JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم تحديد بروتوكول لإجراء تصوير مباشر في الوقت الفعلي لتحديد كيفية تأثير البروتين الملحق TnpB على ديناميكيات التحويل في خلايا الإشريكية القولونية الحية الفردية.

Abstract

هنا ، تم تحديد بروتوكول لإجراء تصوير مباشر في الوقت الفعلي لنشاط العناصر القابلة للنقل في الخلايا البكتيرية الحية باستخدام مجموعة من مراسلي الفلورسنت المقترنة بالنقل. على وجه الخصوص ، يوضح كيف يمكن استخدام التصوير في الوقت الفعلي لتقييم آثار البروتين الملحق TnpB على نشاط العنصر القابل للنقل IS608 ، وهو عضو في عائلة IS200 / IS605 من العناصر القابلة للنقل. عائلة IS200 / IS605 من العناصر القابلة للنقل هي عناصر متحركة وفيرة متصلة بأحد أكثر الجينات التي لا تعد ولا تحصى الموجودة في الطبيعة ، tnpB. تقترح تماثلات التسلسل أن بروتين TnpB قد يكون مقدمة تطورية لأنظمة CRISPR / Cas9. بالإضافة إلى ذلك ، تلقى TnpB اهتماما متجددا ، بعد أن ثبت أنه يعمل كنوكلياز داخلي للحمض النووي الريبي يشبه Cas. تم تحديد تأثيرات TnpB على معدلات تبديل IS608 ، وثبت أن تعبير TnpB ل IS608 يؤدي إلى ~ 5x زيادة نشاط الترانسبوزون مقارنة بالخلايا التي تفتقر إلى تعبير TnpB.

Introduction

العناصر القابلة للنقل (TEs) هي عناصر وراثية تحشد داخل جينومها المضيف عن طريق الاستئصال أو تحفيز النسخ متبوعا بإعادة الاندماج الجينومي. توجد TEs في جميع مجالات الحياة ، ويعيد التحويل هيكلة الجينوم المضيف ، ويحور مناطق الترميز والتحكم1. هذا يولد الطفرات والتنوع التي تلعب دورا مهما في التطور2،3 ، والتنمية4،5 ، والعديد من الأمراض البشرية6 ، بما في ذلك السرطان7.

باستخدام التركيبات الجينية الجديدة التي تربط جوانب نشاط النقل بمراسلي الفلورسنت ، وصف عملنا السابق تطوير نظام تجريبي يعتمد على TE IS608 البكتيري ، وهو ممثل لعائلة IS200 / IS605 واسعة الانتشار من TEs ، والتي تسمح بالتصور في الوقت الفعلي للتبديل في الخلايا الحية الفردية8 (الشكل 1). يتم عرض نظام TE في الشكل 1A. يتكون TE من تسلسل ترميز transposase ، tnpA ، محاطا بالطرف الأيسر (LE) والطرف الأيمن (RE) التكرارات غير الكاملة (IPs) ، وهي مواقع التعرف والاستئصال ل TnpA. يتم التعبير عن tnpA باستخدام المروج PLTetO1 ، والذي يتم قمعه بواسطة مثبط tet ويمكن تحريضه باستخدام anhydrotetracycline (aTc)9. يقسم TE تسلسل -10 و -35 لمروج PlacIQ1 التأسيسي 10 للمراسل الأزرق mCerulean311. كما هو موضح في الشكل 1C ، عندما يتم تحفيز إنتاج tnpA ، يمكن استئصال TE ، مما يؤدي إلى إعادة تكوين المروج. تعبر الخلية المنتجة عن mCerulean3 وتتألق باللون الأزرق. يتم دمج المحطة N من TnpA مع المراسل الأصفر فينوس12 ، مما يسمح بقياس مستويات TnpA عن طريق التألق الأصفر.

IS608 وأعضاء آخرين من عائلة IS200 / IS605 من الترانسبوزونات عادة ما يشفرون أيضا جينا ثانيا للوظيفة غير المعروفة حتى الآن ، tnpB13. بروتينات TnpB هي عائلة وفيرة للغاية ولكنها غير كاملة من النيوكليازات المشفرة بواسطة العديد من TEsالبكتيرية والقديمة 14,15 ، والتي غالبا ما تتكون من tnpB16 فقط. علاوة على ذلك ، جددت الدراسات الحديثة الاهتمام ب TnpB من خلال العثور على أن TnpB يعمل كنوكلياز داخلي قابل للبرمجة موجه بالحمض النووي الريبي يشبه كريسبر / كاس والذي سيؤدي إما إلى فواصل dsDNA أو ssDNA في ظل ظروف متنوعة17,18. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح ما هو الدور الذي قد يلعبه TnpB في تنظيم النقل. لإجراء تصور في الوقت الفعلي لتأثيرات TnpB على تبديل IS608 ، تم إنشاء نسخة من transposon ، بما في ذلك منطقة الترميز من TnpB مع اندماج N-terminal إلى بروتين الفلورسنت الأحمر mCherry.

استكمالا للدراسات الأكثر تفصيلا على مستوى الجزء الأكبر التي أجراها مختبر كولمان19 ، يظهر هنا كيف يمكن للتصوير في الوقت الفعلي لنشاط الترانسبوزون أن يكشف كميا عن تأثير TnpB أو أي بروتينات ملحقة أخرى على ديناميكيات النقل. من خلال دمج TnpB إلى mCherry ، يتم تحديد أحداث النقل الفردية بواسطة التألق الأزرق وترتبط بمستويات التعبير عن TnpA (التألق الأصفر) و TnpB (التألق الأحمر).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد الثقافات البكتيرية

  1. تنمو سلالة الإشريكية القولونية MG1655 مع تركيبات ترانسبوزون البلازميد (الموصوفة سابقا في Kim et al.8) طوال الليل في LB مع المضادات الحيوية المناسبة (25 ميكروغرام / مل من الكانامايسين ، انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تتوفر تسلسلات التركيبات المستخدمة والتسلسلات ذات الصلة كأرقام انضمام GenBank20 OP581959 و OP581957 و OP581958 و OP717084 و OP717085.
  2. لتحقيق نمو أسي ثابت ، قم بتخفيف الثقافات ≥100 مرة في وسط M63 (100 mM KH 2 PO 4 ، 1 mM MgSO 4 ، 1.8 μM FeSO 4 ، 15 mM [NH 4]2SO 4 ، 0.5 ميكروغرام / مل من الثيامين [فيتامين B1]) مكمل بمصدر كربون (0.5٪ وزن / فولت جلوكوز هنا) والمضادات الحيوية المناسبة (انظر جدول المواد).
  3. تنمو الثقافات عند 37 درجة مئوية حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) إلى ~ 0.2. الثقافات جاهزة للاستخدام.

2. إعداد الشريحة

  1. قم بإعداد شريحة عن طريق غلي M63 مع 0.5٪ وزن / فولت جلوكوز و 1.5٪ وزن / فولت أغاروز في الميكروويف لإذابة الأغاروز والتأكد من أنه منصهر تماما ومختلط جيدا.
  2. اترك الخليط يبرد إلى ~ 55 درجة مئوية قبل إضافة المضادات الحيوية والمحرضات (25 ميكروغرام / مل كاناميسين و 10 نانوغرام / ميكرولتر أنهيدروتيتراسيكلين [aTc] ، انظر جدول المواد).
  3. ضع شريحة مجهر على طاولة العمل. قم بتكديس شريحتين أخريين بشكل عمودي على الأولى وضع شريحة أخرى في الأعلى ، بالتوازي مع الشريحة السفلية. تأكد من وجود فجوة تساوي سمك شريحة واحدة بين الشرائح السفلية والعلوية. ماصة ~ 1 مل من خليط الأغاروز M63 في هذه الفجوة بين الشرائح ببطء لإنشاء مربع هلام صغير.
  4. بمجرد أن يتجمد الجل (~ 10-15 دقيقة) ، حرك الشريحة العلوية لإزالتها. تقليم وسادة agarose بشفرة حلاقة أو سكين. ثم ماصة 2.5 ميكرولتر من الثقافة (الخطوة 1.3) ووضع غطاء الغطاء في الأعلى.
  5. أغلق المسافة بين الشريحة وغطاء الغطاء باستخدام الإيبوكسي (انظر جدول المواد). اترك الإيبوكسي يجف وتستقر الخلايا على وسادة الأغاروز لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية.

3. الفحص المجهري مضان الفاصل الزمني

  1. ضع العينة المحضرة (الخطوة 1.3) على مجهر مضان (انظر جدول المواد) في بيئة يتم تسخينها وصيانتها عند 37 درجة مئوية.
    1. اضبط أوقات التعريض الضوئي المناسبة للكاميرا المستخدمة للحصول على الصورة. اضبط شدة الإضاءة لتقليل التبييض الضوئي.
      ملاحظة: تم استخدام وقت التعرض 2 ثانية لكل طول موجي للدراسة الحالية.
    2. لكل طول موجي ، ابحث عن مجال رؤية (FOV) يحتوي على الحد الأدنى من التألق. الحصول على صور لاستخدامها أثناء التحليل لطرح الخلفية.
  2. قم بإعداد بروتوكول للحصول على الصور في شبكة بأطوال موجية مختلفة وعلى فترات زمنية منتظمة.
    1. ترميز التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني في البروتوكول. اضبط تردد الاكتساب على الفاصل الزمني المطلوب (20 دقيقة هنا) وإجمالي مدة الفاصل الزمني على الطول المطلوب (24 ساعة).
    2. ترميز الأطوال الموجية المناسبة في البروتوكول (اعتمادا على البناء المستخدم).
      ملاحظة: ذروة إثارة mCherry عند 587 نانومتر وذروة الانبعاث عند 610 نانومتر21 ؛ mVenus عند 515 نانومتر و 527 نانومتر12 ، بينما mCerulean3 عند 433 نانومتر و 475 نانومتر11.
    3. اضبط حجم الشبكة للالتقاط بين العدد المطلوب من FOVs.
      ملاحظة: استخدمت البيانات التمثيلية الموضحة هنا 8 × 8 FOVs.

4. تحليل الصور

  1. قم بإجراء طرح الخلفية على كل قناة ملونة باستخدام صور الخلفية ذات الصلة التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.2. بالنسبة لجميع خطوات التحليل ، نستخدم وحدات قياسية في النظام الأساسي مفتوح المصدر فيجي22 (انظر جدول المواد).
  2. قرب إجمالي السكان في كل نقطة زمنية عن طريق تحديد عتبة قناة mCerulean وقسمة منطقة العتبة على متوسط مساحة الخلية.
  3. لحساب أحداث الاستئصال الفريدة ، خذ الوقت المشتق من قناة mCerulean3. قم بذلك عن طريق طرح الصور المتتالية في قناة mCerulean3. سيتم الكشف عن أحداث الاستئصال في مشتق الوقت كميض ساطع من التألق.
    1. عتبة كومة أحداث الاستئصال للقضاء على مضان غير مرغوب فيه. لاحظ أن هذه العملية ستؤدي إلى استبعاد أجزاء من عمليات الاستئصال نفسها. لإصلاح ذلك ، قم بتوسيع الصور لاستعادة عمليات الاستئصال إلى أحجامها الأصلية.
      ملاحظة: يمكن إجراء تحليلات باستخدام تقنيات مماثلة للعتبة وتحليل الصور على قنوات التألق الأخرى أيضا (على سبيل المثال ، ربط أحداث الاستئصال بمستويات ترانسبوزاز TnpA [مضان الزهرة الأصفر] و TnpB [مضان الكرز الأحمر].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

هذه الطريقة لتصور نشاط الترانسبوزون في الخلايا الحية بواسطة الفحص المجهري الفلوري ، مع وجود إنتاجية أقل من قياسات التألق السائبة ، تسمح بالتصور المباشر لنشاط الترانسبوزون في الخلايا الحية الفردية. تؤدي أحداث استئصال الترانسبوزون إلى إعادة تكوين المروج ل mCerulean3 (الشكل 1) ، مما يسمح بتحديد ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الطريقة الفريدة المقدمة هنا للتصوير في الوقت الفعلي لنشاط العناصر القابلة للنقل في الخلايا الحية هي اختبار حساس يمكنه اكتشاف التحويل مباشرة في الخلايا الحية وفي الوقت الفعلي وربط هذا النشاط بالتعبير عن البروتينات الملحقة. في حين أن الإنتاجية أقل مما يمكن تحقيقه بالطرق السائبة ، فإن هذه ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم توفير الدعم المالي لهذا البحث من خلال صناديق بدء التشغيل من جامعة كاليفورنيا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2 Ton Clear EpoxyDevcon31345
AgaroseSigma-Aldrich5066
Ammonium sulfateSigma-AldrichAX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochlorideSigma-Aldrich37919
Argon LaserMelles Griot35-IMA-840-015
Blue Filter CubeChromaEx: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
Eclipse Ti-E MicroscopeNikonDiscontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)Eppendorf North America Biotools22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)Eppendorf North America Biotools22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 gFisher Scientific706834
FijiFiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated)Fisher ScientificBP9723-2 
Glass Cover SlideFisher Scientific12-542B 
Kanamycin SulfateSigma-Aldrich1355006
Magnesium sulfate Cert AcFisher ScientificXXM63SP3KG
Microscope HeaterWorld Precision Instruments96810-1
Potassium Phosphate MonobasicFisher Scientific17001H
ProScan III StagePrior
Red Filter CubeChromaEx: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP LaserCoherent1170412
Slide, MicroscopeFisher Scientific125535B
Thiamine HydrochlorideSigma-Aldrich (SIAL)T1270-100G
Ti-LU4 Laser LaunchNikon
Yellow Filter CubeChromaEx: Z514/10X, Em: ET535/30M

References

  1. Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).
  2. Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
  3. Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
  4. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
  5. Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
  6. Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).
  7. Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11(2014).
  8. Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
  9. Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
  10. Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
  11. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896(2011).
  12. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
  13. Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
  14. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  15. Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).
  16. Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
  17. Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
  18. Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
  19. Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
  20. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
  21. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
  24. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

191

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved