تحضير كامل قائم على الميثانول لفحص خلايا العقدة الشبكية

Summary

يمكن استخدام الميثانول كوسيط ثابت مساعد لمستحضرات الشبكية الكاملة والتخزين طويل الأجل ، وهو أمر مفيد لفحص خلايا العقدة الشبكية.

Abstract

تنشر خلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، وهي الخلايا العصبية الإسقاطية للشبكية ، المعلومات البصرية الخارجية إلى الدماغ. التغيرات المرضية في RGCs لها علاقة وثيقة مع العديد من الأمراض التنكسية في شبكية العين. كثيرا ما يستخدم التلطيخ المناعي الكامل للشبكية في الدراسات التجريبية على RGCs لتقييم الظروف التنموية والمرضية للشبكية. في ظل بعض الظروف ، قد تحتاج بعض عينات شبكية العين القيمة ، مثل تلك المأخوذة من الفئران المعدلة وراثيا ، إلى الاحتفاظ بها لفترة طويلة دون التأثير على مورفولوجيا أو عدد RGCs. للحصول على نتائج تجريبية موثوقة وقابلة للتكرار ، يعد استخدام وسيط حفظ فعال أمرا ضروريا. هنا ، نصف تأثير الميثانول كوسيط ثابت مساعد لمستحضرات شبكية العين الكاملة والتخزين طويل الأجل. باختصار ، أثناء عملية العزل ، يتم سحب الميثانول البارد (-20 درجة مئوية) على سطح الشبكية للمساعدة في إصلاح الأنسجة وتسهيل نفاذيتها ، ومن ثم يمكن تخزين شبكية العين في الميثانول البارد (-20 درجة مئوية) قبل أن تكون مناعية. يصف هذا البروتوكول سير عمل عزل الشبكية وبروتوكول تخزين عينات الأنسجة ، وهو أمر مفيد وعملي للتحقيق في RGCs.

Introduction

خلايا العقدة الشبكية (RGCs) هي الخلايا العصبية الإسقاطية الوحيدة في شبكية العين ، وهي تدمج وتنقل المعلومات المرئية الخارجية إلى الدماغ¹. تتميز العديد من الأمراض التنكسية العصبية مثل الجلوكوما والاعتلال العصبي البصري الرضحي بأضرار لا رجعة فيها وفقدان RGCs ^2,3. يعد تحليل التغيرات المورفولوجية والكمية ل RGCs خطوة حاسمة في تحديد كيفية تطور الأمراض التنكسية العصبية وتقدمها ^4,5.

مقايسة التألق المناعي غير المباشر هي طريقة مقبولة على نطاق واسع لمراقبة توزيع البروتينات وعدد الخلايا. في المختبر ، يشيع استخدام ا....

Protocol

يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك. تم الحصول على جميع الفئران C57BL / 6J المستخدمة من مركز المختبر بجامعة ووهان ، وتمت الموافقة على جميع التجارب ذات الصلة من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات بجامعة ووهان. بذلت كل الجهود لتقليل معاناة الفئران.

1. استئصال وتثبيت العينين

1. القتل الرحيم للفئران بالاختناق بثاني أكسيد الكربون ، واستئصال مقلة العين بلطف باستخدام ملاقط بلا أسنان.
2. شطف مقلة العين مرة واحدة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
3. ثقب مقلة العين بإبرة حقنة في القرنية تحت المجهر (العدسة WF: 10x / 22 ؛ هدف التكبير المستمر: 0.67x-4.5x) لتسريع التثبيت في مقلة الع....

النتائج

بعد التشريح ، يجب أن تبدو شبكية العين مثل البرسيم المسطح المكون من أربع أوراق. في هذه الدراسة ، باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه ، تحولت شبكية العين إلى اللون الأبيض بعد إضافة الميثانول (الشكل 1). وفي الوقت نفسه ، تغيرت شبكية العين من لينة إلى مرنة ومسطحة. بعد ذلك ، تم تصنيف RG.......

Discussion

التثبيت هو خطوة أساسية للحفاظ على شبكية العين ، والتي يمكن أن تؤثر على أي تحقيقات RGC لاحقة بناء على التشكل. يلتقط التثبيت الناجح بسرعة بنية وحالة شبكية العين في لحظة تعريضها لوسط التثبيت ، وهو أمر بالغ الأهمية لمزيد من التحليل. على الرغم من أن الفورمالديهايد يعتبر أحد أكثر عوامل التثبيت شي?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture cluster	Costar		Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate	Labedit Company		Incubation antibody
Adhesion microscope slides	Citotest		Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant	Servicebio	G1401	Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin)	Servicebio	GC305010	Blocking reagent
Confocal microscope	OLYMPUS		Apply 40x objective lens
Curved scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Dissecting microscope	RWD Life science Co.,LTD	77001S	Dissecting tools
Forceps	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20210624	GC≥99.5%
Nail polish	SecheVite		Sealing agent
Needles	Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.		Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution	Servicebio	G1101	Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Servicebio	G0002	Rinse the eyeball
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)	PhosphoSolutions	Cat. #1832-RBPMS	For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-165-148	For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools