JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تتمتع الخيول بقدرة استثنائية على ممارسة التمارين الهوائية ، مما يجعل العضلات الهيكلية للخيول نسيجا مهما لكل من دراسة فسيولوجيا تمرين الخيول وكذلك فسيولوجيا الميتوكوندريا في الثدييات. توضح هذه المقالة تقنيات التقييم الشامل لوظيفة الميتوكوندريا في العضلات الهيكلية للخيول.

Abstract

وظيفة الميتوكوندريا - الفسفرة التأكسدية وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية - أمر بالغ الأهمية في كل من الصحة والمرض. وبالتالي ، فإن قياس وظيفة الميتوكوندريا أمر أساسي في البحوث الطبية الحيوية. تعد العضلات الهيكلية مصدرا قويا للميتوكوندريا ، خاصة في الحيوانات ذات القدرة الهوائية العالية جدا ، مثل الخيول ، مما يجعلها موضوعات مثالية لدراسة فسيولوجيا الميتوكوندريا. توضح هذه المقالة استخدام قياس التنفس عالي الدقة مع القياس الفلوري المتزامن ، مع الميتوكوندريا العضلية الهيكلية التي تم حصادها حديثا ، لتحديد القدرة على أكسدة الركائز تحت حالات الميتوكوندريا المختلفة وتحديد القدرات النسبية للعناصر المميزة لتنفس الميتوكوندريا. يستخدم ميثيل ميثيل إستر رباعي ميثيل رودامين لإثبات إنتاج إمكانات غشاء الميتوكوندريا الناتجة عن أكسدة الركيزة ، بما في ذلك حساب الكفاءة النسبية للميتوكوندريا عن طريق حساب جهد الغشاء النسبي المتولد لكل وحدة من تدفق الأكسجين المتزامن. ينتج عن تحويل جزيء ADP إلى جزيء ATP تغير في تركيز المغنيسيوم في غرفة التفاعل، بسبب اختلاف تقارب الأدينيل للمغنيسيوم. لذلك ، يمكن استخدام المغنيسيوم الأخضر لقياس معدل تخليق ATP ، مما يسمح بمزيد من الحساب لكفاءة الفسفرة التأكسدية (نسبة الفسفرة إلى الأكسدة [P / O]). أخيرا ، يسمح استخدام Amplex UltraRed ، الذي ينتج منتجا فلوريا (resorufin) عند دمجه مع بيروكسيد الهيدروجين ، بالقياس الكمي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية أثناء تنفس الميتوكوندريا ، وكذلك العلاقة بين إنتاج ROS والتنفس المتزامن. تسمح هذه التقنيات بالقياس الكمي القوي لفسيولوجيا الميتوكوندريا في ظل مجموعة متنوعة من ظروف المحاكاة المختلفة ، وبالتالي إلقاء الضوء على مساهمة هذا المكون الخلوي الحاسم في كل من الصحة والمرض.

Introduction

تنتج الميتوكوندريا في الخلايا حقيقية النواة غالبية ATP الذي تستخدمه الخلايا للعمل والصيانة1. تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية في إنتاج الميتوكوندريا ل ATP في تحويل الأكسجين إلى ماء ، وبالتالي يتم تحديد القدرة الأيضية للميتوكوندريا والخلايا المرتبطة بها بشكل متكرر من خلال قياس استهلاك الأكسجين2. ومع ذلك ، فإن فسيولوجيا الميتوكوندريا أكثر تعقيدا من العملية البسيطة لاستهلاك الأكسجين ، والاعتماد على نقطة النهاية هذه يوفر حصريا تقييما غير مكتمل لتأثير وظيفة الميتوكوندريا والخلل الوظيفي على الصحة الخلوية. يتطلب التوصيف الكامل لوظيفة الميتوكوندريا تقييم ليس فقط استهلاك الأكسجين ، ولكن أيضا إنتاج ATP وكذلك أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS).

يمكن تحقيق مقاييس إضافية لوظائف الميتوكوندريا الرئيسية بالتزامن مع قياس التنفس من خلال استخدام فلوروفورات محددة. رباعي ميثيل رودامين ميثيل إستر (TMRM) هو فلوروفور كاتيوني يتراكم في مصفوفة الميتوكوندريا بما يتناسب مع جهد الميتوكوندريا عبر الغشاء ، مما يؤدي إلى انخفاض في شدة الفلورسنت بسبب هذا التراكم3. يمكن استخدام TMRM كمؤشر للتغيرات النسبية في إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، أو يمكن استخدامه لتحديد التغيرات الدقيقة في الجهد عبر الغشاء مع تجارب إضافية لتحديد الثوابت التي تسمح بتحويل إشارة الفلورسنت إلى mV. المغنيسيوم الأخضر (MgG) هو فلوروفور يتألق عند ربطه ب Mg2+ ، ويستخدم لقياسات تخليق ATP بناء على التقارب التفاضلي ل ADP و ATP لكاتيون المغنيسيوم ثنائي التكافؤ4. يجب على الباحثين تحديد ثوابت التقارب / التفكك المحددة (Kd) لكل من ADP و ATP في ظل ظروف تحليلية محددة لتحويل التغيرات في مضان MgG إلى تغيير في تركيز ATP. Amplex UltraRed (AmR) هو الفلوروفور المستخدم لقياس إنتاج بيروكسيد الهيدروجين وأنواع الأكسجين التفاعلية الأخرى أثناء تنفس الميتوكوندريا5. ينتج التفاعل بين H 2O2 و AmR (الذي يتم تحفيزه بواسطة بيروكسيديز الفجل) ريزوروفين ، والذي يمكن اكتشافه من خلال التألق عند 530 نانومتر. يمكن إضافة كل من هذه المقايسات بشكل فردي إلى فحوصات التنفس الميتوكوندريا في الوقت الفعلي ، لتوفير قياسات متزامنة للجوانب المعنية من فسيولوجيا الميتوكوندريا ، وبالتالي توفير صلة مباشرة بين التنفس وإخراج الميتوكوندريا.

الخيول قادرة على معدلات عالية جدا من استهلاك الأكسجين الخاص بالكتلة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى المحتوى العالي جدا من الميتوكوندريا في عضلات الهيكل العظمي للخيول ، مما يجعل هذا النسيج وثيق الصلة بدراسة فسيولوجيا الميتوكوندريا. مع تطور قياس التنفس عالي الدقة ، ساعدت الدراسات التي تستخدم هذه التقنية الجديدة في تحديد مساهمات الميتوكوندريا العضلية الهيكلية للخيول في كل من قدرة التمرين الرائعة للخيول والفيزيولوجيا المرضية لأمراض العضلات الهيكلية6،7،8،9،10،11،12،13،14. تعتبر الدراسات المتعلقة بوظيفة الميتوكوندريا في عضلات الهيكل العظمي للخيول مفيدة بشكل خاص ، حيث أن الحصول على كميات كبيرة من هذا النسيج غير نهائي. وبالتالي ، لا يمكن لموضوعات الخيول توفير أنسجة كافية للتوصيف الكامل لوظيفة الميتوكوندريا فحسب ، بل تعمل أيضا كضوابط طولية للدراسات الميكانيكية عالية الجودة في فسيولوجيا الميتوكوندريا. لهذا السبب ، تم تطوير فحوصات إضافية لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وتوليف ATP ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية التي تكمل قياس استهلاك الأكسجين في هذا النسيج ، من أجل توفير توصيف أكثر قوة لفسيولوجيا الميتوكوندريا في عضلات الهيكل العظمي للخيول.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ولاية أوكلاهوما. تم استخدام أربعة مخصيات أصيلة (17.5 ± 1.3 سنة ، 593 ± 45 كجم) في هذه الدراسة لتوليد النتائج التمثيلية.

1. الحصول على عينة خزعة العضلات والهيكل العظمي

  1. احصل على خزعات العضلات الهيكلية (اتبع تقنية معقمة) من مركز العضلة نصف الوترية (أو أي عضلة أخرى ذات أهمية) ، باستخدام إبرة خزعة 12 G في مستشفى الكلية الجامعية (UCH) (انظر جدول المواد) أثناء التخدير الخفيف ، واستخدام التخدير الموضعي بعد تقرير نشر مسبقا11.
  2. انقل عينات الخزعة على الفور إلى قوارير باستخدام محلول وسائط نقل الخزعة الباردة (2.77 mM CaK 2-EGTA ، 7.23 mMK 2-EGTA ، 20 mM إيميدازول ، 20 mM توراين ، 50 mM K-MES ، 0.5 mM dithiothreitol ، 6.56 mM MgCl2 ، 5.77 mM ATP ، و 15 mM phosphocreatine ، معدلة إلى الرقم الهيدروجيني 7.1 ؛ انظر جدول المواد). النقل إلى المختبر للتحليل.
    ملاحظة: ارجع إلى Doerrier et al.15 للحصول على تعليمات محددة حول تحضير وسائط نقل الخزعة.
  3. اعزل الميتوكوندريا من عينات الخزعة باستخدام مجموعة تجارية ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). يجب ألا يحتوي المخزن المؤقت النهائي على ركائز مثل ADP و ATP والسكسينات ، والتي تعد جزءا من اختبار قياس التنفس.
  4. أعد تعليق الحبيبات النهائية للميتوكوندريا المعزولة باستخدام 80 ميكرولتر من وسائط التعليق (225 مللي مول مانيتول ، 75 مللي مول سكروز ، و 1 مللي مول EGTA ؛ انظر جدول المواد) لكل 100 ملغ من العضلات المستخدمة لعزل الميتوكوندريا.
  5. قلل الفاصل الزمني من وقت إجراء الخزعة إلى عزل الميتوكوندريا ، واحتفظ بالعينات عند 0-4 درجة مئوية طوال خطوات المعالجة حتى تضاف إلى مقاييس التنفس عالية الدقة.
    ملاحظة: وجدت الدراسات الأولية أن معلقات الميتوكوندريا المعزولة تبدأ في فقدان القدرة الوظيفية بعد حوالي 2 ساعة عند الحفاظ عليها عند 0-4 درجة مئوية.

2. إعداد مقياس التنفس عالي الدقة

  1. تستخدم أجهزة قياس التنفس عالية الدقة لقياس تنفس الميتوكوندريا والعمليات المرتبطة به. استخدم برنامج التحكم الذي توفره الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) للتحكم في مقياس التنفس ومعايرة المستشعرات وجمع البيانات الأولية. تحليل العينات في نسختين لكل حالة اختبار.
    ملاحظة: في جميع الحالات، تستند المعايرة بالتحليل الحجمي الموصى بها وتركيزات الكاشف النهائية الموصوفة في هذا البروتوكول إلى غرفة قياس التنفس سعة 2 مل.
  2. حدد تدفق الخلفية O 2 ونقطة الصفر لمستشعر O 2 كل2-4 أسابيع من خلال المعايرة التسلسلية للديثيونايت ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. احتفظ بثوابت المعايرة هذه للمقايسات اللاحقة حتى يتم تكرار المعايرة.
    ملاحظة: على عكس الإجراءات المنشورة سابقا باستخدام ألياف العضلات المتداخلة11،12،13،16 ، حيث يكون فرط التأكسج (250-500 ميكرومتر) ضروريا لتجنب تقييد انتشار O 2 إلى الميتوكوندريا ، يمكن تقييم الميتوكوندريا المعزولة باستخدام نطاق 50-200 ميكرومتر O2. يمكن تحقيق ذلك ببساطة عن طريق السماح لوسائط التنفس بالتوازن مع هواء الغرفة قبل إضافة تعليق الميتوكوندريا (أي بعد المعايرة اليومية أحادية النقطة). وبالمثل، يمكن تحقيق إعادة أكسجة غرفة التنفس بمجرد فتح الحجرة حتى يذوب الأكسجين المحيط الكافي في وسط قياس التنفس لرفع تركيز الأكسجين إلى المستوى المطلوب.
  3. املأ غرف مقياس التنفس بوسائط خالية من المغنيسيوم (0.5 مللي مول EGTA ، 60 مللي مول K-lactobionate ، 20 mM توراين ، 10 mM KH2PO4 ، 20 mM HEPES ، 110 mM سكروز ، و 1 جم / لتر من ألبومين مصل الأبقار [BSA] خال من الأحماض الدهنية بشكل أساسي ، معدل إلى درجة الحموضة 7.1 ؛ انظر جدول المواد).
    ملاحظة: ارجع إلى Komlodi et al.17 للحصول على تعليمات محددة حول تحضير وسائط التنفس.
    1. اضبط درجة حرارة حضانة الجهاز على 38 درجة مئوية لتمثيل درجة الحرارة القاعدية لعضلة الهيكل العظمي للخيول ، واضبط خلط وسائط التنفس على 800 دورة في الدقيقة باستخدام محرك مغناطيسي يدور في الجزء السفلي من غرفة مقياس التنفس.
    2. قم بإيقاف تشغيل إضاءة الغرفة لتجنب التداخل مع مستشعرات الفلورسنت.
    3. قم بتنشيط قطب الأكسجين بجهد استقطاب 800 مللي فولت ، وقم بتضخيم الإشارة الناتجة بإعداد كسب 1.
    4. سجل تركيز الأكسجين كل 2 ثانية ، واحسب تدفق الأكسجين باعتباره المنحدر السلبي لقياس الأكسجين خلال ال 40 ثانية السابقة (20 نقطة بيانات) ، وأبلغ عن pmol x s-1 x mL من محلول الحضانة.
  4. قم بمعايرة مستشعر الأكسجين عن طريق السماح للوسائط بالتوازن مع هواء الغرفة. احسب الضغط الجزئي المرجعي للأكسجين، استنادا إلى الضغط الجوي المقاس بواسطة مقياس التنفس عالي الدقة وتركيز الأكسجين القياسي في الغلاف الجوي.

3. قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا باستخدام TMRM

  1. استخدم مستشعرات الفلورسنت "الخضراء" (الطول الموجي السائد 530 نانومتر) لتحديد إشارة الفلورسنت من غرفة التنفس. تنشيط أجهزة الاستشعار عند 400-500 مللي فولت ؛ يتم تضخيم الإشارة الناتجة بكسب 1: 1,000.
    ملاحظة: يجب تحسين الإعدادات المحددة للأجهزة الفردية لالتقاط الإشارة المتوقعة ضمن النطاق الخطي للمستشعر.
  2. أضف TMRM (4 ميكرولتر من محلول 1 mM لتركيز نهائي قدره 2 μM ؛ انظر جدول المواد) قبل إضافة الميتوكوندريا.
  3. قم بمعايرة إشارة الفلورسنت باستخدام معايرة بسيطة من نقطتين لإشارة الفلورسنت (الجهد) مقابل كمية الفلوروفور المضافة (mM) ، قبل إضافة الميتوكوندريا.
    ملاحظة: استخدم وظيفة معايرة إشارة الفلورسنت في برنامج التحكم في الماكينة لمعايرة هذه الإشارة. يمكن أن تتطلب الإشارة الخام من مسبار الفلورسنت 30 دقيقة أو أكثر لتحقيق الاستقرار من أجل تسجيل النقطة الثانية من المعايرة.
  4. إجراء المعايرة النهائية لإشارة TMRM بعد الانتهاء من بروتوكول معايرة قياس التنفس عن طريق إجراء عدة معايرات لعامل الفصل (سيانيد الكربونيل m-chlorophenyl hydrazone ؛ 2 ميكرولتر لكل معايرة) حتى لا تلاحظ أي زيادات أخرى في إشارة الفلورسنت TMRM ، مما يشير إلى الانهيار الكامل لإمكانات غشاء الميتوكوندريا (الشكل 1).
    ملاحظة: تعتبر قيمة إشارة الفلورسنت هذه مساوية لجهد الغشاء 0 mV ، وتستخدم كنقطة مرجعية لقيم جهد الغشاء النسبية المسجلة أثناء بروتوكول معايرة التنفس.

4. قياس إنتاج ATP باستخدام المغنيسيوم الأخضر (MgG)

  1. استخدم مستشعرات الفلورسنت "الزرقاء" (الطول الموجي السائد 465 نانومتر) لتحديد إشارة الفلورسنت من غرفة التنفس. قم بتنشيط هذه المستشعرات للأجهزة الفردية لالتقاط الإشارة المتوقعة ضمن النطاق الخطي للمستشعر.
  2. قم بإجراء الإعداد الكيميائي ومعايرة إشارة الفلورسنت MgG بعد إضافة الميتوكوندريا ، ولكن قبل إضافة أي ركائز. أضف 8 ميكرولتر من 2 mM حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) إلى غرفة قياس التنفس لتخليب الكاتيونات (خاصة Ca 2+) التي من شأنها أن تتنافس مع Mg2+ للارتباط ب MgG ، ثم أضف 4 ميكرولتر من 1 mM MgG (1.1 μM) إلى غرفة التنفس.
  3. قم بمعايرة إشارة التألق الخام بمعايرة متسلسلة 10 × 2 ميكرولتر تبلغ 100 mM MgCl 2 ، مما يسمح بدقيقة واحدة بين عمليات المعايرة لتثبيت إشارة الفلورسنت (الشكل 2).
    ملاحظة: هذه العملية ، التي تكتمل دون اتصال بالإنترنت بعد الانتهاء من الفحص وباستخدام القوالب التي توفرها الشركة المصنعة للجهاز والبرامج المرتبطة به ، تنتج منحنى من الدرجة الثانية لتركيز المغنيسيوم إلى إشارة الفلورسنت (المتوقع r2 > 0.98) ، والذي سيتم استخدامه مع كمية معروفة من ADP المضافة إلى غرفة قياس التنفس وقيم Kd المحددة مسبقا لتحديد التركيز المقابل ل ATP11.
  4. أوجد معدل تخليق الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP)، وهو ميل تركيز جزيء ATP بمرور الزمن في جميع أنحاء البروتوكول (الشكل 3).

5. قياس إنتاج الميتوكوندريا من أنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام Amplex UltraRed (AmR)

  1. استخدم مستشعرات الفلورسنت "الخضراء" (الطول الموجي السائد 530 نانومتر) لتحديد إشارة الفلورسنت من غرفة التنفس. تنشيط المستشعرات عند 300-400 مللي فولت ؛ يتم تضخيم الإشارة الناتجة بكسب 1: 1,000. قم بتحسين الإعدادات المحددة للأجهزة الفردية لالتقاط الإشارة المتوقعة ضمن النطاق الخطي للمستشعر.
    ملاحظة: في حالة استخدام وسائط التنفس بدون MgCl 2 ، فيجب إضافة ذلك (20-60 ميكرولتر من 100 mM MgCl 2 لإنتاج 1-3 ميكرومتر MgCl2) قبل إضافة الكواشف لمقايسة AmR.
  2. قم بإجراء الإعداد الكيميائي والمعايرة الأولية لمقايسة AmR قبل إضافة الميتوكوندريا. أضف 30 ميكرومول من DTPA (6 ميكرولتر من محلول 5 mM) إلى الكاتيونات المخلبية التي قد تتداخل مع التفاعل ، ثم أضف ديسموتاز الفائق الأكسيد (2 ميكرولتر من محلول مخزون 5000 وحدة / مل لتحويل أنيونات الأكسيد الفائق إلى H 2 O2للكشف الأكثر شمولا عن توليد الأكسجين التفاعلي) ، بيروكسيديز الفجل (5 ميكرولتر من محلول مخزون 500 وحدة / مل) ، و Amplex UltraRed (2 ميكرولتر من محلول مخزون 10 مللي مول) (انظر جدول المواد) لإنتاج 5 وحدة / مل ، 1 وحدة / مل ، و 10 ميكرومتر في غرفة قياس التنفس ، على التوالي.
  3. اسمح لإشارة الفلورسنت بالاستقرار ، ثم أضف 0.2 ميكرومول من بيروكسيد الهيدروجين (5 ميكرولتر من محلول 40 ميكرومتر طازج يوميا) مرتين ، بفارق 5 دقائق تقريبا.
    ملاحظة: توفر إشارة الفلورسنت قبل وبعد معايرتي H 2 O 2 منحنى معايرة خطي ثلاثي النقاط للنظام (متوقع r 2 > 0.95) ، يعكس ميله الاستجابة الكلية للنظام في الإبلاغ عن العلاقة بين إشارة الفلورسنت وإنتاج (أو إضافة) H 2 O 2. استخدم وظيفة معايرة إشارة الفلورسنت في برنامج التحكم في الماكينة لمعايرة هذه الإشارة.
  4. قم بإجراء معايرة إضافية من نقطتين (5 ميكرولتر من محلول 40 ميكرومتر طازج يوميا) طوال فترة الفحص ، للسماح بتعديل استجابة الفحص مع تغير كيمياء قياس التنفس طوال فترة الفحص ، مع التوقيت المحدد لنقاط المعايرة هذه وفقا لتقدير الباحث (الشكل 4).

6. قياس التنفس الميتوكوندريا

  1. أضف 15 ميكرولتر من معلق الميتوكوندريا المعزول (الخطوة 1.4) إلى كل غرفة حضانة سعة 2 مل ، بحيث تمثل النتائج عائد الميتوكوندريا البالغ 18.75 مجم من العضلات. ختم غرفة الحضانة. دوامة العينة بين كل معايرة بالتحليل الحجمي للحفاظ على تعليق موحد للعينة.
  2. قم بقياس استهلاك الأكسجين المتبقي (ROX) قبل إضافة أي ركائز. اطرح هذه القيمة (عادة أقل من 0.2 pmol O2 x s-1 x mL-1) من قيم استهلاك الأكسجين لكل خطوة في بروتوكول معايرة الركيزة / فك التوصيل / المانع (SUIT)11 بعد الانتهاء من البروتوكول.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان أن يسمح للإشارات الصادرة من كل من مستشعر الأكسجين ومستشعر التألق بالاستقرار لمدة 1 دقيقة على الأقل (كما تم تقييمها بواسطة المنحدر المحسوب المستقر لإشارات المستشعر الأولية) ، حيث يتم تغيير الحالة العامة للتنفس بواسطة المعايرات من أجل الحصول على نتائج موثوقة. ينطبق هذا على جميع خطوات المعايرة.
  3. استخدم بدلة للأغراض العامة تسمح بالتوصيف الأولي لوظيفة الميتوكوندريا في عضلات الهيكل العظمي للخيول. ابدأ بمعايرة متسلسلة من البيروفات (5 ميكرولتر من محلول مائي 2 M) ، والغلوتامات (10 ميكرولتر من محلول مائي 2 M) ، ومالات (10 ميكرولتر من محلول مائي 0.4 M) (انظر جدول المواد) في كل غرفة لإنتاج نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) وتحفيز التنفس غير الفسفري (التسرب) المدعوم ب NADH المؤكسد من خلال المركب I (LN) (الشكل 1 ، الشكل 3 والشكل 4).
  4. أضف ADP (20 ميكرولتر من محلول مائي 500 mM ؛ انظر جدول المواد) لتحفيز التنفس الفسفرة من خلال المركب I (PN).
  5. أضف السكسينات (20 ميكرولتر من محلول مائي 1 M ؛ انظر جدول المواد) لإنتاج التنفس الفسفري من خلال الجمع بين المركب I والمركب II (PN + S).
    ملاحظة: مع الجمع بين التنفس من خلال كل من المركب الأول والمركب الثاني ، قد يكون استهلاك الأكسجين مرتفعا بما يكفي لاستهلاك معظم الأكسجين المذاب في وسط الحضانة. إذا انخفض تركيز O 2 إلى أقل من 50 ميكرومتر ، فقم بإعادة أكسجة وسائط الحضانة عن طريق فتح غرفة الحضانة حتى يزيد تركيز O2 المقاس فوق 150 ميكرومتر. كرر هذه الخطوة حسب الضرورة للحفاظ على O2 كافية لتنفس الميتوكوندريا.
  6. أضف روتينون (2 ميكرولتر من محلول الإيثانول 0.1 مللي متر ؛ انظر جدول المواد) لمنع المركب الأول. يمثل تدفق الأكسجين الناتج قدرة المجمع الثاني على دعم استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا عن طريق أكسدة السكسينات وحدها (PS).
    تنبيه: روتينون مادة سامة. استخدم سلامة المختبر القياسية وتجنب الابتلاع أو الاستنشاق.
  7. احسب القيمة المتوسطة لحالة تجريبية معينة عبر غرف قياس التنفس الفردية التي تحتوي على حصص خزعة واحدة.
    ملاحظة: تعتبر الحسابات المشتقة ، مثل نسب التحكم في التدفق (FCRs) ، ذات قيمة في تحديد التغيرات النسبية في المسارات المختلفة ، وتشملتسرب FCR (L N / P N) و FCR N (P N / P N + S) و FCR S (P S / P N + S). توفر كفاءة الفسفرة التأكسدية المحسوبة (1-LN / PN + S) تقديرا للتأثير الكلي للتنفس المتسرب المعدل لإجمالي سعة التنفس.

النتائج

الحالة المرجعية المقترحة هي حالة أصيلة مستقرة صحية (لا توجد لياقة متزايدة بسبب التمرين الإلزامي) وعينة عضلية جديدة تم جمعها من مركز عضلة وضعية ، تحتوي على نسبة عالية من ألياف العضلات الهيكلية من النوع الأول الغنية بالميتوكوندريا وحضنها في ظل ظروف تقترب من التمثيل الغذائي أثناء الراحة (أي ...

Discussion

توفر إضافة إشارات الفلورسنت إلى الإخراج القياسي لمقياس التنفس عالي الدقة معلومات قيمة فيما يتعلق بفسيولوجيا الميتوكوندريا ، ولكن المعايرة الدقيقة لإشارة الفلورسنت أمر بالغ الأهمية لبيانات الجودة. تشير البروتوكولات الأصلية لاستخدام MgG إلى أن منحنيات المعايرة المتولدة أثناء حساب ثوابت ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يتعلق بهذه المخطوطة.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم للدعم السخي من كرسي جون وديبي أوكسلي الممنوح للطب الرياضي للخيول ومؤسسة أبحاث نادي غرايسون جوكي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ADPSigma-Aldrich (MilliporeSigma)A5285
Amplex UltraRedLife TechnologiesA36006
ATPSigma-Aldrich (MilliporeSigma)A2383
BSASigma-Aldrich (MilliporeSigma)A6003
Calcium carbonateSigma-Aldrich (MilliporeSigma)C4830
CCCPSigma-Aldrich (MilliporeSigma)C2759
DatLab 7.0Oroboros IncSoftware to operate O2K fluororespirometer
DithiothreitolSigma-Aldrich (MilliporeSigma)D0632
DTPASigma-Aldrich (MilliporeSigma)D1133
EGTASigma-Aldrich (MilliporeSigma)E4378
GlutamateSigma-Aldrich (MilliporeSigma)G1626
HEPESSigma-Aldrich (MilliporeSigma)H7523
Horseradish peroxidaseSigma-Aldrich (MilliporeSigma)P8250
Hydrogen peroxideSigma-Aldrich (MilliporeSigma)516813Must be made fresh daily prior to assay
ImidazoleSigma-Aldrich (MilliporeSigma)I2399
K-MESSigma-Aldrich (MilliporeSigma)M8250
Magnesium chloride hexahydrateSigma-Aldrich (MilliporeSigma)M9272
Magnesium GreenThermo Fisher ScientificM3733
MalateSigma-Aldrich (MilliporeSigma)M1000
MannitolSigma-Aldrich (MilliporeSigma)M9647
Mitochondrial isolation kitSigma-Aldrich (MilliporeSigma)MITOISO1
O2K fluororespirometerOroboros IncMultiple units required to run full spectrum of assays concurrently.
PhosphocreatineSigma-Aldrich (MilliporeSigma)P7936
Potassium hydroxideSigma-Aldrich (MilliporeSigma)P1767
Potassium lactobionateSigma-Aldrich (MilliporeSigma)L2398
Potassium phosphateSigma-Aldrich (MilliporeSigma)P0662
PyruvateSigma-Aldrich (MilliporeSigma)P2256Must be made fresh daily prior to assay
RotenoneSigma-Aldrich (MilliporeSigma)R8875
SuccinateSigma-Aldrich (MilliporeSigma)S2378
SucroseSigma-Aldrich (MilliporeSigma)84097
Superoxide dismutaseSigma-Aldrich (MilliporeSigma)S8160
TaurineSigma-Aldrich (MilliporeSigma)T0625
Titration pumpOroboros Inc
Titration syringesOroboros Inc
TMRMSigma-Aldrich (MilliporeSigma)T5428
UCH biopsy needleMillenium Surgical Corp72-238067Available in a range of sizes

References

  1. Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
  2. Gnaiger, E. . Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , (2014).
  3. Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes. Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).
  4. Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption. Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).
  5. Krumschnabel, G., et al. Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).
  6. Lemieux, H., et al. Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy. Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).
  7. Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis. Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).
  8. Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle. PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).
  9. Votion, D. M., et al. Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing. Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).
  10. Tosi, I., et al. Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).
  11. Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption. Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).
  12. Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1. Journal of Animal Science. , (2019).
  13. White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes. Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).
  14. White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes. Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).
  15. Doerrier, C., et al. High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
  16. Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses. Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).
  17. Komlodi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
  18. Gnaiger, E. Mitochondrial physiology. Bioenergetic Communications. , (2020).
  19. Li Puma, L. C., et al. Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved