JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نعرض بروتوكولا خطوة بخطوة للتحقيق في وظيفة الجينات في الضامة المقيمة في الأنسجة البريتونية في الجسم الحي ، باستخدام ناقلات الفيروسات العدسية.

Abstract

الضامة المقيمة في الأنسجة البريتونية لها وظائف واسعة في الحفاظ على التوازن وتشارك في الأمراض داخل الأنسجة المحلية والمجاورة. وظائفها تمليها الإشارات البيئية الدقيقة. وبالتالي ، من الضروري التحقيق في سلوكهم في مكانة فسيولوجية في الجسم الحي . في الوقت الحالي ، تستخدم منهجيات محددة لاستهداف البلاعم البريتونية نماذج معدلة وراثيا للفأر الكامل. هنا ، يتم وصف بروتوكول للتعديل الفعال في الجسم الحي ل mRNA وأنواع الحمض النووي الريبي الصغيرة (على سبيل المثال ، microRNA) في البلاعم البريتونية باستخدام جزيئات الفيروس العدسي. تم إجراء مستحضرات Lentivirus في خلايا HEK293T وتنقيتها على طبقة سكروز واحدة. كشف التحقق من فعالية الفيروس العدسي في الجسم الحي بعد الحقن داخل الصفاق عن العدوى السائدة للبلاعم المقتصرة على الأنسجة المحلية. كان استهداف البلاعم البريتونية ناجحا أثناء التوازن والتهاب الصفاق الناجم عن الثيوغليكولات. تتم مناقشة قيود البروتوكول ، بما في ذلك الالتهاب منخفض المستوى الناجم عن التوصيل داخل الصفاق لفيروس lentivirus والقيود الزمنية للتجارب المحتملة. بشكل عام ، تقدم هذه الدراسة بروتوكولا سريعا ويمكن الوصول إليه للتقييم السريع لوظيفة الجينات في الضامة البريتونية في الجسم الحي.

Introduction

البلاعم المقيمة في الأنسجة (Mφ) هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا المناعية البلعمية التي تستشعر مسببات الأمراض الغازية وتستجيب لها 1,2. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تلعب دورا أساسيا في تطوير الأنسجة ، وإعادة تشكيلها ، والحفاظ على التوازن 1,3. العديد من الأنسجة Mφ مستمدة من أسلاف كيس الصفار أثناء التطور الجنيني وتستمر في الأنسجة طوال الحياة 4,5. يتم تحديد النمط الظاهري ووظائف هذه الخلايا من خلال التفاعلات التعاونية والهرمية لعوامل النسخ المحددة والبيئة المكرويةالمحلية 6،7،8،9. يزيد الفهم المتزايد لهذه التبعية من الحاجة إلى طرق فعالة في الجسم الحي لمعالجة الجينات ل Mφ ضمن مكانتها ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

النواقل الفيروسية هي أداة تستخدم بشكل متكرر لمعالجة الأحماض النووية في مجموعات خلايا معينة في الجسم الحي10،11،12 ، لا سيما بسبب قدرتها على إصابة كل من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة والاندماج بثبات في الجينوم المضيف13،14. على مدى العقدين الماضيين ، تم تحسين تقنية توصيل فيروس lentivirus ، وتم التحقيق في المغلفات البديلة والمروجين الاصطناعية لزيادة استهداف النسبالمحدد 8,15. نظرا لانتحاء الخلية الواسع ، أصبح البروتين السكري المغلف بفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G)16,17 هو المغلف "القياسي الذهبي" المستخدم في تقنية الفيروسات العدسية.

في هذا البروتوكول18 ، يتم استخدام جزيئات الفيروسات العدسية ذات النمط الكاذب VSV-G لإثبات التوصيل المستهدف والفعال للحمض النووي الريبي قصير الدبوس (shRNA) والحمض النووي الريبي الدقيق (miR) إلى الماوس البريتوني Mφ (pMφ) في الجسم الحي ، في الحالة المستقرة19. كان التعبير الجيني المحوري مدفوعا بمروج فيروس تشكيل تركيز الطحال (SFFV). تم تعريف العدوى المنتجة للخلايا من خلال التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز المشتق من فيروس العدس (GFP). سمح استخدام هذا النهج بقراءات سهلة لتجارب الفيروس العدسي في الجسم الحي لتحديد الجرعة المثلى والإطار الزمني التجريبي. أخيرا ، كشف التحدي الفيروسي العدسي في الجسم الحي للفئران أثناء الالتهاب الناجم عن الثيوغليكولات عن الميل الطبيعي لعدوى pMφ الانتقائية.

Protocol

تم إجراء جميع الأعمال الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ووزارة الداخلية في المملكة المتحدة.

ملاحظة: يجب إجراء جميع الدراسات في الجسم الحي مع فيروس lentivirus وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية والوطنية بشأن الاستخدام الأخلاقي للحيوانات في البحث ، وكذلك الالتزام بجميع اللوائح المرتبطة باستخدام المواد المعدية من الفئة الثانية. يجب أيضا مراقبة رعاية وفقا للوائح المحلية. في هذه الخطوة من البروتوكول ، يجب توخي الحذر الشديد عند العمل مع جزيئات الفيروسات العدسية والأدوات الحادة.

1. تحضير الخلايا HEK293T للنقل

ملاحظة: نفذ هذه الخطوات تحت خزانة السلامة البيولوجية لزراعة الأنسجة المعقمة.

  1. تحضير وسط النسر المعدل (cDMEM) الكامل من Dulbecco للخلايا HEK293T من خلال الجمع بين 450 مل من DMEM مع 10٪ (v / v) مصل عجل الجنين (50 مل) وتركيز نهائي قدره 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين.
  2. تذويب الخلايا HEK293T قبل 1 أسبوع على الأقل من النقل المخطط له. الحفاظ على ظروف نمو صحية والمرور كل 2-3 أيام باستخدام التربسين + EDTA لفصل الخلايا عن القارورة.
  3. قبل يوم واحد من النقل ، قم بشفط وسط النمو بعناية من الخلايا واغسل الخلايا برفق باستخدام DPBS المعقم. أضف 1-5 مل من التربسين إلى القارورة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ لمدة 2-5 دقائق.
  4. أضف 5-10 مل من cDMEM وقم بتدوير الخلايا بمعدل 350 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة السائل وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من cDMEM. عد الخلايا والبذور 10-11 × 106 خلايا HEK293T قابلة للحياة لكل قارورة T175 في 20 مل من cDMEM.
  5. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ طوال الليل للسماح للخلايا HEK293T بالوصول إلى التقاء 70٪ -80٪.
  6. في اليوم التالي ، تأكد من التقاء الخلايا تحت المجهر الضوئي.
  7. قم بإزالة الوسائط من القارورة باستخدام شريط مصلي سعة 25 مل دون إزعاج الطبقة الأحادية للخلية.
  8. أضف 10 مل من DPBS برفق وهز اللوحة لغسل الخلايا ، مع الحرص على عدم إزعاج الطبقة الأحادية للخلية.
  9. قم بإزالة DPBS باستخدام شريط مصلي سعة 25 مل.
  10. أضف 15 مل من cDMEM الجديد على الحائط لكل قارورة T175 حتى لا تزعج الطبقة الأحادية للخلية ، وأعد اللوحة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية.

2. نقل الخلايا HEK293T باستخدام كاشف نقل الدهون غير الشحمية

  1. في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، قم بإعداد مكونات الفيروسات العدسية: 2 ميكروغرام من البلازميد الفيروسي ، 1.5 ميكروغرام pΔ8.91 (pCMV-Δ8.91) ، و 1 ميكروغرام pMD2.G (pCMV-MD2.G) مع Buffer EC (مجموعة كاشف النقل) إلى حجم نهائي يبلغ 600 ميكرولتر.
  2. أضف 36 ميكرولتر من محلول المحسن. امزج المكونات باستخدام ماصة سعة 1 مل عن طريق امتصاص جزء من السائل بشكل متكرر وإعادته قطرة قطرة مباشرة على المحلول المتبقي. اتركيه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. أضف 120 ميكرولتر من كاشف النقل واخلطه على النحو الوارد أعلاه حوالي 20 مرة. احتضان لمدة 10 دقائق في RT.
  4. أضف 5.2 مل من cDMEM واخلطها على النحو الوارد أعلاه مع شريط مصلي 5 مل.
  5. باستخدام ماصة نقل يمكن التخلص منها ، أضف مزيج النقل بالتنقيط مباشرة على الطبقة الأحادية للخلايا HEK293T (تجنب جدران القارورة) ، وانشر المزيج في أماكن مختلفة في القارورة.
  6. قم بتوزيع البلازميد عن طريق هز القارورة برفق من جانب إلى آخر. تجنب الحصول على أي سائل في غطاء القارورة.
  7. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ لمدة 48 ساعة. تأكد من النقل الفعال للخلايا HEK293T من خلال ظهور علامة الفلورسنت ، هنا GFP ، في غضون 24 ساعة من النقل الذي يتم مراقبته تحت مجهر الفلورسنت لتصوير الخلايا.
    ملاحظة: بالنسبة للتركيبات التي لا تحتوي على علامة الفلورسنت ، يجب اختبار الخلايا HEK293T لوجود جين العلامة المستخدم أو عن طريق تغيير التعبير في الجين / البروتين محل الاهتمام بالتقنيات المناسبة ، على سبيل المثال ، qPCR. بدلا من ذلك ، يمكن التحقق من النقل الناجح بشكل غير مباشر أثناء اختبار مجموعة الفيروسات العدسية على خلايا Jurkat في المراحل اللاحقة من البروتوكول بواسطة التقنيات المذكورة أعلاه.
    تنبيه: تعتبر الخلايا HEK293T المنقولة معدية ، ويجب تنفيذ احتياطات السلامة المناسبة عند التعامل مع هذه الخلايا. وينبغي اتباع القواعد المحلية، التي يمكن أن تشمل عادة العمل تحت خزانة سلامة البيولوجيا من الفئة الثانية، واستخدام قفازات مزدوجة، ومحلول مناسب لإزالة التلوث للتطهير، على سبيل المثال، زيادة تركيز مبيض النفايات (2000 جزء في المليون) أو محلول مكافئ وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للسلامة الأحيائية. يجب تطهير جميع المحاليل والمواد البلاستيكية التي تتلامس مع مستحضر فيروس العدس وفقا لإجراءات السلامة البيولوجية المؤسسية.

3. جمع جزيئات الفيروسات العدسية

  1. تحضير محلول إزالة التلوث ، وهو محلول مبيض عالي التركيز (2000 جزء في المليون) (هيبوكلوريت الصوديوم) ، أو عامل مكافئ وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للسلامة الأحيائية في دلو ووضعه في خزانة سلامة البيولوجيا.
  2. قم بإعداد خزانة سلامة البيولوجيا عن طريق إزالة أي عناصر زائدة ، مثل رفوف الأنابيب الفارغة وما إلى ذلك.
  3. قم بتسمية أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل لكل دورق خلايا HEK293T T175 مسبقا وقم بإزالة الغطاء من أنبوب الطرد المركزي. ضع الأنابيب في رف ثابت.
  4. استرجع القارورة من الحاضنة وتأكد من تعبير GFP باستخدام مجهر الفلورسنت بليزر 488 نانومتر (الشكل 1 أ). تعتمد شدة الإشارة على كفاءة نقل الإجراء والتركيبات المستخدمة.
  5. اجمع الوسائط من الخلايا في أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل المسمى مسبقا. قم بإمالة قارورة T175 HEK293T بخلايا منقولة بحيث يتجمع الوسط في الزاوية السفلية من القارورة. باستخدام شريط مصلي سعة 25 مل ، اجمع الوسط دون إزعاج الطبقة الأحادية للخلية. قد تكون بعض الخلايا العائمة مرئية في هذه المرحلة. انقل الوسط إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 مل وأغلق الغطاء.
    1. باستخدام شريط مصلي سعة 25 مل ، أضف 25 مل من cDMEM الطازج والدافئ إلى القارورة. تأكد من توجيه التدفق المتوسط على جدران القارورة حتى لا تزعج الطبقة الأحادية للخلية. أعد القارورة مع خلايا HEK293T المنقولة إلى الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
      ملاحظة: يمكن إجراء مجموعة ثانية من فيروس lentivirus والمزيد من التنقية بعد 24 ساعة إضافية باتباع الإجراء الموضح في الخطوات أعلاه.
  6. عند اكتمال جمع فيروس lentivirus بعد 24 ساعة أو 48 ساعة ، أضف محلول إزالة التلوث إلى الخلايا ، مع التأكد من أنه يغطي الطبقة الأحادية للخلية. حافظ على القارورة أفقية لمدة 24 ساعة التالية ، ثم تخلص منها باتباع لوائح الفئة الثانية المناسبة.

4. تنقية فيروس عدسي

  1. تصفية جمع الوسيط من الخطوة 3.5.
    1. قم بإزالة المكبس من المحقنة سعة 50 مل وأدخل مرشح معقم من البولي إيثر منخفض البروتين أو فلوريد البولي فينيليدين 0.45 ميكرومتر في نهاية المحقنة. باستخدام شريط مصلي سعة 25 مل ، أضف الوسط الذي تم جمعه من الخطوة 3.5.1 إلى المحقنة وأعد المكبس برفق.
    2. ادفع القابس ببطء لتمرير الوسيط عبر المرشح إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل. إذا انخفض التدفق بشكل كبير ، ضع المحقنة مع توجيه المرشح لأعلى واسحب المكبس بدرجة كافية لإزالة الوسط من الفلتر.
    3. بعناية ، استبدل المرشح الموجود على المحقنة بآخر جديد وتخلص من المرشح المستخدم في محلول إزالة التلوث. استمر في الترشيح المتوسط. عند الانتهاء ، قم بإزالة التلوث من الفلتر والمحقنة عن طريق غمر المرشح وملء المحقنة بمحلول إزالة التلوث.
  2. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي الفائق مسبقا عن طريق ضبط درجة الحرارة على 4 درجات مئوية وإغلاق الغطاء للسماح لدرجة الحرارة بالتأقلم.
  3. أضف 3 مل من محلول السكروز 20٪ (20٪ وزن / فولت في ماء عالي النقاء ، مرشح معقم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر) في قاع أنبوب الطرد المركزي المخروطي الفائق.
  4. باستخدام شريط مصلي سعة 25 مل ، قم بتراكب وسط مرشح أعلى طبقة السكروز ، مع الحرص على عدم إزعاج الطبقات.
    1. استخدم إعداد السرعة الأدنى على فتى الماصة. قم بزاوية أنبوب الطرد المركزي المخروطي إلى حوالي 45 درجة وأضف ببطء الوسط المحتوي على فيروس العدس المصفى من الخطوة 4.1 إلى جدار الأنبوب. تأكد من عدم اختلاط الوسط والسكروز ، وأن الفصل الواضح للطبقات مرئي (الشكل 1 ب). مع زيادة حجم الطبقة المتوسطة ، قم بإمالة أنبوب الطرد المركزي الفائق ببطء إلى وضع رأسي.
  5. إذا كان الحجم الإجمالي ، بما في ذلك السكروز والوسط ، في أنبوب الطرد المركزي الفائق أقل من 29 مل ، فقم بتعبئة cDMEM جديد لتجنب انهيار الأنبوب أثناء الدوران. بالنسبة لمجموعات T175 mL المتعددة ، امزج المستحضرات المتوسطة المفلترة واستخدم أنابيب طرد مركزي متعددة. قم بتعبئة أنبوب الطرد المركزي النهائي بالوسط كما هو مطلوب.
  6. تأكد من نظافة دلاء أجهزة الطرد المركزي الفائقة ؛ لا توجد بقايا متوسطة في قاع الجرافة أو الأغطية. إذا لزم الأمر ، امسح باستخدام ~ 70٪ كحول. ضع محولات الأنبوب المناسبة في الجزء السفلي من كل دلو (الشكل 1C) وقم بخفض أنابيب الطرد المركزي الفائقة برفق في الجرافات.
  7. أغلق الجرافات بإحكام وعلقها على المساحات المخصصة على الدوار الدوراني.
  8. تأكد من أن الدلاء متوازنة مع نفس أحجام السكروز والمتوسطة. يجب عدم تشغيل الدوار الدوار بدون جرافات ، على الرغم من أنه قد يتم ترك الجرافات المتعارضة فارغة20 (الشكل 1 د).
  9. أدخل الدوار بعناية في جهاز الطرد المركزي الفائق وقم بتشغيل الفراغ. اضبط معدل تسارع وتباطؤ أجهزة الطرد المركزي الفائقة على أدنى إعداد ، وقم بتشغيل الاستعدادات لفيروس lentivirus عند 85000 × g لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  10. انتظر حتى يصل جهاز الطرد المركزي الفائق إلى السرعة المطلوبة (حوالي 3-5 دقائق) قبل الابتعاد للتأكد من إدخال الدوار بشكل صحيح ولن ينتهي الدوران.
  11. أثناء تشغيل جهاز الطرد المركزي الفائق ، قم بتنظيف مساحة العمل وفقا لمتطلبات السلامة من الفئة الثانية وقم بإعداد المساحة للخطوات التالية.
  12. عند انتهاء الدوران ، قم بتعطيل الفراغ وإزالة الدوار بعناية حتى لا تزعج العينات.
  13. تحقق من أجهزة الطرد المركزي الفائقة بحثا عن أي انسكابات وتأكد من عدم وجود تسرب من الجرافات. في حالة الانسكاب ، قفاز مزدوج وتطهير أجهزة الطرد المركزي والسطح الخارجي للدلاء بمنتجات مضادة للفيروسات.
  14. قم بإزالة الدلاء من أجهزة الطرد المركزي الفائقة وانقل الدلاء بعناية إلى خزانة أمان البيولوجيا من الفئة الثانية.
    ملاحظة: تتجمع جزيئات Lentivirus في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الفائق. الحبيبات غير مرئية للعين المجردة.
  15. صب السكروز والمتوسط بحركة واحدة سلسة مباشرة في حاوية النفايات باستخدام محلول إزالة التلوث.
  16. الحفاظ على أنبوب الطرد المركزي ultra مقلوبا ، ونقله إلى طبقة مزدوجة من الأنسجة واتركه ليجف لمدة 10 دقائق. في هذه الأثناء ، امسح الجزء الداخلي من الدلاء بمنديل مبلل بالماء وجففه بالهواء رأسا على عقب.
  17. جفف بعناية أي سائل متبقي من حافة أنبوب الطرد المركزي الفائق بالأنسجة قبل قلبه في وضع مستقيم. تطهير الأنسجة والسطح تحتها.
  18. أعد تعليق حبيبات الفيروس في 1 مل من الوسائط الخالية من المصل أو المحلول المطلوب لمزيد من التجارب عن طريق سحب المحلول برفق لأعلى ولأسفل. اتركه لمدة 15 دقيقة في RT داخل خزانة سلامة الأحياء من الفئة الثانية.
  19. امزج مستحضرات فيروس العدس برفق باستخدام ماصة سعة 1 مل قبل الاقتباس في أنابيب علوية لولبية سعة 1.5 مل (على سبيل المثال ، أنابيب التبريد). تحضير الحصص للعمل في الجسم الحي (تعدد 100 ميكرولتر) ولعيار فيروس lentivirus في خلايا Jurkat T (1 × 20 ميكرولتر) (انظر الخطوة 5).
  20. تجنب دورات التجميد والذوبان ؛ يمكن تخزين المستحضرات الفيروسية العدسية عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر دون تأثير سلبي على العدوى.

5. معايرة إنتاج الفيروس العدسي في خلايا Jurkat T

  1. قم بإعداد وسط معهد روزويل بارك التذكاري 1640 الكامل (cRPMI-1640) لخلايا Jurkat T عن طريق استكمال 500 مل من RPMI-1640 مع مصل عجل الجنين بنسبة 10٪ (v / v) والتركيز النهائي ل 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين.
  2. لضمان ثقافة صحية من الخلايا التائية Jurkat ، والحفاظ على الخلايا في الثقافة لمدة تصل إلى 1 أسبوع قبل الإصابة.
  3. في يوم معايرة الفيروس العدسي ، قم بإخراج خلايا Jurkat T القابلة للحياة في صفيحة 24 بئرا عند 2 × 105 خلايا / بئر في 200 ميكرولتر لكل بئر من cRPMI-1640.
  4. استخدم فيروس العدس الذي تم جمعه حديثا أو قم بإذابة قارورة فيروس العدس التي تحتوي على 20 ميكرولتر على الثلج واخلطها برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
  5. باستخدام التخفيف التسلسلي في cRPMI-1640 ، تصيب خلايا Jurkat T ب 0.25 ميكرولتر و 0.5 ميكرولتر و 1 ميكرولتر و 2.5 ميكرولتر و 5 ميكرولتر و 10 ميكرولتر من مخزون الفيروسات العدسية. هز اللوحة برفق لضمان التوزيع المتساوي لفيروس العدس. تعمل خلايا Jurkat T غير المصابة كعنصر تحكم سلبي.
  6. احتضان اللوحة على حرارة 37 درجة مئوية. بعد 4 ساعات ، قم بتعبئة كل بئر باستخدام cRPMI إلى حجم إجمالي قدره 400 ميكرولتر. أعد اللوحة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
  7. بعد 48 ساعة بعد الإصابة، تأكد من تعبير GFP تحت نظام التصوير بالفلورسنت.
  8. بعد 3 أيام من الإصابة ، اجمع كل بئر من صفيحة 24 بئرا في أنابيب تجميع منفصلة سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي للخلايا عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  9. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهايد (PFA) المحضرة إلى 2٪ (وزن / حجم) في DPBS واتركها لمدة 15 دقيقة على الجليد في الظلام.
  10. قم بطرد الخلايا عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) (DPBS معقم + 4٪ FCS + 1 mM EDTA معقم).
  11. تحليل تردد تعبير GFP ومتوسط شدة الفلورسنت للمصابين بفيروس lentivirus وخلايا التحكم الخاصة به باستخدام قياس التدفق الخلوي (الشكل 2).

6. عدوى الفيروس العدسي في الجسم الحي للبلاعم البريتونية المقيمة في الأنسجة

  1. في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية ، قم بتحميل إبر الأنسولين بحجم إجمالي 200 ميكرولتر من وسط الوسائط الخالية من المصل الذي يحتوي على الكمية المطلوبة من فيروس العدس (استخدم الإبر ذات الاستخدام الواحد ، 30 جم لرعاية ولتجنب فقدان السوائل في الإبرة).
  2. ضع غمد الإبرة مرة أخرى على الإبرة باستخدام تقنية المغرفة بيد واحدة. احتفظ بالإبرة على الثلج وحقنها في غضون 30 دقيقة.
  3. في منشأة ، قم بإعداد خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية قبل الحقن (الشكل 1E).
    1. وضع ورقة من الأنسجة النظيفة. قم بفك الغمد الموجود على إبرة الأنسولين التي تحتوي على فيروس العدس.
    2. قم بإعداد طبق بتري يحتوي على قطع صغيرة من الأنسجة ومطهر قائم على غلوكونات الكلورهيكسيدين ، وأنبوب سعة 50 مل يحتوي على محلول إزالة التلوث (محلول تبييض 2000 جزء في المليون) ، وحاوية آمنة حادة.
  4. كبح جماح الفأر عن طريق الإمساك بالجلد عند مؤخرة الرقبة21. الماوس المقيد بشكل صحيح غير متحرك ، وهذا مطلوب للسلامة.
  5. مع توجيه البطن لأعلى ، وجه رأس لأسفل قليلا. حقن الفيروس العدسي داخل الصفاق في الربع الأيمن السفلي من تجويف البطن. هذا لتجنب الحقن في أي أعضاء تجويف البريتوني.
  6. قبل تحرير الماوس ، املأ المحقنة بمحلول إزالة التلوث وتخلص منها بأمان في الصندوق الآمن الحاد.
  7. امسح موقع الحقن على بطن الفأر بأنسجة مبللة بالمطهر وأعد إلى القفص.
  8. ضع الفأر المحقون بفيروس العدس في الفئة الثانية من سكانتينر أو أقفاص التهوية الفردية (IVC) (أقفاص معزولة مع ترشيح هواء عالي الكفاءة) لمدة لا تقل عن 72 ساعة بعد الحقن. ضع بطاقة معلومات مناسبة في مقدمة القفص.
  9. انقل الماوس إلى الفئة الجديدة I التي تحمل القفص بعد 72 ساعة بعد الإصابة ، اعتمادا على موافقات السلامة المحلية. مراقبة الفئران يوميا لمدة 3 أيام من الحقن.

7. جمع الخلايا البريتونية من الفئران المصابة بفيروس lentivirus

تنبيه: بالنسبة للمجموعات في غضون 72 ساعة بعد حقن فيروس العدس ، اتبع قواعد السلامة البيولوجية المؤسسية من الفئة الثانية. يجب تطهير الفراش وقفص الاحتجاز حيث تم الاحتفاظ بالحيوانات المصابة في أول 72 ساعة بعد حقن فيروس العدس وفقا لقواعد السلامة البيولوجية المؤسسية من الفئة الثانية.

  1. القتل الرحيم للفئران باتباع اللوائح المؤسسية ، على سبيل المثال ، عن طريق استنشاق تركيز متزايد من CO2 ، يليه تأكيد الوفاة عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. تنظيف البطن من الماوس مع 70 ٪ الأيزوبروبانول وقطع الجلد بعناية لفضح غشاء تجويف البريتوني.
  3. اغسل التجويف البريتوني ب 6 مل من محلول FACS المثلج باستخدام حقنة 10 مل وإبرة 23 جرام. تجنب ثقب أي أعضاء.
  4. قم بتدليك الصفاق برفق لإزاحة الخلايا إلى المخزن المؤقت FACS.
  5. جمع السائل البريتوني باستخدام نفس المحقنة والإبرة.
  6. قم بإزالة الإبرة ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
  7. الحفاظ على غسل البريتوني على الجليد.
  8. جمع الأعضاء الأخرى المطلوبة وتخزينها بما يتناسب مع الدراسة.
  9. تخلص من جثث وفقا لإرشادات والسلامة المحلية.

8. تلطيخ الخلايا البريتونية وتحليلها

  1. أجهزة الطرد المركزي غسل الصفاق عند 350 × غرام عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وتجاهل المادة الطافية في محلول إزالة التلوث ، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت FACS.
  2. عد الخلايا المجمعة واللوحة 4 × 105 خلايا لكل بئر في لوحة 96 بئر ذات قاع V.
  3. قم بإجراء تلطيخ الجدوى باستخدام كاشف قابل للتثبيت (على سبيل المثال ، مجموعة بقع الخلايا الميتة القريبة من الأشعة تحت الحمراء القابلة للإصلاح المستخدمة هنا) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. إذا كانت الخلايا مصابة خلال ال 72 ساعة الماضية ، فقم بتثبيت الخلايا في 2٪ PFA لمدة 15 دقيقة على الجليد. أضف حجما متساويا من DPBS البارد وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. تحضير المخزن المؤقت للحجب: امزج 4 ميكروغرام / مل 2.4G2 من الجسم المضاد في مصل الفئران بنسبة 10٪ (v / v) في المخزن المؤقت FACS لتلطيخ السطح أو المخزن المؤقت للنفاذية للتلطيخ داخل الخلايا.
  6. أعد تعليق كل بئر يحتوي على حبيبات خلوية في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
  7. تحضير مزيج الأجسام المضادة إما في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS (لتلطيخ السطح) أو المخزن المؤقت للنفاذية (للتلطيخ داخل الخلايا) لكل عينة. سيكون حجم التلوين النهائي لكل عينة 100 ميكرولتر ، بما في ذلك 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر. احسب تركيزات الأجسام المضادة وفقا لذلك (الجدول 1).
  8. أضف 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة إلى العينات و 50 ميكرولتر من عناصر التحكم في النمط المتماثل ومخزن التحكم للتحكم في العينات. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام. قم بتضمين الخلايا غير الملوثة وعناصر التحكم في النمط المتماثل كما هو مطلوب.
  9. اغسل كل بئر ب 100-200 ميكرولتر من DPBS المثلج البارد وأجهزة الطرد المركزي على اللوحة عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة لإزالة أي أجسام مضادة غير مقيدة. تحليل العينات على مقياس التدفق الخلوي.

9. استخراج الخلايا من الأعضاء

  1. تحضير 1 مل من مزيج الهضم لكل عضو: امزج محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ، 2 مجم / مل كولاجيناز من النوع الرابع ، و 0.03 مجم / مل DNase I (بما في ذلك 1.5 مجم / مل من الهيالورونيداز لهضم الرئة).
  2. نقل العضو الذي تم جمعه إلى 1 مل من مزيج الهضم وفرمه بالمقص.
  3. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. في حالة عزل الخلايا من الرئة أو الطحال أو الكبد ، تحلل خلايا الدم الحمراء باستخدام محلول تحلل ACK (150 mM NH4Cl ، 10 mM KHCO3 ، 0.1 mMNa 2EDTA pH = 7.4). قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. تلطيخ وتحليل الخلايا كما هو موضح في القسم 8.

النتائج

عند اتباع هذا البروتوكول بشكل كامل وصحيح ، ينتج ما مجموعه 1.5 مل من مخزون فيروس العدس عالي الجودة لكل مستحضر واحد ، وهو ما يكفي لاثني عشر حقنة في الجسم الحي بالحجم الأمثل المحدد في هذه الدراسة18. يمكن تقييم نجاح النقل في وقت مبكر من البروتوكول. يجب أن تعرض خ...

Discussion

تؤدي البلاعم المقيمة في الأنسجة مجموعة من الوظائف الخاصة بالأنسجة الاستتبابيةوالالتهابية 1,2 التي تمليها بيئتهاالفسيولوجية 6،7،8،9. في هذا البروتوكول ، تم تقديم طريقة ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث ، كليا أو جزئيا ، من خلال جائزة Wellcome Trust Investigator [107964 / Z / 15 / Z]. يتم دعم P.R.T أيضا من قبل معهد أبحاث الخرف في المملكة المتحدة. يتم دعم MAC من قبل زمالة اكتشاف مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BB / T009543 / 1). لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلف بتطبيق ترخيص حقوق الطبع والنشر العام CC BY على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف تنشأ عن هذا التقديم. L.C.D محاضر في جامعة سوانسي وزميل باحث فخري في جامعة كارديف. هذا العمل مدعوم بالعمل الذي قام به Ipseiz et al. 202018.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM)Thermo Fisher Scientific25300054
0.22 μm sterile millex GP filterMerckSLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filterMerckSLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)BD324892
1 Litre Sharps ContainerN/AN/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)Biolegend101320
40 μm strainerThermo Fisher Scientific22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax SupplementThermo Fisher Scientific31035025
Blocking bufferprepared in house
Brewer thioglycolate mediumSigma-AldrichB25514% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11bBiolegend101222Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11bBD550993Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11cBiolegend117317Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11cBiolegend117333Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19BD560375Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19Biolegend152410Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226Biolegend128808Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3eBD560527Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3eBiolegend152313Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4Biolegend100412Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73eBioscience16-0731-82Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8aeBioscience48-0081-82Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)Greiner Bio One658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mmBeckman Coulter358126
CentrifugesBeckman CoulterUltracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IVSigma-AldrichC5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL)Greiner Bio One11512303 & 11849650
CryotubesGreiner Bio One123277or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamineThermo Fisher Scientific41965-062
Dnase ISigma-Aldrich11284932001
Effectene transfection reagentQiagen301425
F4/80Biolegend123123Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80Biolegend123133Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80Biolegend123147Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1eBioscience48-5898-80Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS) Thermo Fisher Scientific10270-106heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometerThermo Fisher Scientific Attune NxT
Flow cytometry (FACS) bufferprepared in house
Fluorescent tissue culture microscopeThermo Fisher ScientificEVOS FL
ForcepsN/AN/AUser preference
Hank's balanced salt solution (HBSS)Gibco, Life Technologies14175-053
HEK293T cell linegrown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigenBeckman Coulter6604667
HyaluronidaseSigma-AldrichH3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanserEcolab3037170
I-A/I-EBiolegend107625Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1Becton Dickinson554970Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell linegrown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kitThermo Fisher ScientificL34975
Ly6GBiolegend127615Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Micehere used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL)Fisher Scientific & Starlab11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1Biolegend108724Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148-500Gprepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmidZuffrey, R., et al. 1997encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Petri dishGreiner Bio One664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmidRosas, M. et al. 2014modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmidNaldini, L. et al. 1996encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype controlBecton Dickinson550617Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serumSigma-AldrichR9759-10ML
Red blood ACK lysis bufferprepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamineThermo Fisher Scientific21875-091
SaponinSigma-AldrichS4521
SiglecFBD562681Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm)Guest MedicalH8818
Sterile 24-well cell culture plateGreiner Bio One662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - freeThermo Fisher Scientific14190144
Sterile EDTAThermo Fisher Scientific15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm)VWR612-4515
SucroseThermo Fisher Scientific15503022
surgical scissorsN/AN/AUser preference
Syringes (50 mL and 1 0mL)Fisher Scientific10084450 & 768160
Tim4Biolegend130007Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plateGreiner Bio One650180

References

  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. Macrophages in homeostatic immune function. Front Physiol. 5, 146 (2014).
  3. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  4. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  5. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  6. Amit, I., Winter, D. R., Jung, S. The role of the local environment and epigenetics in shaping macrophage identity and their effect on tissue homeostasis. Nat Immunol. 17 (1), 18-25 (2016).
  7. Gosselin, D., et al. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).
  8. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  9. Davies, L. C., et al. Peritoneal tissue-resident macrophages are metabolically poised to engage microbes using tissue-niche fuels. Nat Commun. 8 (1), 2047 (2017).
  10. Shi, J., Hua, L., Harmer, D., Li, P., Ren, G. Cre driver mice targeting macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 263-275 (2018).
  11. Wang, X., et al. Recent advances in lentiviral vectors for gene therapy. Sci China Life Sci. 64 (11), 1842-1857 (2021).
  12. Kosaka, Y., et al. Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells. Artif Organs. 28 (3), 271-277 (2004).
  13. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  14. Yamashita, M., Emerman, M. Capsid is a dominant determinant of retrovirus infectivity in nondividing cells. J Virol. 78 (11), 5670-5678 (2004).
  15. Wilson, A. A., et al. Lentiviral delivery of RNAi for in vivo lineage-specific modulation of gene expression in mouse lung macrophages. Mol Ther. 21 (4), 825-833 (2013).
  16. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  17. Finkelshtein, D., Werman, A., Novick, D., Barak, S., Rubinstein, M. LDL receptor and its family members serve as the cellular receptors for vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7306-7311 (2013).
  18. Ipseiz, N., et al. Effective in vivo gene modification in mouse tissue-resident peritoneal macrophages by intraperitoneal delivery of lentiviral vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 21-31 (2020).
  19. Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
  20. . Available from: https://www.mybeckman.uk/resources/technologies/centrifugation/principles/rotor-balancing (2023)
  21. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , (2023).
  22. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol. 15 (9), 871-875 (1997).
  23. Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  24. al Yacoub, N., Romanowska, M., Haritonova, N., Foerster, J. Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing large inserts. J Gene Med. 9 (7), 579-584 (2007).
  25. Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV restriction factors and mechanisms of evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
  26. Sonza, S., et al. Susceptibility of human monocytes to HIV type 1 infection in vitro is not dependent on their level of CD4 expression. AIDS Res Hum Retroviruses. 11 (7), 769-776 (1995).
  27. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.1 (2003).
  28. Brown, L. Y., Dong, W., Kantor, B. An Improved protocol for the production of lentiviral vectors. STAR Protoc. 1 (3), 100152 (2020).
  29. Moce-Llivina, L., Jofre, J., Muniesa, M. Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions. J Virol Methods. 109 (1), 99-101 (2003).
  30. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Sci Rep. 5, 13875 (2015).
  31. Czubala, M. A., et al. TGFbeta induces a SAMHD1-independent post-entry restriction to HIV-1 infection of human epithelial langerhans cells. J Invest Dermatol. 136 (10), 1981-1989 (2016).
  32. Bouabe, H., Okkenhaug, K. Gene targeting in mice: a review. Methods Mol Biol. 1064, 315-336 (2013).
  33. Kim, J. M., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y. Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice. Nat Immunol. 8 (2), 191-197 (2007).
  34. Decalf, J., et al. Sensing of HIV-1 entry triggers a Type I Interferon response in human primary macrophages. J Virol. 91 (15), e00147-e00217 (2017).
  35. Wilson, A. A., et al. Amelioration of emphysema in mice through lentiviral transduction of long-lived pulmonary alveolar macrophages. J Clin Invest. 120 (1), 379-389 (2010).
  36. Markusic, D. M., van Til, N. P., Hiralall, J. K., Elferink, R. P., Seppen, J. Reduction of liver macrophage transduction by pseudotyping lentiviral vectors with a fusion envelope from Autographa californica GP64 and Sendai virus F2 domain. BMC Biotechnol. 9, 85 (2009).
  37. Burke, B., Sumner, S., Maitland, N., Lewis, C. E. Macrophages in gene therapy: cellular delivery vehicles and in vivo targets. J Leukoc Biol. 72 (3), 417-428 (2002).
  38. Bain, C. C., Jenkins, S. J. The biology of serous cavity macrophages. Cell Immunol. 330, 126-135 (2018).
  39. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

HEK293T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved