JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول استراتيجية متكاملة لاستكشاف الأهداف والآليات الرئيسية ل Fructus Phyllanthi ضد فرط شحميات الدم بناء على التنبؤ بعلم الأدوية الشبكي والتحقق من الأيض.

Abstract

أصبح فرط شحميات الدم عامل خطر رئيسي لأمراض القلب والأوعية الدموية وإصابات الكبد في جميع أنحاء العالم. Fructus Phyllanthi (FP) هو دواء فعال ضد فرط شحميات الدم في الطب الصيني التقليدي (TCM) ونظريات الطب الهندي ، ولكن الآلية المحتملة تتطلب مزيدا من الاستكشاف. يهدف البحث الحالي إلى الكشف عن آلية FP ضد فرط شحميات الدم بناء على استراتيجية متكاملة تجمع بين التنبؤ بعلم الأدوية الشبكي والتحقق من صحة الأيض. تم إنشاء نموذج الفئران التي يسببها نظام غذائي عالي الدهون (HFD) من خلال تقييم مستويات الدهون في البلازما ، بما في ذلك الكوليسترول الكلي (TC) والدهون الثلاثية (TG) وكوليسترول البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL-C) وكوليسترول البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL-C). تم تطبيق علم الأدوية الشبكي لمعرفة المكونات النشطة ل FP والأهداف المحتملة ضد فرط شحميات الدم. تم إجراء الأيض للبلازما والكبد لتحديد المستقلبات التفاضلية والمسارات المقابلة لها بين المجموعة الطبيعية ومجموعة النموذج ومجموعة التدخل. تم بناء العلاقة بين علم الأدوية الشبكي والأيض للحصول على رؤية شاملة لعملية FP ضد فرط شحميات الدم. تم التحقق من البروتينات المستهدفة الرئيسية التي تم الحصول عليها عن طريق الالتحام الجزيئي. عكست هذه النتائج أن FP حسن مستويات الدهون في البلازما وإصابة الكبد من فرط شحميات الدم الناجم عن HFD. تم عرض حمض الغال ، كيرسيتين ، وبيتا سيتوستيرول في FP كمركبات نشطة رئيسية. تم العثور على ما مجموعه 16 وستة مستقلبات تفاضلية محتملة في البلازما والكبد ، على التوالي ، للمشاركة في الآثار العلاجية ل FP ضد فرط شحميات الدم عن طريق الأيض. علاوة على ذلك ، أشار تحليل التكامل إلى أن تأثيرات التدخل كانت مرتبطة ب CYP1A1 و AChE و MGAM ، بالإضافة إلى تعديل L-kynurenine و corticosterone و acetylcholine و raffinose ، والتي تتضمن بشكل أساسي مسار استقلاب التربتوفان. يضمن الالتحام الجزيئي أن المكونات المذكورة أعلاه التي تعمل على أهداف البروتين المرتبطة بفرط شحميات الدم لعبت دورا رئيسيا في خفض الدهون. باختصار ، قدم هذا البحث إمكانية جديدة لمنع وعلاج فرط شحميات الدم.

Introduction

فرط شحميات الدم هو مرض استقلابي شائع له آثار خطيرة على صحة الإنسان ، وهو أيضا عامل الخطر الرئيسي لأمراض القلب والأوعية الدموية1. في الآونة الأخيرة ، كان هناك اتجاه هبوطي مرتبط بالعمر لهذا المرض ، وأصبح الشباب أكثر عرضة بسبب أنماط الحياة غير المنتظمة طويلة الأجل وعادات الأكل غير الصحية2. في العيادة ، تم استخدام العديد من الأدوية لعلاج فرط شحميات الدم. على سبيل المثال ، واحدة من الأدوية الأكثر استخداما للمرضى الذين يعانون من فرط شحميات الدم واضطرابات تصلب الشرايين ذات الصلة هي العقاقير المخفضة للكوليسترول. ومع ذلك ، فإن الاستخدام طويل الأمد للعقاقير المخفضة للكوليسترول له آثار جانبية لا يمكن إهمالها ، مما يؤدي إلى سوء التشخيص ، مثل عدم تحمل ، ومقاومة العلاج ، والأحداث الضائرة 3,4. أصبحت أوجه القصور هذه آلاما إضافية لمرضى فرط شحميات الدم. لذلك ، ينبغي اقتراح علاجات جديدة لفعالية مستقرة لخفض الدهون وآثار جانبية أقل.

يستخدم الطب الصيني التقليدي (TCM) على نطاق واسع لعلاج الأمراض بسبب فعاليته الجيدة وآثاره الجانبية القليلة5. Fructus Phyllanthi (FP) ، الفاكهة المجففة من Phyllanthus emblica Linn. (المعروف شعبيا باسم أملا التوت أو عنب الثعلب الهندي) ، هو دواء مشهور ومواد غذائية متماثلة من الأدوية الصينية والهندية التقليدية 6,7. تم استخدام هذا الدواء لإزالة الحرارة وتبريد الدم وتعزيز الهضم ، وفقا لنظريات الطب الصيني التقليدي8. أظهرت الدراسات الدوائية الحديثة أن FP غني بالمركبات النشطة بيولوجيا مثل أحماض الغال والأحماض الإيلاجية والكيرسيتين9 ، المسؤولة عن مجموعة من الخصائص البيولوجية متعددة الأوجه ، من خلال العمل كمضاد للأكسدة ، ومضاد للالتهابات ، وحماية الكبد ، ومضاد لنقص شحميات الدم ، وما إلى ذلك10. أظهرت الأبحاث الحديثة أيضا أن FP يمكن أن ينظم بشكل فعال نسبة الدهون في الدم للمرضى الذين يعانون من فرط شحميات الدم. على سبيل المثال ، أظهر Variya et al.11 أن عصير الفاكهة FP ومكونه الكيميائي الرئيسي لحمض الغال يمكن أن يقلل من نسبة الكوليسترول في البلازما ويقلل من تسلل الزيت في الكبد والشريان الأورطي. كانت الفعالية العلاجية مرتبطة بتنظيم FP في زيادة التعبير عن مستقبلات ألفا المنشطة بتكاثر البيروكسيسوم وتقليل النشاط الشحمي الكبدي. ومع ذلك ، ينبغي إجراء مزيد من التحقيق في الآلية الأساسية ل FP في تحسين فرط شحميات الدم ، لأن مكوناته النشطة بيولوجيا واسعة جدا. سعينا لاستكشاف الآلية المحتملة للفعالية العلاجية ل FP ، والتي قد تكون مفيدة لمزيد من التطوير والاستفادة من هذا الدواء.

حاليا ، يعتبر علم الصيدلة الشبكي تقنية شاملة وفعالة لدراسة الآلية العلاجية للطب الصيني التقليدي. بدلا من البحث عن جينات واحدة مسببة للأمراض وعقاقير تعالج هدفا فرديا فقط ، يتم إنشاء شبكة كاملة من مكونات الأدوية والجينات والأمراض للعثور على آلية متعددة الأهداف للدواء متعدد المكونات فيما يتعلق بعلاجهم الشامل12. هذه التقنية مناسبة بشكل خاص للطب الصيني التقليدي ، حيث أن تركيباتها الكيميائية ضخمة. لسوء الحظ ، لا يمكن استخدام علم الأدوية الشبكي إلا للتنبؤ بالأهداف المتأثرة بالمكونات الكيميائية من الناحية النظرية. يجب ملاحظة المستقلبات الداخلية في نموذج المرض للتحقق من فعالية علم الأدوية الشبكي. تعد طريقة الأيض ، التي تظهر مع تطور بيولوجيا الأنظمة ، أداة مهمة لرصد التغيرات في المستقلبات الداخلية13. تعكس التغييرات في المستقلبات تغيرات الحالة المستقرة للمضيف ، وهو أيضا مؤشر مهم لدراسة الآلية الداخلية. نجح بعض الباحثين في دمج علم الأدوية الشبكي والأيض لاستكشاف آلية التفاعل بين الأدوية والأمراض14,15.

تستكشف هذه المقالة الأساس الميكانيكي ل FP ضد فرط شحميات الدم من خلال دمج تقنيات علم الأدوية الشبكي والتمثيل الغذائي. تم تطبيق علم الأدوية الشبكي لتحليل العلاقة بين المكونات النشطة الرئيسية في FP والأهداف الجزيئية لفرط شحميات الدم. في وقت لاحق ، تم إجراء الأيض لمراقبة تغير المستقلبات الداخلية في النموذج الحيواني ، والتي يمكن أن تفسر إجراءات الدواء على مستوى التمثيل الغذائي. بالمقارنة مع تطبيق علم الأدوية الشبكي أو الأيض وحده ، قدم هذا التحليل المتكامل آلية بحث أكثر تحديدا وشمولا. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام استراتيجية الالتحام الجزيئي لتحليل التفاعل بين المكونات النشطة والبروتينات الرئيسية. بشكل عام ، يمكن لهذا النهج المتكامل أن يعوض عن نقص الأدلة التجريبية لعلم الأدوية الشبكي وعدم وجود آلية داخلية لطريقة الأيض ، ويمكن استخدامه لتحليل الآلية العلاجية للطب الطبيعي. يظهر المخطط الانسيابي التخطيطي الرئيسي للبروتوكول في الشكل 1.

Protocol

تم إجراء جميع الإجراءات التي تنطوي على التعامل مع الحيوانات وفقا لدليل جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية بجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (رقم البروتوكول 2020-36). تم استخدام ذكور C57BL / 6 الفئران (20 ± 2 جم) في هذه الدراسة. تم الحصول على الفئران من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. التنبؤ القائم على علم الأدوية الشبكي

ملاحظة: يستخدم علم الأدوية الشبكي للتنبؤ بالمكونات النشطة وأهدافها الرئيسية من FP ضد فرط شحميات الدم.

  1. اختيار المكونات النشطة والأهداف الرئيسية
    1. ابحث عن الكلمة الرئيسية "Phyllanthi Fructus" في قاعدة بيانات علم الأدوية لنظام الطب الصيني التقليدي (TCMSP ؛ http://tcmspw.com/tcmsp.php) للحصول على قائمة المكونات النشطة المرشحة وأهداف FP.
      ملاحظة: عادة ، يتم تضمين المكونات ذات التوافر البيولوجي الفموي (OB) ≥30٪ والقيم الشبيهة بالأدوية (DL) ≥0.18 في قاعدة البيانات كمكونات نشطة.
    2. ابحث عن الكلمة الرئيسية "فرط شحميات الدم" في قاعدة بيانات GeneCards (https://www.genecards.org/) ، وقاعدة بيانات الوراثة المندلية عبر الإنترنت في الإنسان (OMIM ؛ https://omim.org/) ، وقاعدة بيانات الهدف العلاجي (TTD ؛ http://db.idrblab.net/ttd/) للحصول على الأهداف المرشحة المعنية لفرط شحميات الدم. قم بتنزيل جداول بيانات أهداف المرض. احذف الأهداف المتكررة للحصول على قائمة أهداف فرط شحميات الدم.
    3. انسخ هذه القوائم من الخطوتين 1.1.1 و1.1.2 إلى جدول بيانات جديد. استخدم وظيفة "البيانات - تحديد التكرارات" في شريط الأدوات للحصول على أهداف التقاطع. قم باستيراد قائمة هدف التقاطع إلى UniProtKB (http://www.uniprot.org/) لتوحيد أسماء الجينات والبروتينات.
      ملاحظة: ترتبط هذه الأهداف بكل من FP وفرط شحميات الدم. لذلك ، توقع أهداف التقاطع هذه كأهداف FP ضد فرط شحميات الدم.
  2. بناء شبكة تفاعل البروتين والبروتين
    1. افتح قاعدة بيانات STRING (https://string-db.org/) 11.5. الصق قائمة هدف التقاطع ل FP ضد فرط شحميات الدم في مربع الحوار "قائمة الأسماء". حدد الإنسان العاقل في "الكائنات الحية" وانقر على البحث > متابعة.
      ملاحظة: البشر والفئران لديهم جينات متشابهة للغاية. لذلك ، يتم إجراء مزيد من التحقق التجريبي مع الفئران.
    2. عندما تكون النتائج متاحة ، حدد إخفاء العقد غير المتصلة في الشبكة في "الإعدادات المتقدمة". قم بتعيين أعلى ثقة (0.900) في "الحد الأدنى من نقاط التفاعل المطلوبة" ، ثم انقر فوق الزر تحديث .
    3. انقر فوق الصادرات في شريط العنوان ، وقم بتنزيل النص الجدولي القصير لشبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI) بتنسيق PNG و TSV.
  3. بناء شبكة مستهدفة من مكونات الأدوية والأمراض
    1. افتح Cytoscape 3.9.1 (انظر جدول المواد). قم باستيراد ملف تنسيق TSV للخطوة 1.2.3. قم بتحسين لون عقد الشبكة وخطها وجانبها من خلال شريط الأنماط في لوحة التحكم.
    2. استخدم وظيفة "تحليل الشبكة" لتحليل طبولوجيا الشبكة. الحصول على جينات المحور بواسطة CytoHubba في Cytoscape. إنشاء شبكة الأدوية والمكونات والأمراض المستهدفة.
  4. تحليل التخصيب GO و KEGG
    1. افتح موارد المعلوماتية الحيوية DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). انقر فوق بدء التحليل والصق القائمة المستهدفة في مربع الحوار الأيسر. حدد رمز الجين الرسمي في "تحديد المعرف". حدد الإنسان العاقل في "حدد الأنواع". ضع علامة على قائمة الجينات في "نوع القائمة". انقر فوق إرسال القائمة.
    2. عندما تكون النتائج متاحة ، انقر فوق تحليل قائمة الجينات أعلاه باستخدام إحدى أدوات DAVID. ضع علامة GOTERM_BP_DIRECT ، GOTERM_CC_DIRECT ، GOTERM_MF_DIRECT في "علم الوجود الجيني" لتحليل إثراء وظيفة GO. ضع علامة KEGG_Pathway في "المسارات" لتحليل إثراء مسار KEGG.
    3. انقر فوق مخطط التعليقات التوضيحية الوظيفية لعرض النتائج.
      ملاحظة: تعيين عتبة الدلالة الإحصائية لتحليل الإثراء عند p < 0.05.

2. التصميم التجريبي

  1. إعداد مستخلص مائي FP
    ملاحظة: تتم معالجة FP في مختبر البروفيسور لينا شيا في جامعة تشنغدو في TCM8.
    1. نقع مسحوق المجففة من FP (90 غرام) في 1 لتر من الماء النقي في قارورة حجمية نظيفة 2 لتر. استخدم العلاج بالموجات فوق الصوتية (في حمام مائي 4 درجات مئوية ، الطاقة: 250 واط ، التردد: 35 كيلو هرتز) للمساعدة في الذوبان لمدة 30 دقيقة. قم بتصفية المحلول للحصول على المستخلص بشاش طبي معقم مزدوج الطبقة ، 1 مم × 1 مم. كرر العملية المذكورة أعلاه ثلاث مرات لضمان الحل الكامل ل FP.
    2. استخدم طريقة التبخر الدوار لمزيد من التركيز. اضبط سرعة الدوران على 50 دورة في الدقيقة مع درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. تركيز المستخلص المائي إلى 100 مل.
    3. قسم المستخلص الخام من FP (0.9 جم / مل) بالتساوي إلى جزأين (50 مل). يستخدم جزء واحد كجرعة عالية من سائل FP (0.9 جم / مل). أضف 50 مل من الماء النقي إلى جزء آخر ، واعتبره سائل FP منخفض الجرعة (0.45 جم / مل). استخدم المحاليل المائية FP عالية الجرعة والمنخفضة للإدارة. يخزن السائل في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. إعداد الحيوان
    1. ضع 50 ذكرا من ذكور C57BL / 6 فئران (20 ± 2 جم) في غرفة جيدة التهوية في درجة حرارة الغرفة ، مع دورة 12 ساعة من الضوء والظلام والوصول المجاني إلى الطعام والماء النقي.
    2. قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي إلى مجموعتين: إطعام 10 فئران بنظام غذائي عادي و 40 فأرا بنظام غذائي غني بالدهون (انظر جدول المواد) للحث على فرط شحميات الدم.
      ملاحظة: بعد الرضاعة لمدة 8 أسابيع ، تم فحص الفئران لمزيد من التدخل الدوائي.
    3. في الأسبوع 8 ، سحب حوالي 200 ميكرولتر من الدم من كل مدار الفأر. طرد مركزي الدم لمدة 10 دقائق عند 5733 × جم عند 4 درجات مئوية للحصول على عينات البلازما. حدد مستويات TC و TG باستخدام مجموعات الفحص المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    4. حدد ستة فئران ذات مستويات الدهون الأكثر طبيعية كمجموعة التحكم في عدم العلاج (NC). حدد 24 فأرا ذات مستوى دهون أعلى بكثير كمجموعة نظام غذائي عالي الدهون ، وقسمها عشوائيا إلى أربع مجموعات: مجموعة النظام الغذائي عالي الدهون (HFD) ، ومجموعة FP (FP_L) منخفضة الجرعة ، ومجموعة FP (FP_H) عالية الجرعة ، ومجموعة التحكم الإيجابي (PC).
    5. تطبيق الري المعدي لدى المجموعتين FP_L و FP_H بجرعتين من FP (جرعة منخفضة، 4.5 غ/كغ وجرعة عالية، 9 غ/كغ)، على التوالي؛ ري المعدة لمجموعة PC باستخدام أقراص سيمفاستاتين (5 مجم / كجم ؛ انظر جدول المواد) ؛ وري المعدة لمجموعات NC و HFD بنفس الحجم من المحلول الملحي الفسيولوجي مرة واحدة يوميا لمدة 4 أسابيع.
      ملاحظة: استخدمت الدراسة الحالية المحاليل المائية ل FP و simvastatin للعلاج.
    6. في الأسبوع الثاني عشر ، بعد التخدير بنسبة 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم (30 ملغم / كغم) ، التضحية الفئران من جميع المجموعات. جمع ~ 400 ميكرولتر عينات الدم من الوريد المداري لكل فأر.
      ملاحظة: تحفيز أصابع وباطن الفئران بالملاقط. إذا لم يكن هناك رد فعل ، فإنه يثبت التخدير الكافي.
    7. طرد مركزي الدم لمدة 10 دقائق عند 5733 × جم عند 4 درجات مئوية للحصول على عينات البلازما ، وتحديد مستويات TC و TG و LDL-C و HDL-C مع مجموعات الفحص المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). الحصول على عينات أنسجة الكبد16 وإخضاعها للتحليل النسيجي المرضي. استخدم عينات البلازما والكبد المتبقية لتحليل الأيض (الخطوة 3).
      ملاحظة: يتم تخزين جميع العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. فحص أمراض الأنسجة الكبدية
    1. إصلاح أنسجة الكبد الطازجة مع محلول بارافورمالدهيد 4 ٪ لأكثر من 24 ساعة. أخرج الأنسجة من المثبت وقم بتنعيم الأنسجة المستهدفة بمشرط. ضع المنديل والملصق المقابل في المجفف.
    2. الجفاف في تدرج الإيثانول: 75٪ كحول لمدة 4 ساعات ، 85٪ كحول لمدة 2 ساعة ، 90٪ كحول لمدة 2 ساعة ، 95٪ كحول لمدة 1 ساعة ، إيثانول مطلق لمدة 1 ساعة ، زيلين لمدة 30 دقيقة. ضع علبة المناديل في قالب مناديل في شمع البارافين لمدة ثلاث غسلات ، 30 دقيقة لكلمنها 16.
    3. ضع المناديل المنقوعة بالشمع في أداة تضمين الأنسجة (انظر جدول المواد). قبل أن يصلب الشمع ، قم بإزالة الأنسجة من المجفف ، وضعها في الصندوق المضمن ، وأرفق الملصق المقابل.
    4. قم بتبريد كتل الشمع في طاولة تجميد -20 درجة مئوية ، وقم بإزالتها من الإطار المضمن ، وقم بقص كتلة الشمع.
    5. قطع كتل الشمع المشذبة إلى أقسام بسمك 3 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم (انظر جدول المواد). تطفو المقاطع في ماء 40 درجة مئوية ، وتخرجها من الشرائح ، وتخبز في فرن 60 درجة مئوية. بعد الخبز بالماء والشمع الجاف ، أخرجه واحتفظ به في درجة حرارة الغرفة.
    6. ضع الأقسام على التوالي في الزيلين I لمدة 10 دقائق ، والزيلين II لمدة 10 دقائق ، والزيلين الثالث لمدة 10 دقائق ، والإيثانول المطلق I لمدة 5 دقائق ، والإيثانول المطلق II لمدة 5 دقائق ، والكحول بنسبة 75٪ لمدة 5 دقائق ، واغسله بالماء16.
    7. قم بتلطيخ الأقسام بمحلول تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة 4 دقائق ، ومحلول كحول حمض الهيدروكلوريك 1٪ (75٪ كحول) للتمايز ، ومحلول ماء الأمونيا 1٪ باللون الأزرق ، واغسلها بالماء.
    8. تلطيخ المقاطع بمحلول تلطيخ eosin لمدة 2 دقيقة واغسلها بالماء.
    9. راقب الأقسام باستخدام مجهر بصري بتكبير 200x و 400x.
  4. تحليل الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي (LC-MS)
    1. تحديد مكونات FP
      ملاحظة: يتم إجراء التحليل باستخدام كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء مقترنة بقياس الطيف الكتلي الهجين رباعي الأقطاب المداري عالي الدقة (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; انظر جدول المواد).
      1. قم بقياس 1 غرام من مسحوق FP المجفف بدقة ووضعه في قارورة حجمية نظيفة سعة 50 مل.
      2. أضف 25 مل من 70٪ ميثانول إلى الدورق الحجمي وقم بوزنه بدقة. استخدم العلاج بالموجات فوق الصوتية (في حمام مائي 4 درجات مئوية ، الطاقة: 250 واط ، التردد: 35 كيلو هرتز) لمدة 30 دقيقة للمساعدة في الذوبان. قم بالوزن بدقة مرة أخرى لتحديد الخسارة بدقة بعد الذوبان ، واستخدم 70٪ ميثانول لتعويض الخسارة.
        ملاحظة: لا تقيس الحجم ، لأن مقياس القارورة الحجمية غير دقيق ، خاصة بعد حمام الماء 4 درجات مئوية.
      3. رج العبوة حتى تمتزج تماما. استخدم غشاء صغير يسهل اختراقه 0.22 ميكرومتر للتصفية.
    2. إعداد عينة البلازما
      1. أضف بدقة 100 ميكرولتر من البلازما (الخطوة 2.2.7) إلى حجم مزدوج (200 ميكرولتر) من الأسيتونيتريل في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، وقم بدوامته بهزاز دوامة لمدة 30 ثانية على الأقل. اتبع هذا الإجراء لجميع العينات.
      2. أجهزة الطرد المركزي جميع العينات عند 17200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل المواد الطافية بعد الطرد المركزي إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل. تجفيف المواد الطافية تحت النيتروجين. إعادة تكوين مع 200 ميكرولتر من مذيب الاستخراج (الأسيتونيتريل: الماء = 4: 1 [v / v]).
      3. دوامة الحل المعاد تشكيله لمدة 30 ثانية على الأقل واستخدام العلاج بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق (في حمام مائي 4 درجات مئوية ، الطاقة: 250 واط ، التردد: 35 كيلو هرتز). أجهزة الطرد المركزي عند 17200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      4. قم بتصفية المواد الطافية بأغشية مرشح 0.22 ميكرومتر واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية للتحليل.
    3. تحضير عينة الكبد
      1. تجانس 90 ملغ من أنسجة الكبد (الخطوة 2.2.7) لمدة دقيقة واحدة في ماء الميثانول المثلج البارد (1: 1 ، v / v ، 1 مل) وطردها مركزيا عند 21500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل. اتبع هذا الإجراء لجميع العينات.
      2. استخرج الرواسب مرة أخرى باتباع نفس الإجراء ، وقم بتجميع المواد الطافية معا في أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 1.5 مل. تجفيف المواد الطافية تحت النيتروجين. إعادة تكوين مع 300 ميكرولتر من مذيب الاستخراج (الميثانول: الماء = 4: 1 [v / v]).
      3. دوامة الحل المعاد تشكيله لمدة 30 ثانية على الأقل واستخدام العلاج بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق (في حمام مائي 4 درجات مئوية ، الطاقة: 250 واط ، التردد: 35 كيلو هرتز). أجهزة طرد مركزي عند 17200 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      4. قم بتصفية المواد الطافية بأغشية مرشح 0.22 ميكرومتر واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية للتحليل.
        ملاحظة: تم تحضير عينات مراقبة الجودة المجمعة (QC) عن طريق خلط 10 ميكرولتر من كل عينة بلازما وكبد (واحدة لكل ست عينات).
    4. معلمات تحليل LC-MS
      ملاحظة: يتكون الطور المتحرك من 0.1٪ حمض الفورميك (المذيب A) والأسيتونيتريل (المذيب B). انقل هذه المذيبات إلى زجاجة زجاجية نظيفة وقم بتوصيلها بنظام LC-MS.
      1. اضبط برامج التدرج لعينات البلازما في "ملف المدخل" لنظام LC-MS على النحو التالي: 1٪ B (0-1.5 دقيقة) ، 1٪ -60٪ B (1.5-13.0 دقيقة) ، 60٪ -99٪ B (13.0-20.0 دقيقة) ، الحفاظ على 99٪ B (20.0-25.0 دقيقة) ، 99٪ -1٪ B (25.0-25.1 دقيقة) ، والحفاظ على 1٪ B حتى 27 دقيقة.
      2. اضبط شروط أخذ العينات الأوتوماتيكية لعينات البلازما في "ملف المدخل" لنظام LC-MS على النحو التالي: حجم الحقن ، 2 ميكرولتر ؛ ومعدل التدفق ، 0.3 مل / دقيقة ، لكل تحليل.
      3. اضبط برنامج التدرج لعينات الكبد في "ملف المدخل" لنظام LC-MS على النحو التالي: 1٪ B (0-1 دقيقة) ، 1٪ -53٪ B (1-15 دقيقة) ، 53٪ -70٪ B (15-30 دقيقة) ، 70٪ -90٪ B (30-32 دقيقة) ، 90٪ -95٪ B (32-40 دقيقة) ، 95٪ -1٪ B (40-42 دقيقة) ، والحفاظ على 1٪ B حتى 45 دقيقة.
      4. اضبط شروط أخذ العينات الأوتوماتيكية لعينات الكبد في "ملف المدخل" لنظام LC-MS على النحو التالي: حجم الحقن ، 5 ميكرولتر ؛ ومعدل التدفق ، 0.3 مل / دقيقة ، لكل تحليل.
      5. قم بتعيين شروط اكتشاف مرض التصلب العصبي المتعدد لكل من عينات البلازما والكبد في "ملف ضبط MS" لنظام LC-MS. قم بإجراء اكتساب MS باستخدام أوضاع التأين الموجبة والسالبة.
        ملاحظة: معلمات التأين بالرش الكهربائي المسخن هي كما يلي: جهد الرش: 3.5 كيلو فولت للتأين الإيجابي و 3.8 كيلو فولت للتأين السلبي ؛ تدفق غاز الغمد: 55 ARB ؛ تدفق الغاز الإضافي: 15 ARB ؛ درجة حرارة سخان المسبار: 300 °C ؛ ودرجة حرارة الشعيرات الدموية: 350 درجة مئوية.
      6. قم باستيراد البيانات الأولية المجمعة إلى برنامج Compound Discoverer، وقم بتعيين قالب الطريقة باتباع إرشادات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

3. التحقق من التمثيل الغذائي

ملاحظة: يتم استيراد بيانات التنميط الأيضي لمستقلبات البلازما والكبد إلى برنامج Compound Discoverer لإجراء استخراج ميزة التمثيل الغذائي من خلال اعتماد خوارزمية استخراج الميزة الجزيئية. اضبط المعلمات على النحو التالي: انحراف الكتلة ، 5 × 10-6 ؛ نطاق الكتلة ، 100-1500 ؛ عتبة نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) ، 3 ؛ وانحراف وقت الاستبقاء ، 0.05. تقييم استقرار وتكرار الأيض من خلال الانحراف المعياري النسبي (RSD) لمناطق ذروة مراقبة الجودة.

  1. استخدم برنامج SIMCA-P (انظر جدول المواد) للتحليل الإحصائي متعدد المتغيرات للقيم المتكاملة التي تم الحصول عليها من نتائج LC-MS. استخدم التحليل التمييزي للمربعات الصغرى الجزئية المتعامدة (OPLS-DA) للبيانات المتمركزة حول المتوسط ونمذجة فئات العينة.
  2. بعد اختبار OPLS-DA ، ضع في اعتبارك المستقلبات ، مع تكامل مع أهمية متغيرة في قيم الإسقاط (VIP) البالغة >1 وقيمة p تبلغ <0.05 من اختبار t للطالب كمستقلبات تفاضلية محتملة.
  3. تحديد المستقلبات المضطربة والمسارات الأيضية من خلال مصادر قاعدة البيانات المفتوحة ، بما في ذلك الأيض البشري (HMDB ؛ http://www.hmdb.ca/) ، موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG ؛ https://www.kegg.jp/) ، و MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. تصور طرق عرض النتائج بواسطة MetaboAnalyst5.0 ومنصة "Wu Kong" (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. الالتحام الجزيئي

  1. قم بتنزيل بنية 3D لمكونات FP المحددة من قاعدة بيانات TCMSP ، على التوالي. ابحث في أسماء المكونات في مربع البحث "الاسم الكيميائي" وقم بتنزيل ملفات بنية 3D المقابلة بتنسيق mol2.
  2. قم بتنزيل الهياكل البلورية للأهداف الرئيسية من قاعدة بيانات بنية البروتين AlphaFold (Alphafold DB ؛ ، https://alphafold.ebi.ac.uk/). ابحث عن الأسماء المستهدفة في مربع البحث وقم بتنزيل ملفات الهياكل البلورية المقابلة بتنسيق pdb.
  3. استيراد المكونات وملف الهياكل الهدف إلى برنامج AutoDockTools. انقر فوق تحرير > حذف الماء لحذف جزيئات الماء. انقر فوق تحرير > الهيدروجين > إضافة لإضافة الهيدروجين . اضبط المكونات على أنها "ligand" وقم بإجراء التحام الأعمى عن طريق تحديد الأهداف بأكملها ك "المستقبل"17.
  4. أدخل قيمة في المربع خلف "المركز" و "الحجم" لضبط المساحة المطورة حديثا ، مما يجعل من الممكن تضمين الرباط والمستقبل بالكامل. احفظ ملفات الليجند والمستقبلات بتنسيق pdbqt.
  5. استخدم AutoDock Vina لإجراء الإرساء الجزيئي. اضبط شريط "المستقبلات" على اسم "receptor.pdbqt" ، وشريط "Ligand" على اسم "ligand.pdbqt". الحصول على الموقع الأمثل لربط يجند للمستقبلات. سجل قيمة طاقة الربط في الموضع الأمثل.
    ملاحظة: تم حساب عملية الإرساء بواسطة الخوارزمية الجينية14. كانت جميع خيارات تشغيل الإرساء قيما افتراضية. سيتم تصنيف إطارات الإرساء تلقائيا من أعلى إلى أدنى طاقة ربط.
  6. قم باستيراد ملفات الإرساء إلى PILP (https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index منشئ ملفات تعريف تفاعل البروتين واليجند) للحصول على نموذج النظام المرئي. قم بتنزيل ملفات النموذج بتنسيق pse ، وقم باستيرادها إلى برنامج PyMOL (انظر جدول المواد) لإنشاء مزيد من التصور.

5. التحليل الإحصائي

ملاحظة: استخدم برنامج SPSS الإحصائي (انظر جدول المواد) لتحليل البيانات. ضع في اعتبارك قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

  1. التعبير عن القيم كوسائل ± الانحراف المعياري (SD).
  2. قم بإجراء ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا بالفرق الأقل أهمية (LSD) أو Dunnett (في حالة التباين المتساوي) أو Dunnett's T3 (في حالة التباين غير المتكافئ) لاختبار الدلالة الإحصائية بين المجموعات.

النتائج

علم الأدوية الشبكي
تم فحص ما مجموعه 18 مكونا محتملا في FP وفقا لخصائصها الدوائية والديناميكية الدوائية من قاعدة البيانات وتحليل LC-MS (يتم عرض إجمالي الكروماتوجرام الأيوني في الشكل التكميلي 1). من خلال الأدبيات ذات الصلة ، يكون محتوى حمض الغال أعلى بكثير من المكونات الأخرى ...

Discussion

في السنوات الأخيرة ، كان معدل الإصابة بفرط شحميات الدم في ازدياد ، ويرجع ذلك أساسا إلى عادات الأكل غير الصحية على المدى الطويل. الطب الصيني التقليدي ومكوناته الكيميائية لها أنشطة دوائية مختلفة ، والتي تمت دراستها على نطاق واسع في السنوات الأخيرة37,38. FP هو نو?...

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل فريق تطوير المنتجات والابتكار في TCM Health Conservation and Rehabilitation (2022C005) والبحث حول تكامل الأعمال الجديدة عبر الحدود ل "الحفاظ على الصحة وإعادة التأهيل +".

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
101-3B OvenLuyue Instrument and Equipment Factory\
80312/80302 Glass SlideJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
80340-1630 Cover SlipJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm)Thermo Fisher Scientific\
AcetonitrileFisher ChemicalA998Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)Thermo Fisher Scientific\
AethanolFisher ChemicalA995Version 3.0
Ammonia SolutionChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1336-21-6Version 3.9.1
AutoDockToolsScripps Institution of Oceanography\
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection SystemShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.\
Compound DiscovererThermo Fisher Scientific\
CytoscapeCytoscape Consortium\
DM500 Optical MicroscopeLeica\
DV215CD Electronic BalanceOhaus Corporation ., LtdT15A63
Ethyl AlcoholChengdu Cologne Chemicals Co., LTD64-17-5
Formic AcidFisher ChemicalA118
HDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA112-1-1
Hematoxylin Staining SolutionBiosharpBL700B
High Fat DietENSIWEIER202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE CentrifugeHitachi., Ltd.\
HomogenizerOulaibo Technology Co., Ltd\
Hydrochloric AcidChengdu Cologne Chemicals Co., LTD7647-01-0
Image-forming SystemLIOO\
JB-L5 FreezerWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JB-L5 Tissue EmbedderWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JK-5/6 MicrotomeWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JT-12S HydroextractorWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
KQ3200E Ultrasonic CleanerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd\
LDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA113-1-1
Male C57BL/6 Mice SBF Biotechnology Co., Ltd.\Version 2.3.2
Neutral BalsamShanghai Yiyang Instrument Co., Ltd10021190865934
Pure WaterGuangzhou Watson's Food & Beverage Co., LtdGB19298
PyMOLDeLano Scientific LLC\Version 14.1
RE-3000 Rotary EvaporatorYarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd\
RM2016 Pathological MicrotomeShanghai Leica Instruments Co., Ltd\Version 26.0
SIMCA-PUmetrics AB\
SimvastatinMerck Sharp & Dohme., Ltd14202220051
SPSSInternational Business Machines Corporation\
TC Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA111-1-1
TG Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass SpectrometryThermo Fisher Scientific\
Vortex VibratorBeijing PowerStar Technology Co., Ltd.LC-Vortex-P1
XyleneChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1330-20-7

References

  1. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
  2. Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
  3. Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
  4. Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
  5. Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360 (2022).
  6. Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
  7. Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
  8. Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628 (2022).
  9. Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122 (2020).
  10. Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791 (2021).
  11. Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
  12. Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
  13. Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
  14. Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
  15. Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848 (2021).
  16. Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587 (2019).
  17. Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920 (2019).
  18. Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
  19. El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
  20. Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
  21. Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
  22. Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665 (2022).
  23. Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839 (2022).
  24. Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871 (2022).
  25. Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318 (2022).
  26. Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273 (2022).
  27. Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
  28. Antony, B., Merina, B., Sheeba, V. AmlamaxTM in the management of dyslipidemia in humans. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 70 (4), 504 (2008).
  29. Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
  30. Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
  31. Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238 (2012).
  32. Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518 (2020).
  33. Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579 (2021).
  34. Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
  35. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287 (2019).
  36. Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  38. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  39. Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572 (2022).
  40. Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved