساسية لقياس العديد من المعلمات الأكثر شيوعا.

  1. عمر: راقب العمر الافتراضي عن طريق النقر على اللوحة أو تعريض الديدان لضوء أزرق ساطع كل 1-3 أيام. سجل على أنه ميت إذا لم يتم ملاحظة أي حركة. تتوافق هذه الأجهزة متعددة الآبار أيضا مع خطوط أنابيب التصوير والتحليل الآلي لتقدير العمرالافتراضي 13,18.
  2. النشاط: راقب نشاط الحيوانات الفردية طوال الحياة عن طريق التقاط صور أو مقاطع فيديو ثابتة للحيوانات في آبار الجهاز وتقييم المسافة المقطوعة أو السرعة أو مقاييس الحركة الأخرى. تتوافق الأجهزة أيضا مع خطوط أنابيب التصوير والتحليل الآلي لتقدير النشاط13,18.
  3. حجم الجسم وشكله: مراقبة التغيرات في حجم الجسم وشكله عن طريق التقاط صور ثابتة للحيوانات في آبار الجهاز وتحديد المعلمات البصرية باستخدام تقنيات التصوير القياسية. من حيث المبدأ ، يجب أن تكون طريقة الاستزراع هذه متوافقة مع البرامج الحالية لإجراء تقييم أكثر تطورا لشكل جسم الدودة19،20،21.

15. إعادة استخدام الأجهزة

ملاحظة: بعد اكتمال التجربة ، يمكن تنظيف الأجهزة متعددة الآبار وإعادة استخدامها حتى ثلاث مرات. تبدأ إعادة الاستخدام الإضافية في التأثير على الأنماط الظاهرية للدودة ، والتي ربما تكون ناجمة عن مواد كيميائية من الوسائط أو البكتيريا المتراكمة في جدران مادة PDMS.

  1. تخلص من Parafilm ، وقم بإزالة الجهاز من الدرج. تحقق من الشقوق الموجودة في الزاوية العلوية اليمنى من الجهاز ، والتي تشير إلى عدد مرات استخدامه. إذا تم استخدامه ثلاث مرات ، فتخلص من الجهاز. إذا تم استخدامه أقل من ثلاث مرات ، فقم بتنظيفه وإعادة استخدامه.
    ملاحظة: الصواني مصنوعة من البوليسترين وليست ملامسة مباشرة ل lmNGM أو البكتيريا أو أي إضافات للوسائط. يمكن إعادة استخدامها عدة مرات طالما ظلت واضحة بصريا.
  2. اشطف أي بلورات ماء متبقية من الصينية. رش الجزء الداخلي من الدرج بمحلول تبييض بنسبة 10٪ ، واتركه لمدة 10 دقائق. اشطفه بالماء منزوع الأيونات وجففه على الفور لتجنب بقع الماء.
  3. أمسك الجهاز تحت الماء الجاري لبدء تنظيف الوسائط من الآبار. قم بثني الجهاز ولفه برفق تحت الماء للمساعدة في فك الوسائط من الآبار ، لكن لا تنحني حتى يتمزق الجهاز. اختر أي وسائط متبقية عالقة في الآبار بطرف ماصة سعة 200 ميكرولتر.
  4. املأ دورق سعة 2 لتر بقضيب تقليب ~ 3/4 ممتلئ بالماء منزوع الأيونات ، واتركه حتى يغلي على طبق ساخن.
  5. أضف جهازا أو جهازين متعددي الآبار وشريط تحريك إلى الماء المغلي. قم بتشغيل التحريك المغناطيسي إلى سرعة منخفضة (~ 200 دورة في الدقيقة) لتحريك الأجهزة في الماء برفق. اترك الأجهزة تغلي لمدة 10 دقائق.
  6. قم بإزالة الأجهزة من الماء باستخدام ملاقط معدنية ، وضعها بشكل جيد لأسفل على مناشف ورقية لتصريفها. اترك الأجهزة تجف على الأقل بين عشية وضحاها.
  7. عندما تجف الأجهزة تماما ، لفها بورق ، وختمها بشريط الأوتوكلاف. اكتب على شريط الأوتوكلاف عدد المرات التي تم فيها استخدام الجهاز. الأوتوكلاف في دورة جافة لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية للتعقيم. الأجهزة جاهزة الآن لإعادة الاستخدام.

النتائج

يمكن استخدام نظام ثقافة WorMotel لجمع مجموعة متنوعة من البيانات ، بما في ذلك ما يتعلق بالعمر الافتراضي والعمر الصحي والنشاط. استخدمت الدراسات المنشورة أجهزة متعددة الآبار لدراسة العمر والصحة 13،14 ، والسكون والنوم 22،23،24 ، والسلوك

Discussion

يعد نظام WorMotel أداة قوية لجمع البيانات الفردية لمئات من C. elegans المعزولة بمرور الوقت. بعد الدراسات السابقة التي استخدمت أجهزة متعددة الآبار للتطبيقات في السكون التنموي والسلوك الحركي والشيخوخة ، كان الهدف من هذا العمل هو تحسين إعداد الأجهزة متعددة الآبار للمراقبة طويلة الأجل للنشاط و?...

Disclosures

يذكر المؤلفون أنه ليس لديهم أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل NIH R35GM133588 إلى G.L.S. ، وهي جائزة محفز من الأكاديمية الوطنية الأمريكية للطب إلى G.L.S. ، وصندوق مبادرة التكنولوجيا والبحوث في ولاية أريزونا الذي يديره مجلس حكام أريزونا ، ومؤسسة إليسون الطبية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2.5 lb weightCAP BarbellRP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)Falken DesignACRYLIC-CL-3-8/1224Large sheet cut to smaller sizes 
Ampicillin sodium saltSigma-AldrichA9518
Autoclavable squeeze bottleNalgene2405-0500
Bacto agarBD Difco214030
Bacto peptoneThermo Scientific211677
Basin, 25 mLVWR89094-664Disposable pipette basin 
Cabinet style vacuum desiccator SP Bel-ArtF42400-4001Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. 
CaCl2Acros Organics349615000
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2Wildtype strain
Carbenicillin GoldBioC-103-25
CentrifugeBeckman360902
CholesterolICN Biomedicals Inc101380
Compressed oxygen tankAirgasUN1072
CuSO4Fisher ChemicalC493-500
Dry bead bath incubatorFisher Scientific11-718-2
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Standard labratory food for C. elegans
EthanolMilliporeex0276-4
FloxuridineResearch Products InternationalF10705-1.0
Hybridization ovenTechne731-0177Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
IncubatorsShel Lab202020 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria 
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)GoldBioI2481C100
K2HPO4Fisher ChemicalP288-500
KH2PO4Fisher ChemicalP286-1
KimwipesKimTech34155Task wipes
LB Broth, LennoxBD Difco240230
Low melt agaroseResearch Products InternationalA20070-250.0
MgSO4Fisher ChemicalM-8900
Microwave SharpR-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3Rainin17013800The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaClFisher BioreagentsBP358-1
Nunc OmniTrayThermo Scientific264728Clear polystyrene trays
Parafilm MFisher Scientific13-374-10Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM VWR25384-342
Petri plate, 60 mM Fisher ScientificFB0875713A
Plasma cleanerPlasma Etch, Inc.PE-50
PLATINUM vacuum pumpJB IndustriesDV-142N 
PolyJet 3D printerStratasys Objet500 Connex3PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubatorLab-Line3526CC
smartSpatulaLevGo, Inc.17211Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)M2 Polymer TechnologiesType SReferred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer baseThe Dow Chemical Company2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agentThe Dow Chemical Company2085925
Syringe filter (0.22 µm)Nest Scientific USA Inc. 380111
Syringe, 10 mL Fisher Scientific14955453
TWEEN 20Thermo ScientificJ20605-APDetergent
Vacuum pump oilVWR54996-082
VeroBlackPlusStratasys RGD875Rigid 3D printing filament
Weigh boatThermo ScientificWB30304Large enough for PDMS mixture volume

References

  1. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  2. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  3. Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
  4. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  5. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).
  6. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  7. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
  8. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
  9. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
  10. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
  11. Çelen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
  12. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  13. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  14. Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
  15. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  16. Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  18. Freitas, S. Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , (2021).
  19. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
  20. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
  21. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
  22. Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
  23. Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
  24. McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
  25. Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
  26. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  27. Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  28. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  29. Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
  30. Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
  31. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
  32. Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
  33. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved