تشريح الفئران في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي بالكامل

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لاستكمال تشريح الجهاز العصبي المركزي والمحيطي للفئران. يتم تحليل الأنسجة المقطعة بشكل أكبر في التطبيقات النهائية ، مثل التقاط صور إجمالية أو الأنسجة.

Abstract

تمثل النماذج الحيوانية العمود الفقري في مجال علم الأعصاب. على الرغم من ذلك ، لا يوجد حتى الآن بروتوكول خطوة بخطوة لتشريح الجهاز العصبي الكامل للقوارض ، ولا يوجد تخطيطي كامل يمثله متاحا مجانا. تتوفر فقط طرق حصاد الدماغ والحبل الشوكي وعقدة الجذر الظهري المحددة والعصب الوركي (بشكل منفصل). هنا ، نقدم صورا مفصلة ومخططا للجهاز العصبي المركزي والمحيطي للفئران. والأهم من ذلك ، أننا نحدد إجراء قويا لإجراء تشريحه. تسمح خطوة ما قبل التشريح لمدة 30 دقيقة بعزل الجهاز العصبي السليم داخل الفقرة بعضلات خالية من الأحشاء والجلد. يتبعه تشريح لمدة 2-4 ساعات تحت مجهر التشريح المجهري لفضح الحبل الشوكي والأعصاب الصدرية ، وأخيرا تقشير الجهاز العصبي المركزي والمحيطي بالكامل من الذبيحة. يمثل هذا البروتوكول خطوة مهمة إلى الأمام في دراسة التشريح والفيزيولوجيا المرضية للجهاز العصبي على مستوى العالم. على سبيل المثال ، يمكن معالجة العقدات الجذرية الظهرية التشريح من نموذج الفئران الورمي العصبي الليفي من النوع الأول بشكل أكبر من أجل علم الأنسجة لكشف التغيرات في تطور الورم.

Introduction

الهدف العام من هذه الطريقة هو عزل الجهاز العصبي المركزي والمحيطي للفأر في قطعة واحدة. لا يوجد حاليا بروتوكول لتشريح الجهاز العصبي بأكمله للقوارض لدراسته على المستوى العالمي. يستخدم علماء الأعصاب عادة العصب الوركي كبديل لأي عصب محيطي¹ ، والعقدات L3 إلى L5² كبديل لأي عقدات. باستخدام هذه الطرق ، من المستحيل استنتاج ما إذا كانت النتائج خاصة بالعصب / العقدة المعينة. كما هو معروف أن بعض أمراض الأعصاب على الأقل لا تؤثر على جميع الأعصاب والعقدات بالتساوي^3،4،5 ، يجب على المرء تطوير تقنية للسماح بعزل الجهاز العصبي الكامل للقوارض لدراسته على مستوى العالم.

على مر السنين ، قمنا بتطوير وتحسين طريقة لتشريح الجهاز العصبي المركزي والمحيطي الكامل للفئران. الخطوة الأولى هي في الأساس تشريح إجمالي للفئران استعدادا لخطوات التشريح الدقيق تحت مجهر التشريح. في الخطوات من 2 إلى 4 ، يتعرض الحبل الشوكي والأعصاب الصدرية ، ويتم تشريح الدماغ ، ويتم تقشير الحبل الشوكي والأعصاب الطرفية بالكامل من الذبيحة.

هذه الطريقة قوية عندما تقترن بالتصوير أو الأنسجة لتوثيق أي تغيير عياني أو مجهري^6،7،8،9. يجب على علماء الأعصاب المهتمين بمسح التغيير العالمي أو إجراء تجارب غير مدفوعة بالفرضيات استخدام هذه الطريقة لمسح الجهاز العصبي العالمي.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكولات المستخدمة في هذه الدراسة من قبل Comité Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke ، وهي مؤسسة معتمدة من المجلس الكندي لرعاية.

1. التحضير للتشريح الدقيق (ما قبل التشريح)

1. إجراء التخدير باستخدام 5٪ إيزوفلوران ، يليه القتل الرحيم بنسبة 2٪ إيزوفلوران و 10 رطل لكل بوصة مربعة من ثاني أكسيد الكربون₂ حتى لا تظهر علامات حيوية.
   ملاحظة: لا تقم بخلع عنق الرحم ، لأن هذا يضر بالحبل الشوكي والعقدات العنقية.
2. ضع الفأر القتل رحيم متجها لأعلى (المنظر الأمامي) على وسادة تشريح ، ورش الفراء بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. بعد ذلك ، قم بتثبيت الأطراف العلوية والسفلية ، باستخدام أربعة دبابيس ذات قطر صغير لتثبيت الماوس في موضعه أثناء التشريح.
4. باستخدام المقص الجراحي ، اقطع الجلد من أسفل البطن إلى الحلق.
5. قشر الجلد لكشف الأعضاء الداخلية ، واستخدم دبابيس إضافية للحفاظ على الجلد على كل جانب أثناء تعريض تجويف البطن.
6. اقطع القفص الصدري لكشف القلب والرئتين.
7. باستخدام زوج من الملقط التشريحي القياسي ، أمسك المريء والقصبة الهوائية ، واقطع فوق الملقط مباشرة.
8. ثم ابدأ في تقشير جميع الأعضاء الداخلية في نهج الجمجمة إلى الذيلية. للقيام بذلك ، قم بقص الحجاب الحاجز على طول العمود الفقري لإزالة جميع الأعضاء الداخلية في قطعة واحدة.
9. قم بفك تثبيت الماوس واشطف دم الفأر الزائد من تجويف البطن في الحوض.
10. ضع الماوس ووجهه لأسفل (العرض الخلفي). قم بتثبيت الأطراف العلوية والسفلية باستخدام أربعة دبابيس لتثبيت الماوس في موضعه أثناء التشريح.
11. باستخدام المقص الجراحي ، قشر الجلد من الرأس إلى الأطراف الخلفية.
12. كشف العصب الوركي الأيسر (الطرف السفلي).
    1. قطع العضلات المفتوحة في الجزء السفلي من الطرف السفلي الأيسر.
    2. حدد موقع العصب الوركي وفضحه عن طريق إزالة العضلة المحيطة به.
    3. قم بقطع العصب الوركي بعناية عند تداعيات العصب السورالي والظنبوبي والشظوي ، وتجنب الأوعية الدموية.
    4. استمر في عزل العصب الوركي باستخدام ملقط تشريحي قياسي ومقص بون ناعم للغاية ، حتى يصبح موازيا للعمود الفقري ، تاركا عصبا حرا يبلغ طوله حوالي 2 سم.
    5. أدخل المقص الجراحي الموازي للحبل الشوكي ، واقطع الورك.
    6. خلع الورك عن طريق تفكيك العجز وعظم الفخذ باستخدام الأصابع.
       ملاحظة: خلال هذه العملية ، يجب التوقف بشكل متكرر لسحب العصب الوركي برفق باستخدام الملقط لتجنب الاضطراب.
    7. في النهاية ، قم بتمزيق الطرف الخلفي بدقة من جثة الفأر ، تاركا عصب وركي يبلغ طوله حوالي 4 سم.
       ملاحظة: خلال هذه العملية ، حدد موقع العصب L2 ، وقم بإخراجه من الطرف الخلفي لتجنب تلف L2. كرر الخطوة 1.12 للجانب الأيمن.
13. كشف الأعصاب العضدية (الأطراف العلوية).
    1. قم بمعالجة جثة الفأر في اليدين ، بدلا من سطح مستو (وسادة تشريح).
    2. حدد موقع الضفيرة العضدية اليسرى عن طريق إغاظة الدهون والعضلات في الإبط الأيسر.
    3. بمجرد تحديد موقعها ، قم بقطع تشعبات الضفيرة العضدية الرئيسية (شعاعيا ، إبطية ، فوق الكتف) وتشعباتها الفرعية حول الزند بمقص بون ناعم للغاية ، تاركا أعصابا حرة تبلغ حوالي 1.5 سم. انزع الضفيرة برفق من الطرف الأيسر العلوي.
    4. خلع الطرف الأيسر العلوي; تأكد من أنه خال من الأعصاب. كرر الخطوة 1.13 للجانب الأيمن.
14. كشف الدماغ.
    1. الآن ، ضع الماوس ووجهه لأعلى (المنظر الأمامي)
    2. أدخل شفرة واحدة من مقص بون الناعم للغاية في الفم ، واقطع الفك السفلي من خلال الحلق.
    3. قم بإزالة الفك السفلي عن طريق قطع الخدين إلى الحلق.
    4. ثم قم بقطع عظم الجمجمة الذي يمر من أذن إلى أخرى.
       ملاحظة: احرص على تجنب التعمق الشديد وإلحاق الضرر بالدماغ.
    5. قطع وإزالة الحنك وعظام الأنف لفتح الجمجمة.
    6. قطع فقرة C1 في قاعدة الجمجمة ، وإطلاق المخيخ وبداية النخاع الشوكي.
    7. أخيرا ، قم بقص الجمجمة بشكل عرضي حتى العين ، وقم بإزالة قطع الجمجمة لكشف الدماغ.
       ملاحظة: حافظ على الدماغ في تجويفه حتى يتم تقشير الأعصاب.
15. قم بإزالة أي دهون أو عضلات زائدة من الذبيحة. ضع الذبيحة في 10٪ فورمالين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) ، متبوعة بغسل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لفترة وجيزة حتى تختفي الرائحة المثبتة ، وانتقل إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: إذا تم تشريح الجهاز العصبي في الأسبوعين المقبلين ، فقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية في PBS. خلاف ذلك ، قم بتخزينه في 10٪ فورمالين إلى أجل غير مسمى. استخدم دائما غطاء المحرك الكيميائي عند التلاعب بالفورمالين.

2. التعرض للحبل الشوكي

1. لكشف الحبل الشوكي ، استخدم نهجا من الجمجمة إلى الذيلية. لإزالة كل فقرة وطبقة عضلاتها أعلاه ، قم بقص موضع الساعة العاشرة والساعة الثانية على الجانب البطني ، باستخدام مقص زنبركي Vannas. قم بتقطيع الفقرة باستخدام ملقط دومون الصغير. استمر في هذه العملية من خلال فقرات عنق الرحم والصدر.
2. بالنسبة للقسم القطني ، قم بقص العملية العرضية على كل جانب من جوانب الفقرة. ثم قم بالقص في وضعي الساعة الثانية والعاشرة عن طريق إدخال شفرة زوج من مقص زنبركي Vannas في القناة الفقرية. قم بإزالة الأنسجة ، مع الانتباه إلى الأعصاب التي تلتصق أحيانا بالعظام.
3. تابع بالمثل للجزء الذيلي.

3. التعرض للعصب الصدري

1. ضع الذبيحة تحت مجهر التشريح لتصور الجانب الأمامي.
2. باستخدام مقص زنبركي Vannas ، قم بقص كل ضلع (من القص إلى الأطراف السفلية) لفضح الأعصاب الطرفية.
3. بعد ذلك ، قم بقطع الفقرة على جانبي العقدة (جانبيا) لفضح العقدة.

4. تقشير الأعصاب الطرفية

1. لتقشير الحبل الشوكي وإزاحة الأعصاب الطرفية بشكل أكبر ، استخدم ملقط دومون المصغر لدحرجة الحبل الشوكي برفق وسحب الأعصاب واحدة تلو الأخرى ، بدءا من الجزء الذيلي من الحبل الشوكي.
   ملاحظة: قبل التقشير ، يمكن إجراء تثبيت إضافي في 10٪ فورمالين لمدة 15 دقيقة في RT ، متبوعا بغسيل قصير 1x PBS حتى تختفي الرائحة المثبتة ، كما هو موضح في الخطوة 1.15.
2. بالنسبة للجزء الصدري ، اسحب العصب بزاوية 90 درجة (عموديا على الحبل الشوكي).
3. بالنسبة للضفيرة العضدية ، قم بقطع الفقرة بجوار العصب لإفساح المجال للعصب.
   ملاحظة: لا يمكن تمرير الضفيرة العضدية تحت الفقرة ، كما هو الحال في المنطقة الصدرية
4. قم بإزالة العضلات الزائدة لتنظيف الأعصاب.
5. يحفظ في PBS عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين ، أو إلى أجل غير مسمى في 10٪ فورمالين في RT.

النتائج

لعبت القوارض دورا أساسيا في فهمنا لبيولوجيا الجهاز العصبي والفيزيولوجيا المرضية¹⁰. ومن المثير للاهتمام ، أنه لا توجد طرق تقدم التشريح الكامل للجهاز العصبي المركزي والمحيطي للقوارض لتقييم التشريح والتباين المرضي في نموذج الوقت الفعلي^1،

Discussion

لمنع العضلات والأعصاب من الجفاف ، يجب نقع الذبيحة في PBS كل 10 دقائق. عند خلع الأطراف السفلية (الخطوة 1.12.6) ، من المهم دائما أن تكون الضفيرة الوركي و L2 في الأفق لتجنب إلحاق الضرر / التمزق بها. عند تشريح الدماغ (الخطوة 1.14.4) ، من الأهمية بمكان تجنب التعمق الشديد حتى لا تتلف الدماغ....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont mini-forceps	Fine Science Tools	#11200-10
Extra Bonn scissors	Fine Science Tools	#14084-08
Formalin 10%	Fischer Scientific	#22-046-361
PBS 1x	BioShopCanada	#PBS404.500
Standard anatomical forceps	Fine Science Tools	#91100-12
Surgical scissors	Fine Science Tools	#140001-12
Vannas spring scissors	Kent Scientific	#INS600124