عزل الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة والأوعية الدموية الكبيرة وتنقيتها من العينات المشتقة من الرئة

Summary

على الرغم من التحدي ، فإن عزل الخلايا البطانية الرئوية ضروري للدراسات حول التهاب الرئة. يصف هذا البروتوكول إجراء للعزل عالي الغلة وعالي النقاء للخلايا البطانية الوعائية الكبيرة والأوعية الدموية الدقيقة.

Abstract

يمثل توافر الخلايا المعزولة من الأنسجة والأعضاء السليمة والمريضة عنصرا أساسيا لنهج الطب الشخصي. على الرغم من أن البنوك الحيوية يمكن أن توفر مجموعة واسعة من الخلايا الأولية والخالدة للبحوث الطبية الحيوية ، إلا أنها لا تغطي جميع الاحتياجات التجريبية ، لا سيما تلك المتعلقة بأمراض أو أنماط وراثية معينة. الخلايا البطانية الوعائية (ECs) هي المكونات الرئيسية للتفاعل الالتهابي المناعي ، وبالتالي ، تلعب دورا مركزيا في التسبب في مجموعة متنوعة من الاضطرابات. والجدير بالذكر أن ECs من مواقع مختلفة تعرض خصائص كيميائية حيوية ووظيفية مختلفة ، مما يجعل توفر أنواع محددة من EC (أي الأوعية الدموية الكبيرة والأوعية الدموية الدقيقة والشرايين والوريدية) أمرا ضروريا لتصميم تجارب موثوقة. هنا ، يتم توضيح الإجراءات البسيطة للحصول على خلايا بطانة الأوعية الدموية الكبيرة والأوعية الدموية الدقيقة البشرية عالية الغلة والنقية تقريبا من الشريان الرئوي وحمة الرئة بالتفصيل. يمكن إعادة إنتاج هذه المنهجية بسهولة بتكلفة منخفضة نسبيا من قبل أي مختبر لتحقيق الاستقلال عن المصادر التجارية والحصول على الأنماط الظاهرية / الأنماط الجينية EC التي لم تتوفر بعد.

Introduction

تبطن البطانة الوعائية السطح الداخلي للأوعية الدموية. يلعب أدوارا رئيسية في تنظيم تخثر الدم ، ونغمة الأوعية الدموية ، والاستجابات المناعية^{الالتهابية 1}،²،^3،4. على الرغم من أن ثقافة الخلايا البطانية (ECs) المعزولة من العينات البشرية ضرورية لأغراض البحث ، إلا أنه يجب ملاحظة أن ECs من الأوعية الدموية المختلفة (الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية) لها وظائف محددة. لا يمكن تلخيصها بالكامل بواسطة الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVEC) ، والتي تتوفر بسهولة وتستخدم على نطاق واسع في الدراسات حول الفيزيولوجيا المرضية للبطانة الوعائية ^5,6. على سبيل المثال ، تلعب الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للرئة البشرية (HLMVECs) أدوارا رئيسية في التهاب الرئة من خلال التحكم في تجنيد الكريات البيض وتراكمها ^4,7. وبالتالي ، يجب أن يشمل الإعداد التجريبي الذي يهدف إلى إعادة إنتاج التهاب الرئة بدقة عالية HLMVECs. من ناحية أخرى ، يمكن ملاحظة خلل EC في العديد من الأمراض. لذلك ، تعتبر ECs من المريض أساسية لبناء نموذج موثوق به في المختبر للمرض. على سبيل المثال ، مكننا عزل شظايا ECs من الشريان الرئوي (HPAECs) ، التي تم تشريحها من الرئتين المزروعتين للأشخاص المصابين بالتليف الكيسي (CF) ، من الكشف عن آليات الخلل البطاني في هذا المرض ^8,9.

وبالتالي ، فإن البروتوكولات التي تهدف إلى تحسين عزل ECs من مصادر / أجهزة مختلفة أيضا في حالات المرض ضرورية لتزويد الباحثين بأدوات بحث قيمة ، خاصة عندما لا تكون هذه الأدوات متاحة تجاريا. تم الإبلاغ سابقا عن بروتوكولات عزل HLMVEC و HPAEC 10،11،12،¹³،14،15،16،17،^18،19. في جميع الحالات ، أدى الهضم الأنزيمي لعينات الرئة إلى مجموعات خلايا مختلطة ، والتي تم تنقيتها باستخدام وسائط انتقائية مخصصة وفرز الخلايا القائمة على الخرز المغناطيسي أو الخلايا الخلوية. يجب أن تعالج التحسينات الإضافية لهذه البروتوكولات مسألتين رئيسيتين في عزل EC: (1) تلوث الخلايا والأنسجة ، والتي يجب حلها في أقرب ممرات استزراع ممكنة لتقليل الشيخوخة المتماثلة EC²⁰ ؛ و (2) العائد المنخفض لعزلات EC الأولية.

تصف هذه الدراسة بروتوكولا جديدا للعزل عالي الغلة وعالي النقاء ل HLMVECs و HPAECs. يمكن تطبيق هذا الإجراء بسهولة وإعطاء ECs الأوعية الدموية الكبيرة والأوعية الدموية الدقيقة النقية تقريبا في بضع خطوات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة ، واتبع البروتوكول إرشادات لجنة أخلاقيات البحوث البشرية بجامعة كييتي بيسكارا (#237_2018bis). يوضح الشكل 1 عزل الخلايا البطانية من أجزاء (طولها 1-3 سم) من الحمة الرئوية أو الشريان الرئوي من الأشخاص غير المحددين (بموافقة كتابية) الذين يخضعون لجراحة الصدر لأسباب مختلفة ، مثل استرواح الصدر أو استئصال الفص. في هذه الحالة الأخيرة ، جمع الجراحون أيضا جزءا من الشريان الرئوي. والجدير بالذكر أنه تم توجيه الجراحين بدقة لجمع عينات خالية من السرطان. تم تحسين البروتوكول المقدم للحصول على أكبر قدر ممكن من العائد والنقاء.

1. التحضير التجريبي

1. إعادة تكوين كولاجيناز
   1. قم بإذابة مسحوق الكولاجيناز في محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدون CaCl 2 و MgCl 2 (^PBS−− ، انظر جدول المواد) بتركيز₂ مجم / مل ، وقم بتصفية المحلول باستخدام مرشح مسام 0.22 ميكرومتر.
   2. تحضير 5 مل من القسامة، وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية. قم بإذابة وتسخين الحصص إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2. طلاء لوحة
   1. لطلاء الألواح ، ماصة 1.5٪ محلول جيلاتين أو 50 ميكروغرام / مل فيبرونيكتين (انظر جدول المواد) في لوحة الاستزراع (500 ميكرولتر كافية لتغطية سطح كل بئر من صفيحة 6 آبار) ، واحتضانها لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   2. بعد الحضانة ، قم بإزالة الجيلاتين الزائد ، واغسل الآبار باستخدام ^PBS−−. نضح ^PBS−− ، واترك اللوحة تجف في غطاء معقم.
      ملاحظة: لإعادة تكوين الجيلاتين ، قم بإذابة المسحوق في الماء لعمل محلول 1.5٪ ، ثم قم بتعقيمه ، وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. الجيلاتين عند 1.5٪ ليس سائلا عند 4 درجات مئوية ؛ لذلك ، يجب تسخينه قبل طلاء اللوحة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أي محلول جيلاتيني تجاري مناسب لمزارع الخلايا لطلاء الألواح.

2. إعداد عينة

1. حمة الرئة
   1. اغسل العينات التي تم جمعها عن طريق غمرها في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على ^PBS−−.
   2. انقل العينات إلى طبق بتري معقم ، وقم بتقطيع العينة يدويا باستخدام مقص جراحي (الحجم الأمثل: >2 سم) إلى شظايا صغيرة يبلغ حجم كل منها حوالي 3-4 مم.
2. جزء (أجزاء) الشريان
   1. اغسل العينات التي تم جمعها عن طريق غمرها في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على ^PBS−−.
   2. قم بنقله إلى طبق بتري معقم دون تقطيع ، لأن التجزئة ستزيد من مساحة سطح المقطع العرضي لجزء الشريان ، مما يزيد من إمكانية عزل غير ECs.

3. الهضم الأنزيمي

1. اغسل مكعبات الرئة الحمة أو جزء / أجزاء الشريان الرئوي مرتين باستخدام ^PBS−−. هذه الخطوة ستزيل جزءا كبيرا من الدم المتبقي.
2. ضع العينات في أنابيب سعة 15 مل ، واحتضانها ب 5 مل من كولاجيناز النوع 2 (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂. خلال هذه الحضانة ، يؤدي تدهور المصفوفة خارج الخلية إلى إطلاق خلايا مفردة ومجاميع خلوية.

4. استعادة الخلايا المهضومة

1. ضع مصفاة معقمة من الصلب / المعدن (أي مصفاة شاي بحجم شبكة ~ 1 مم) أعلى أنبوب تجميع سعة 50 مل.
2. صب المحتويات بالكامل من أنبوب 15 مل على المصفاة ، وقم بتدليك الأنسجة المهضومة برفق باستخدام ملعقة ، واشطف العينة باستخدام ^PBS−− حتى يتم ملء أنبوب التجميع.
   ملاحظة: ستقضي هذه الخطوة على شظايا الأنسجة الكبيرة على مقياس المليمتر ، مما يضمن كفاءة أكبر لخطوات الترشيح اللاحقة.

5. إزالة غير EC عن طريق الترشيح

1. قم بتصفية التدفق الخارجي الذي تم جمعه في الخطوة 4.2 باستخدام مصفاة خلوية بحجم شبكة 70 ميكرومتر ، واجمع التدفق الخارجي في أنبوب جديد سعة 50 مل.
2. بعد ذلك ، استخدم مصفاة خلية بحجم شبكة 40 ميكرومتر ، واجمع التدفق الخارجي في أنبوب جديد سعة 50 مل. قم بتسمية هذا الأنبوب باسم "الأنبوب 1".
   ملاحظة: ستؤدي عمليات الترشيح هذه في الخطوة 5.1 والخطوة 5.2 إلى إزالة مجاميع الخلايا الكبيرة ، والتي تتكون غالبا من مجموعات خلايا مختلطة.

6. ترسيب مجموعات الخلايا وبذر الخلايا

1. أجهزة الطرد المركزي العينات في 30 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لترسب مجموعات الخلايا.
2. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة معقمة (لا تصب) ، وضعها في أنبوب جديد سعة 50 مل ("الأنبوب 2").
3. الحبيبات في "الأنبوب 1" ، واملأ الأنبوب حتى 50 مل ب ^PBS−−. املأ "الأنبوب 2" حتى 50 مل باستخدام ^PBS−−.
   ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، يتم التعامل مع كلا الأنبوبين بنفس الطريقة.
4. أجهزة الطرد المركزي العينات في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. الكريات ب 2 مل من وسط النمو (انظر جدول المواد) ، وقم بزرع المعلق في بئرين منفصلين من صفيحة 6 آبار مطلية مسبقا (الخطوة 1.2).
   ملاحظة: من هذه الخطوة ، قم بتغذية الخلايا كل 2 أيام بوسط النمو حتى تصل إلى نقطة التقاء (حوالي 1 أسبوع ، اعتمادا على حجم العينة) من أجل الحصول على عدد معقول من الخلايا للفرز.

7. توسيع الخلية

1. اغسل الخلايا ب 2 مل من PBS مع CaCl 2 و MgCl₂ (PBS ++ ، انظر جدول المواد) لإزالة خلايا الدم المتبقية (استخدام PBS ⁺⁺ مهم لتجنب انفصال الخلايا).
2. قم بإزالة PBS ⁺⁺ ، وأضف وسيطا ثقافيا جديدا.
3. كرر الخطوتين 7.1 و 7.2 حتى تصل الخلايا إلى نقطة التقاء (أسبوع واحد تقريبا ، حسب حجم العينة).

8. فرز الخلايا

1. افصل الخلايا باستخدام 500 ميكرولتر من التربسين-EDTA (0.05٪ ، انظر جدول المواد) ، وأجهزة الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات ب 190 ميكرولتر من ^PBS−−.
2. أضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد CD31-FITC المترافق الفلوري المضاد للإنسان (تخفيف 1:20 ، انظر جدول المواد) ، واحتضان معلق الخلية عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. اغسل الخلايا باستخدام 10 مل من PBS−− ، جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وأعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من ^PBS−−.
4. عزل وجمع الخلايا الإيجابية CD31 (CD31 +) عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) ، باستخدام فوهة 100 ميكرومتر ، وجمعها في أنبوب.
   1. وفقا لاستراتيجية البوابة ، حدد أولا مورفولوجيا الخلية باستخدام معلمات منطقة التشتت الجانبية ، SSC-A و FSC-A. بعد ذلك ، حدد الخلايا المفردة باستخدام مخطط نقطة FSC-Area / FSC-Height أو SSC-Area / SSC-Height ، وحدد الخلايا الموجبة في العينة المحددة مقابل عينة التحكم غير الملوثة ، وقم بتوجيه الخلايا الفلورية إلى أنبوب التجميع²¹.
5. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتعليق الحبيبات في 2 مل من وسط النمو للبذر في الآبار المطلية مسبقا للوحة 6 آبار.

9. توسيع ما بعد الفرز

1. بعد يومين من فرز الخلايا ، استبدل الوسط المشروط بوسط نمو جديد.
2. كرر الخطوتين 7.1 و 7.2 كل يومين لتوسيع الخلايا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

عزل HLMEC
المشكلة الرئيسية أثناء عزل HLMVECs هي وجود خلايا ملوثة لأن الشعيرات الدموية المجهرية لا يمكن فصلها بسهولة عن الأنسجة اللحمية. لذلك ، فإن تحقيق أعلى نقاء ممكن في المراحل المبكرة من عملية العزل أمر بالغ الأهمية من أجل تقليل ممرات الثقافة ، وبالتالي شيخوخة الخلايا. وبالمثل ، ي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الأدوار المتعددة التي تلعبها الخلايا البطانية الوعائية في الفيزيولوجيا المرضية البشرية تجعل هذه الخلايا أداة لا غنى عنها للدراسات المرضية والدوائية في المختبر . نظرا لأن ECs من مواقع / أعضاء الأوعية الدموية المختلفة تعرض ميزات ووظائف غريبة ، فإن توفر ECs صحية ومريضة من الجهاز محل الاهت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X	GIBCO	25300-054	Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59	Dako	M0823	Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-14029	Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors	Any		Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm	Corning	431750	Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm	Corning	431751	Using during the first filtration
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004177	Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody	BD Biosciences	555445	Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8537	Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell	C-22020	HLMVEC growth medium
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A	Sigma-Aldrich	G2500	Used for plate coating
Type A gelatin	Sigma-Aldrich	g-2500	Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%