A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يمكن استخدام الميثانول كوسيط ثابت مساعد لمستحضرات الشبكية الكاملة والتخزين طويل الأجل ، وهو أمر مفيد لفحص خلايا العقدة الشبكية.
تنشر خلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، وهي الخلايا العصبية الإسقاطية للشبكية ، المعلومات البصرية الخارجية إلى الدماغ. التغيرات المرضية في RGCs لها علاقة وثيقة مع العديد من الأمراض التنكسية في شبكية العين. كثيرا ما يستخدم التلطيخ المناعي الكامل للشبكية في الدراسات التجريبية على RGCs لتقييم الظروف التنموية والمرضية للشبكية. في ظل بعض الظروف ، قد تحتاج بعض عينات شبكية العين القيمة ، مثل تلك المأخوذة من الفئران المعدلة وراثيا ، إلى الاحتفاظ بها لفترة طويلة دون التأثير على مورفولوجيا أو عدد RGCs. للحصول على نتائج تجريبية موثوقة وقابلة للتكرار ، يعد استخدام وسيط حفظ فعال أمرا ضروريا. هنا ، نصف تأثير الميثانول كوسيط ثابت مساعد لمستحضرات شبكية العين الكاملة والتخزين طويل الأجل. باختصار ، أثناء عملية العزل ، يتم سحب الميثانول البارد (-20 درجة مئوية) على سطح الشبكية للمساعدة في إصلاح الأنسجة وتسهيل نفاذيتها ، ومن ثم يمكن تخزين شبكية العين في الميثانول البارد (-20 درجة مئوية) قبل أن تكون مناعية. يصف هذا البروتوكول سير عمل عزل الشبكية وبروتوكول تخزين عينات الأنسجة ، وهو أمر مفيد وعملي للتحقيق في RGCs.
خلايا العقدة الشبكية (RGCs) هي الخلايا العصبية الإسقاطية الوحيدة في شبكية العين ، وهي تدمج وتنقل المعلومات المرئية الخارجية إلى الدماغ1. تتميز العديد من الأمراض التنكسية العصبية مثل الجلوكوما والاعتلال العصبي البصري الرضحي بأضرار لا رجعة فيها وفقدان RGCs 2,3. يعد تحليل التغيرات المورفولوجية والكمية ل RGCs خطوة حاسمة في تحديد كيفية تطور الأمراض التنكسية العصبية وتقدمها 4,5.
مقايسة التألق المناعي غير المباشر هي طريقة مقبولة على نطاق واسع لمراقبة توزيع البروتينات وعدد الخلايا. في المختبر ، يشيع استخدام ا....
يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك. تم الحصول على جميع الفئران C57BL / 6J المستخدمة من مركز المختبر بجامعة ووهان ، وتمت الموافقة على جميع التجارب ذات الصلة من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات بجامعة ووهان. بذلت كل الجهود لتقليل معاناة الفئران.
1. استئصال وتثبيت العينين
بعد التشريح ، يجب أن تبدو شبكية العين مثل البرسيم المسطح المكون من أربع أوراق. في هذه الدراسة ، باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه ، تحولت شبكية العين إلى اللون الأبيض بعد إضافة الميثانول (الشكل 1). وفي الوقت نفسه ، تغيرت شبكية العين من لينة إلى مرنة ومسطحة. بعد ذلك ، تم تصنيف RG.......
التثبيت هو خطوة أساسية للحفاظ على شبكية العين ، والتي يمكن أن تؤثر على أي تحقيقات RGC لاحقة بناء على التشكل. يلتقط التثبيت الناجح بسرعة بنية وحالة شبكية العين في لحظة تعريضها لوسط التثبيت ، وهو أمر بالغ الأهمية لمزيد من التحليل. على الرغم من أن الفورمالديهايد يعتبر أحد أكثر عوامل التثبيت شي?.......
لا يعلم المؤلفون بأي انتماءات أو عضويات أو تمويل أو حيازات مالية قد تؤثر على موضوعية هذه الدراسة.
تم تمويل هذا العمل من قبل مشروع افتتاح مختبرات هوبي الرئيسية (المنحة رقم 2021KFY055) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هوبي (منحة رقم 2020CFB240) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (منحة رقم 2042020KF0065).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved