JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم توفير بروتوكول مفصل هنا لإنشاء عضويات الثدي البشرية من استئصال ورم الثدي المشتق من المريض أو أنسجة الثدي الطبيعية. يوفر البروتوكول تعليمات شاملة خطوة بخطوة لزراعة وتجميد وإذابة عضويات الثدي البشرية المشتقة من المريض.

Abstract

سرطان الثدي هو مرض معقد تم تصنيفه إلى عدة أنواع فرعية نسيجية وجزيئية مختلفة. تتكون عضويات أورام الثدي المشتقة من المريض التي تم تطويرها في مختبرنا من مزيج من مجموعات متعددة من الخلايا المشتقة من الورم ، وبالتالي تمثل تقاربا أفضل لتنوع الخلايا السرطانية وبيئتها من خطوط الخلايا السرطانية 2D المنشأة. تعمل المواد العضوية كنموذج مثالي في المختبر ، مما يسمح بتفاعلات المصفوفة الخلوية خارج الخلية ، والمعروفة بأنها تلعب دورا مهما في تفاعلات الخلايا وتطور السرطان. تتمتع الكائنات العضوية المشتقة من المريض أيضا بمزايا على نماذج الفئران لأنها من أصل بشري. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أنها تلخص عدم التجانس الجيني والنسخ وكذلك التمثيل الغذائي لأورام المرضى. وبالتالي ، فهي قادرة على تمثيل تعقيد الورم وكذلك تنوع المرضى. ونتيجة لذلك ، فإنهم مستعدون لتقديم رؤى أكثر دقة حول اكتشاف الهدف والتحقق من صحته ومقايسات حساسية الدواء. في هذا البروتوكول ، نقدم عرضا مفصلا لكيفية إنشاء عضويات الثدي المشتقة من المريض من أورام الثدي المقطوعة (عضويات السرطان) أو أنسجة الثدي المشتقة من عملية تجميل الثدي المختزلة (العضويات الطبيعية). ويتبع ذلك حساب شامل لثقافة 3D العضوية ، والتوسع ، والمرور ، والتجميد ، وكذلك ذوبان الثقافات العضوية للثدي المشتقة من المريض.

Introduction

سرطان الثدي (BC) هو أكثر الأورام الخبيثة شيوعا بين الإناث ، حيث يقدر تشخيص 287,850 حالة جديدة في الولايات المتحدة في عام 20221. على الرغم من التطورات الحديثة في الكشف المبكر من خلال الفحوصات السنوية والعلاجات المستهدفة والفهم الأفضل للاستعداد الوراثي ، إلا أنه يسود ليكون السبب الرئيسي الثاني لوفيات السرطان لدى الإناث في الولايات المتحدة ، حيث تعزى >40,000 حالة وفاة إلى سرطان الثدي سنويا1. يصنف سرطان الثدي حاليا إلى أنواع فرعية متعددة بناء على التقييم النسيجي المرضي والجزيئي للورم الرئيسي. أدى التقسيم الطبقي الأفضل للنوع الفرعي إلى تحسين نتائج المرضى من خلال خيارات العلاج الخاصة بالنوع الفرعي2. على سبيل المثال ، أدى تحديد HER2 على أنه جين ورميأولي 3 إلى تطوير Trastuzumab ، مما جعل هذا النوع الفرعي شديد العدوانية قابلا للإدارة في معظم المرضى4. سيساعد إجراء مزيد من الأبحاث في علم الوراثة والنسخ لهذا المرض المعقد بطريقة خاصة بالمريض في تطوير أنظمة علاج شخصية أفضل خاصة بالمريض 2,5 والتنبؤ بها. تعد الكائنات العضوية المشتقة من المريض (PDOs) نموذجا جديدا واعدا لاكتساب نظرة ثاقبة للسرطان على المستوى الجزيئي ، وتحديد أهداف جديدة أو مؤشرات حيوية وتصميم استراتيجيات علاج جديدة6،7،8.

PDOs هي هياكل متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) مشتقة من عينات الأنسجة الأولية التي تم استئصالها حديثا 8,9. يتم زراعتها ثلاثية الأبعاد من خلال تضمينها في مصفوفة هيدروجيل ، تتكون عادة من مزيج من بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة تفاعلات الخلايا السرطانية و ECM. تمثل PDOs تنوع المريض وتلخص عدم التجانس الخلوي والسمات الوراثية للورم10،11،12. كونها نماذج في المختبر ، فإنها تسمح بالتلاعب الجيني وشاشات الأدوية عالية الإنتاجية13،14،15. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام PDOs بشكل معقول لتقييم حساسية المريض للأدوية واستراتيجيات العلاج بالتوازي مع العيادة والمساعدة في التنبؤ بنتائج المرضى16،17،18. إلى جانب العلاج الكيميائي ، تم استخدام بعض النماذج العضوية أيضا لفحص استجابات المرضى الفردية للإشعاع الكيميائي19,20. نظرا للتطبيق الواعد ل PDOs للبحث والاستخدام السريري ، أنشأ المعهد الوطني للسرطان اتحادا دوليا ، مبادرة نماذج السرطان البشرية (HCMI) 21 ، لتوليد وتوفير نماذج السرطان الجديدة المشتقة من الورم. تتوفر العديد من النماذج العضوية لأنواع السرطان المختلفة التي تم تطويرها من خلال HCMI عبر مجموعة ثقافة النوع الأمريكية (ATCC) 22.

لقد ثبت أن عضويات الثدي الطبيعية تتكون من مجموعات مختلفة من الخلايا الظهارية الموجودة في الغدة الثديية 11,23 ، وبالتالي فهي بمثابة نماذج رائعة لدراسة العمليات البيولوجية الأساسية ، لتحليل الطفرات الدافعة التي تسبب تكوين الورم ، ولدراسات نسب الخلايا السرطانيةالأصلية 6,15 . تم استخدام النماذج العضوية لأورام الثدي لتحديد أهداف جديدة تشجع الآفاق لتطوير علاجات جديدة ، خاصة للأورام المقاومة24،25،26. باستخدام xenograft المشتق من المريض (PDX) والنماذج العضوية المشتقة من PDX (PDxO) المتطابقة لأورام الثدي المقاومة للعلاج ، أظهر Guillen et al. أن المواد العضوية هي نماذج قوية للطب الدقيق ، والتي يمكن الاستفادة منها لتقييم استجابات الأدوية وقرارات العلاج المباشر بالتوازي28. علاوة على ذلك ، فإن تطوير طرق جديدة للاستزراع المشترك لزراعة PDOs مع الخلايا المناعيةالمختلفة 27،28،29 ، والخلايا الليفية 30،31 والميكروبات32،33 يمثل فرصة لدراسة تأثير البيئة المكروية للورم على تطور السرطان. في حين يتم إنشاء العديد من طرق الاستزراع المشترك هذه بنشاط ل PDOs المشتقة من أورام البنكرياس أو القولون والمستقيم ، فقد تم الإبلاغ عن طرق زراعة مشتركة مماثلة ل PDOs للثدي فقط للخلايا القاتلة الطبيعية34 والخلايا الليفية35.

تم تطوير أول بنك حيوي من >100 عضوي مشتق من المريض يمثل أنواعا فرعية مختلفة من سرطان الثدي من قبل مجموعة Hans Clevers36,37. كجزء من هذا الجهد ، طورت مجموعة Clevers أيضا أول وسيط استزراع معقد لنمو عضويات الثدي ، والذي يستخدم حاليا على نطاق واسع36. قدمت دراسة متابعة سردا شاملا لتأسيس وثقافة PDOs الثدي والطعوم الخارجية العضوية المشتقة من المريض (PDOXs)38. طور مختبر Welm مجموعة كبيرة من نماذج BC PDX و PDxOs التي يتم استزراعها في وسط نمو أبسط نسبيا يحتوي على مصل بقري جنيني (FBS) وعوامل نمو أقل39,40. لقد طورنا وميزنا بشكل مستقل مجموعة كبيرة من النماذج العضوية لسرطان الثدي الساذجةالمشتقة من المريض 11 ، وشاركنا في تطوير نماذج BC PDO كجزء من مبادرة HCMI21. هنا ، نهدف إلى تقديم دليل عملي يوضح بالتفصيل المنهجية التي نستخدمها في إنشاء أنظمة نموذج عضوي للثدي مشتقة من المريض.

Protocol

تم الحصول على استئصال الورم من مرضى سرطان الثدي ، جنبا إلى جنب مع الأنسجة الطبيعية البعيدة والمجاورة ، من Northwell Health وفقا لبروتوكولات مجلس المراجعة المؤسسية IRB-03-012 و IRB 20-0150 ، وبموافقة خطية مستنيرة من المرضى.

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة أدناه في غرفة BSL2 لزراعة أنسجة الثدييات المخصصة لعينات المرضى بناء على موافقة لجنة السلامة البيولوجية. يجب تنفيذ جميع الإجراءات باتباع بروتوكولات السلامة التي تحافظ على ظروف التعقيم في خزانات السلامة الأحيائية. يتم تنفيذ كل خطوة من خطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة (RT) ما لم ينص على خلاف ذلك. يتم دائما وضع الأنسجة / المواد العضوية ومخزونات مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك. يتم تحضين لوحات جديدة بين عشية وضحاها للاحترار المسبق. تضمن قباب الطلاء على الألواح الدافئة مسبقا أفضل النتائج للحصول على قباب مستديرة لا تتسطح أثناء الطلاء أو الرفع لاحقا عن سطح اللوحة.

1. إعداد متوسطة وصفات

  1. قم بإعداد الوسائط المكيفة R-spondin1 كما هو موضح أدناه (بدلا من ذلك يمكن شراؤها تجاريا).
    1. قم بإعداد وسطين منفصلين للنمو يتألفان من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، و 10٪ FBS ، و 5٪ من البنسلين والستربتومايسين ، ومع أو بدون مكملات 300 ميكروغرام / مل من الزيوسين.
    2. قم بإذابة قارورة من خلايا HEK293T-HA-Rspondin1-Fc (تم الحصول عليها من مختبر Calvin Kuo في جامعة ستانفورد ومتاحة تجاريا أيضا) في قارورة زراعة الأنسجة 75 سم2 مع 15 مل من الوسط.
    3. قسم الخلايا إلى 2 × 175 سم2 قارورة استزراع ، كل منها يحتوي على 35 مل من الوسط الذي يحتوي على الزيوسين.
    4. قم بتمرير الخلايا مرة أخرى للحصول على أكبر عدد ممكن من القوارير حسب الحاجة لتوليد الدفعة المطلوبة من الوسط المكيف R-spondin1. استخدم وسط النمو بدون زيوسين.
    5. عندما تكون القوارير التي تحتوي على وسط بدون زيوسين متقاربة ، قم بإزالة واستبدال وسط النمو ب Ad-DF +++ (الخطوة 1.2 ؛ الجدول 1). ضع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 1 أسبوع.
    6. قم بتدوير الوسط عند 400 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة أي خلايا غير متصلة. قم بتصفية الوسيط من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. اصنع 25 مل من القسمة وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية (يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 6 أشهر).
    7. باستخدام خلايا HEK293T ، قم بإجراء اختبار luciferase TOPFLASH41,42 المزدوج باستخدام كاشف نقل الحمض النووي التجاري بنسبة 4.8: 1 إلى نسبة الحمض النووي مع DMEM المخفف (ارتفاع الجلوكوز ، البيروفات). أضف 100 ميكرولتر من الوسط المشروط R-spondin1 (أو الوسط القاعدي للتحكم السلبي) إلى 100 ميكرولتر من الخلايا المنقولة. بعد ذلك ، قم بإجراء اختبار luciferase المزدوج وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للتحقق من نشاط Wnt للوسط المكيف R-spondin1.
      ملاحظة: يستخدم الفحص بلازميد TOP مع قراءة نشاط Firefly luciferase ، ويتم استخدام بلازميد FOP كعنصر تحكم سلبي.
  2. تحضير الوسط القاعدي (Ad-DF +++ medium ، كما نشره سابقا Sachs et al.36).
    الكاشفتركيز المخزونالتركيز النهائي
    DMEM/F12 المتقدم1x1x
    جلوتاماكس100 ضعف1x
    هيبس1 م10 مللي متر
    البنسلين والستربتومايسين10000 وحدة / مل ؛ 10000 ميكروغرام / مل100 وحدة / مل ؛ 100 ميكروغرام / مل

    الجدول 1: تكوين متوسط AD-DF +++ القاعدي.
  3. قم بإعداد وسيط كامل لعضويات الثدي المشتقة من المريض كما تم نشره سابقا بواسطة Sachs et al.36.
    الكاشفتركيز المخزونالتركيز النهائي
    Ad-DF +++ المتوسطة1x1x
    R-سبوندين في المنزل100%10%
    ملحق B-2750 ضعفا1x
    نيكوتيناميد1 م5 مللي متر
    NAC500 مللي متر1.25 مللي متر
    بريموسين50 ملغ/مل50 ميكروغرام / مل
    راس100 ميكروغرام / مل100 نانوغرام / مل
    EGF البشرية5 ميكروغرام / مل5 نانوغرام / مل
    هيرجولين الإنسان β1 / نيوريجولين 175 ميكروغرام / مل37.5 نانوغرام/مل
    Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد (رو كيناز)100 مللي متر5 ميكرومتر
    أ 83-015 مللي متر500 نيوتن متر
    الإنسان FGF-7100 ميكروغرام / مل5 نانوغرام / مل
    الإنسان FGF-101 ملغ/مل20 نانوغرام / مل
    ص 38 ط30 مللي متر498 نيوتن متر

    الجدول 2: تركيبة متوسطة كاملة لعضويات الثدي المشتقة من المريض.
  4. تحضير محلول كولاجيناز IV سعة 2 ملغ/مل عن طريق وزن الكمية المطلوبة من مسحوق كولاجيناز الوريدي وإذابته في وسط قاعدي Ad-DF+++. قم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام.
  5. قم بإعداد محلول زلال مصل البقري (BSA) بنسبة 0.5٪ من محلول مخزون 7.5٪ باستخدام 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) كمخفف. قم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام.

2. إنشاء ورم الثدي / العضويات الطبيعية من الأنسجة المقطوعة (الشكل 1)

  1. نقل ورم الثدي الذي تم استئصاله جراحيا / عينة الأنسجة الطبيعية إلى المختبر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على Ad-DF +++. قم بتخزين الأنبوب على الثلج حتى بداية العزل.
  2. قم بإذابة زجاجة من مصفوفة الغشاء القاعدي على الثلج أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  3. نقل الأنسجة المقطوعة إلى طبق بتري معقم 10 سم. افحص الأنسجة بالمنظار وقم بتدوين ملاحظة إذا كانت تبدو دهنية شكليا أو وعائية أو نخرية. بالإضافة إلى ذلك ، سجل حجم وشكل الأنسجة. من الناحية المثالية ، التقط صورة للأنسجة مع وجود مسطرة في العرض (الشكل 2).
  4. فرم الأنسجة إلى قطع صغيرة جدا (~ 1 مم3) بمشرط معقم رقم 10 ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  5. أضف 10 مل من محلول كولاجيناز الوريدي 2 ملغ/مل وأغلق الأنبوب بغشاء شفاف. ضع الأنبوب على شاكر مداري عند 37 درجة مئوية عند 140 دورة في الدقيقة لمدة 30-90 دقيقة في وضع زاوية (~ زاوية 30 درجة).
  6. أثناء الحضانة ، ضع قسامة من الوسط الكامل إلى التسخين المسبق في حمام مائي بالخرز / 37 درجة مئوية.
  7. كل 15 دقيقة ، أعد تعليق الأنسجة عن طريق الخلط لأعلى ولأسفل بقوة باستخدام ماصة مصلية معقمة سعة 5 مل. قم بطلاء الماصة مسبقا بمحلول BSA بنسبة 0.5٪ لمنع فقدان الأنسجة الناجم عن التصاق العينة بالماصة. راقب التفكك بمرور الوقت من خلال مراقبة الأنبوب المخروطي تحت المجهر بتكبير 5x أو أعلى.
  8. بمجرد فصل الأنسجة ، أجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية ، أضف 10 مل من Ad-DF +++ ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
  9. تخلص من المادة الطافية بعناية. يمكن أن تكون كريات الأنسجة فضفاضة في بعض الأحيان, لذا كن حذرا عند الشفط. كرر الخطوة مرة أخرى.
  10. إذا كانت حبيبات الأنسجة حمراء جزئيا ، أضف 2 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لا تحتضن لفترة أطول ، لأن هذا سيقلل بشكل كبير من صلاحية الخلية.
  11. أضف 10 مل من Ad-DF +++ إلى الأنبوب ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 50-300 ميكرولتر من مصفوفة غشاء القاعدية الباردة غير المخففة واخلطها عن طريق السحب بعناية لتجنب تكوين فقاعات.
    ملاحظة: يعتمد حجم مصفوفة الغشاء القاعدي المضافة على حجم الحبيبات. إذا لم تكن متأكدا ، فقم بلوحة قبة صغيرة تبلغ ~ 10 ميكرولتر من الحبيبات المعاد تعليقها ولاحظ التقاء تحت المجهر. اضبط عن طريق إضافة المزيد من مصفوفة الغشاء القاعدي إذا لزم الأمر. راجع الشكل 3 (صورة اليوم 1) للحصول على كثافة البذر المرجعية.
  12. لوحة 300 ميكرولتر من قبة مصفوفة الغشاء القاعدي التي تحتوي على مواد عضوية في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة ذات 6 آبار التي تم تسخينها مسبقا. راجع الجدول 3 لمعرفة مصفوفة الغشاء القاعدي الموصى بها والأحجام المتوسطة في حالة استخدام ألواح مختلفة.
    عدد الآبار لكل لوحةمصفوفة غشاء القاعدية لكل قبة (ميكرولتر)متوسط لكل بئر (ميكرولتر)
    63003000
    121001000
    2450500
    4825250
    9610 (تعليق بدلا من القبة)100

    الجدول 3: كمية مصفوفة الغشاء القاعدي ووسط النمو الموصى به لكل بئر بناء على حجم اللوحة.
  13. اترك اللوحة دون إزعاج في الغطاء لمدة 5 دقائق ثم ضعها بعناية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة حتى تصلب قبة مصفوفة الغشاء القاعدي تماما.
  14. أضف 3 مل من الوسط الكامل المسخن مسبقا بالتنقيط إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار وضعها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. التقط صورا للعضويات باستخدام هدف 5x على مجهر برايت فيلد مقلوب.
  15. قم بتجديد الوسط كل 4-8 أيام بناء على نمو المواد العضوية. قم باستنشاق الوسط القديم بعناية دون إزعاج القبة ، وأضف وسيطا جديدا تم تسخينه مسبقا.
    ملاحظة: البروتوكول هو نفسه لإنشاء عضويات سرطان الثدي المشتقة من الورم المقطوع وللعضويات الطبيعية المشتقة من أنسجة الثدي السليمة المقطوعة (إما من أنسجة الثدي المجاورة والطبيعية لنفس المريض أو أنسجة الثدي السليمة التي تم الحصول عليها من جراحة تجميل الثدي المختزلة).

3. تمرير وتوسيع عضويات الثدي المشتقة من المريض في الثقافة

  1. قم بإذابة زجاجة من مصفوفة الغشاء القاعدي على الثلج أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  2. ارفع قبة مصفوفة الغشاء القاعدي إلى الوسط في البئر باستخدام مكشطة خلية أو طرف ماصة سعة 1 مل.
  3. قم بطلاء طرف الماصة مسبقا بمحلول BSA بنسبة 0.5٪ ثم انقل القبة العائمة للعضويات بأنبوب مخروطي متوسط إلى 15 مل أو 50 مل ، اعتمادا على عدد الآبار التي يتم حصادها. لأكثر من بئرين يحتويان على 300 ميكرولتر من قباب مصفوفة الغشاء القاعدي ، استخدم أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل. أضف 1x DPBS لزيادة مستوى الصوت إلى 5 مل على الأقل.
  4. أدر الأنابيب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. تشكل مصفوفة الغشاء القاعدي مع المواد العضوية طبقة في الأسفل. نضح بعناية لإزالة طاف.
  5. أضف 5-20 مل من 1x DPBS ، اعتمادا على عدد الآبار المجمعة في أنبوب. قم بطلاء ماصة معقمة يمكن التخلص منها مسبقا بنسبة 0.5٪ BSA وامزج حبيبات مصفوفة الغشاء العضوي القاعدي في DPBS بشكل موحد عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
  6. أدر الأنابيب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. نضح بعناية وتجاهل طاف .
  7. أضف كاشف تفكك الخلية بثلاثة أضعاف حجم مصفوفة الغشاء القاعدي إلى الأنبوب. باستخدام طرف ماصة مطلي بنسبة 0.5٪ BSA ، أعد تعليق المواد العضوية في كاشف تفكك الخلية.
  8. ضع الأنبوب على شاكر مداري عند 37 درجة مئوية عند 140 دورة في الدقيقة لمدة 8-15 دقيقة في وضع زاوية. راقب الأنبوب من خلال مراقبته تحت المجهر كل 5 دقائق لضمان تقسيم المواد العضوية إلى مجموعات أصغر.
  9. أضف الوسط القاعدي (أي Ad-DF +++) بحجم يساوي أو أكبر من كاشف تفكك الخلية ، وماصة لخلط المواد العضوية. تدور في 400 × غرام لمدة 5 دقائق في RT للحصول على بيليه عضوي.
  10. إذا كانت الحبيبات تحتوي على مواد عضوية لا تزال مدمجة في مصفوفة الغشاء القاعدي غير المذابة ، كرر الخطوات 3.7-3.9 لمدة 5-8 دقائق إضافية من التربسين.
  11. بمجرد الحصول على حبيبات عضوية بيضاء بدون مصفوفة غشاء قاعدي غير مذابة ، تخلص من المادة الطافية ، وأضف 1 مل من Ad-DF +++ لإعادة تعليق الحبيبات عن طريق الماصة. ثم أضف المزيد من Ad-DF +++ حتى 10 مل.
  12. قم بالدوران عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT لخطوة الغسيل. نضح وتجاهل طاف.
  13. أضف الكمية المطلوبة من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى المواد العضوية المهضومة بناء على نسبة الانقسام المناسبة (سيختلف هذا بشكل كبير لكل خط عضوي بناء على معدل النمو). راجع الشكل 3 (صورة اليوم 1) للحصول على مثال على كثافة البذر. امزج عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل لتجنب تكوين فقاعات. مكان على الفور على الجليد.
  14. افتح وملصق لوحة 6 آبار تم تسخينها مسبقا. يوصى بلوحة قبة 10-20 ميكرولتر في زاوية البئر لمراقبة التقاء تحت المجهر. إذا كانت المواد العضوية متقاربة ، فيمكن إضافة المزيد من مصفوفة الغشاء القاعدي لزيادة نسبة الانقسام.
  15. لوحة 300 ميكرولتر قباب من المواد العضوية المعاد تعليقها في مصفوفة الغشاء القاعدي. تأكد من إبقاء الأنبوب على الجليد أثناء طلاء آبار متعددة بحيث تظل مصفوفة الغشاء القاعدي في المحلول.
  16. اترك اللوحة دون إزعاج في الغطاء لمدة 5 دقائق ثم ضعها بعناية في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 دون إزعاج القباب.
  17. بعد 20-30 دقيقة ، تصلب القباب. أضف 3 مل من الوسط الكامل الذي تم تسخينه مسبقا إلى كل بئر وضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة. أضف وسطا كاملا طازجا كل 5-7 أيام. إجراء اختبار روتيني للثقافات للكشف عن تلوث الميكوبلازما.
    ملاحظة: بروتوكول زراعة أورام الثدي والكائنات العضوية الطبيعية هو نفسه. ومع ذلك ، في تجربتنا ، تميل الكائنات العضوية العادية إلى النمو بشكل جيد حتى الممر 6-8 قبل التباطؤ. من المستحسن عمل أكبر عدد ممكن من مخزون المرور المبكر للبحث في المستقبل.

4. تجميد عضويات الثدي المشتقة من المريض

  1. مرور الآبار المتقاربة من المواد العضوية لإزالة أي مصفوفة غشاء قاعدي ، كما هو مذكور في الخطوات 3.1-3.12.
  2. أعد تعليق حبيبات المواد العضوية في وسط تجميد الخلية (إذابة طوال الليل عند 4 درجات مئوية) مع 1 مل من الوسط لكل 200-300 ميكرولتر من حجم مصفوفة الغشاء القاعدي قبل المرور. قم بإجراء عدد الخلايا قبل التجميد كمرجع. قسمة حجم صغير (100 ميكرولتر على الأقل) من الخلايا للخضوع لمزيد من التربسين ، إذا لزم الأمر ، للحصول على خلايا مفردة ، ثم عدها باستخدام آلة عداد الخلايا.
  3. انقل 1 مل من الخلايا إلى 2 مل كريوفيال موسومة برقم الخط العضوي والتاريخ ورقم المرور. تأكد من تسمية الأنابيب بعلامة دائمة أو استخدم علامات التبريد.
  4. انقل القوارير إلى حاوية تجميد الخلايا وانقل الحاوية إلى مجمد -80 درجة مئوية. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، تكون القوارير جاهزة للانتقال إلى مجمد تخزين النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.

5. إذابة عضويات الثدي المشتقة من المريض

  1. قم بإذابة زجاجة من مصفوفة الغشاء القاعدي على الثلج أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. وسط AD-DF +++ قبل التسخين عند 37 درجة مئوية. قسمة 9 مل من الوسط المسخن مسبقا إلى أنابيب مخروطية سعة 15 مل لكل قارورة مجمدة.
  2. قم بإذابة قارورة المواد العضوية المجمدة بسرعة عن طريق وضعها في حمام حبة 37 درجة مئوية. رش 70٪ من الإيثانول ونقل الأنبوب إلى خزانة السلامة الحيوية.
  3. اشطف طرف الماصة بمحلول BSA بنسبة 0.5٪ لتجنب فقدان المواد العضوية. امزج المواد العضوية المذابة برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل لخلط أي عضويات مستقرة في الأنبوب.
  4. انقل برفق 1 مل من المواد العضوية المجمدة إلى 9 مل من Ad-DF +++ المسخن مسبقا بطريقة قطرة. أدر الخلايا على حرارة 400 × جم لمدة 5 دقائق ثم تخلص بعناية من المادة الطافية.
  5. اغسل الحبيبات بإضافة 10 مل من Ad-DF +++ الطازج المسخن مسبقا إلى الحبيبات العضوية ، واخلطها برفق مع ماصة مغلفة مسبقا ب 0.5٪ BSA لإعادة تعليق الحبيبة. أدر الخلايا عند 400 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص بعناية من المادة الطافية.
  6. ضع الحبيبات العضوية على الثلج وقم بإزالة أي بقايا من Ad-DF +++ بعناية باستخدام طرف ماصة أصغر حجما. أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي واللوحة في لوحة 6 آبار تم تسخينها مسبقا. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    ملاحظة: يوصى بلوحة قبة صغيرة سعة 10 ميكرولتر من الحبيبات المعاد تعليقها في زاوية من البئر لتمييز التقاء تحت المجهر. إذا بدت الكائنات العضوية متقاربة ، فقم بتخفيفها بإضافة 300 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى اللوحة في بئرين من صفيحة ذات 6 آبار.
  7. بعد حضانة 20-30 دقيقة ، أضف 3 مل من الوسط الكامل المسخن مسبقا إلى القبة الصلبة.

النتائج

لقد أنشأنا بنكا حيويا لعضويات أورام الثدي المشتقة من المريض والتي تضم أنواعا فرعية مختلفة11. بالإضافة إلى ذلك ، أنشأنا العديد من الخطوط العضوية الطبيعية للثدي المشتقة من عينات أنسجة تجميل الثدي المختزلة أو الثدي الطبيعي المجاور / البعيد من مرضى BC باستخدام النهج الموضح في

Discussion

لقد استخدم مختبرنا بنجاح البروتوكولات المذكورة أعلاه لإنشاء مواد عضوية من عمليات استئصال الورم أو كشطه الساذجة. لقد استخدمنا هذا البروتوكول أيضا لتطوير عضويات طبيعية من أنسجة الثدي التي تم الحصول عليها عن طريق رأب الثدي المختزل أو من أنسجة الثدي الطبيعية المجاورة أو البعيدة لمرضى ا...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر أعضاء مختبر سبيكتور على المناقشات النقدية طوال هذا العمل. نشكر نورمان ساكس وهانز كليفرز (معهد هوبريشت ، هولندا) لتزويدنا في البداية ببروتوكول الزراعة العضوية. نحن نعترف بالموارد المشتركة لعلم الأنسجة والفحص المجهري لمركز CSHL للسرطان للخدمات والخبرة الفنية (NCI 2P3OCA45508). نشكر الدكتور تشينغ قاو على المساعدة في إعداد العينات النسيجية. نحن ممتنون لدعم الدكتورة كارين كوستروف (نورثويل هيلث) لتقديم عينات من أورام المرضى. كما نقدر جهود فريق البنوك الحيوية في نورثويل هيلث للحصول على العينات، ونشكر المرضى وعائلاتهم على التبرع بالأنسجة للبحث. تم دعم هذا البحث من قبل CSHL / Northwell Health (D.L.S.) ، NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) ، و Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson and D.L.S).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical tubesVWR525-1068
175 cm2 tissue culture flaskVWR (Corning)29185-308
37 °C bead bath
37 °C CO2 incubator
50 mL conical tubesVWR525-1077
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter)Millipore SigmaSCGP00525SCGP00525
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameterNalgene566-0020
6-well culture plates Greiner Cellstar82050-842
75 cm2 tissue culture flaskVWR (Corning)29185-304
96-well opaque platesCorning353296For CTG assay
A83-01Tocris2939
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
B-27 supplementLife Technologies12587010
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate ReaderFisher Scientific (Agilent)For dual luciferase assay and CTG assay
BSA fraction V (7.5%)Thermo Fisher15260037
Cell Titer-Glo (CTG) ReagentPromegaG9683luminescent cell viability assay
Centrifuge Eppendorf5804
Collagenase from Clostridium histolyticumMillipore SigmaC5138Type IV
CryolabelsAmazonDTCR-1000Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5"
Cryovials Simport Scientific Inc.T311-1
Countess 3 Automated Cell CounterThermo FisherAMQAX2000
DMEM, high glucose, pyruvateThermo Fisher (Gibco)11995040
Dual Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X)Gibco14190-144DPBS
Epidermal growth factor (hEGF)PeprotechAF-100-15
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-010-CV
FGF-10 (human)Peprotech100-26
FGF-7/KGF (human)Peprotech100-19
GlutaMaxLife Technologies35050061
HEK293T cellsATCCCRL-3216 For TOPFlash Assay
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cellsR&D Systems3710-001-01Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells
HEPESLife Technologies15630-080
Heregulinβ-1 (human)Peprotech100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration)Corning356231Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix
Mr. Frosty Cell Freezing ContainerThermo Fisher5100-0001
Mycoplasma detection kitLonzaLT07-418
N-acetyl-l-cysteineMillipore SigmaA9165
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES MembranesThermo Fisher166-0045 
NicotinamideMillipore SigmaN0636
Noggin (human)Peprotech120-10C
P1000, P200, P10 pipettes with tips
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190Millipore SigmaS7067
Parafilmtransparent film
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140122
Plasmid1: pRL-SV40PAddgene27163
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlashAddgene12457
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlashAddgene12456
pluriStrainer 200 µmpluriSelect43-50200-01
PrimocinInvivogenANT-PM-1
Recovery Cell Culture Freezing MediumThermo Fisher (Gibco)12648-010cell freezing medium
Red Blood Cell lysis bufferMillipore Sigma11814389001
R-spondin conditioned mediaIn-house or commercial from Peprotech120-38
Scalpel (No.10)Sklar InstrumentsJun-10
Shaker (Incu-shaker Mini)BenchmarkH1001-M
TGF-β receptor inhibitor A 83-01Tocris2939
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redLife Technologies12605028cell dissociation reagent
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagentMillipore Sigma6365779001
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi)Abmole BioscienceY-27632
ZeocinThermo FisherR25001

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
  3. di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
  4. Hortobagyi, G. N., et al. Breast. AJCC Cancer Staging Manual. 4 (4), 589-636 (2017).
  5. Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
  6. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  7. Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
  8. Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
  9. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  10. Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. &. #. 1. 9. 3. ;., Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
  11. Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
  12. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  13. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
  14. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  15. Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
  16. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  17. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
  18. Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
  19. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
  20. Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  21. . HCMI Catalog Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022)
  22. . Search ATCC Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022)
  23. Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
  24. Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
  25. Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
  26. Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
  27. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  28. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  29. Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
  30. Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
  31. Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
  32. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  33. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  34. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  35. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
  36. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  37. . HUB Organoids: Patient in the lab Available from: https://www.huborganoids.nl (2022)
  38. Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
  39. Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
  40. . PDX Portal Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022)
  41. Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
  42. Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
  43. Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
  44. Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved