JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول خطوات محاذاة صور التصوير المقطعي للتماسك البصري للضوء المرئي في الجسم الحي (vis-OCTF) مع الصور متحدة البؤر خارج الجسم الحي لشبكية العين نفسها لغرض التحقق من مورفولوجيا الحزمة المحورية لخلية العقدة العقدية المرصودة في الصور في الجسم الحي .

Abstract

في السنوات الأخيرة ، تم تطبيق تصوير الشبكية في الجسم الحي ، والذي يوفر معلومات غير جراحية وفي الوقت الفعلي وطولية حول الأنظمة والعمليات البيولوجية ، بشكل متزايد للحصول على تقييم موضوعي للتلف العصبي في أمراض العيون. غالبا ما يكون التصوير البؤري خارج الجسم الحي لنفس شبكية العين ضروريا للتحقق من صحة النتائج في الجسم الحي خاصة في الأبحاث على. في هذه الدراسة ، أظهرنا طريقة لمحاذاة صورة متحدة البؤر خارج الجسم الحي لشبكية العين مع صورها في الجسم الحي . تم تطبيق تقنية تصوير جديدة جاهزة سريريا تسمى الألياف المقطعية للتماسك البصري للضوء المرئي (vis-OCTF) للحصول على صور في الجسم الحي لشبكية الفأر. ثم أجرينا التصوير متحد البؤر لشبكية العين نفسها مثل "المعيار الذهبي" للتحقق من صحة الصور في الجسم الحي مقابل OCTF. لا تتيح هذه الدراسة مزيدا من التحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية فحسب ، بل تضع أيضا أساسا لتقييم حساس وموضوعي للتلف العصبي في الجسم الحي.

Introduction

تلعب خلايا العقدة الشبكية (RGCs) دورا مهما في معالجة المعلومات المرئية ، حيث تتلقى مدخلات متشابكة من خلال أشجارها المتغصنة في الطبقة الضفيرية الداخلية (IPL) وتنقل المعلومات عبر محاورها في طبقة الألياف العصبية الشبكية (RNFL) إلى الدماغ1،2،3،4. في الحالات المريضة مثل الجلوكوما ، قد يؤدي تنكس RGC المبكر إلى تغييرات طفيفة في RNFL ، وطبقة الخلايا العقدية (GCL) ، و IPL ، والعصب البصري في كل من المرضى ونماذج القوارض5،6،7،8،9. وبالتالي فإن الكشف المبكر عن هذه التغيرات المورفولوجية في RGCs أمر ضروري للتدخل في الوقت المناسب لمنع RGC وفقدان البصر.

لقد طورنا مؤخرا تقنية تصوير جديدة جاهزة سريريا تسمى التصوير المقطعي للتماسك البصري للضوء المرئي (vis-OCT) لتلبية الحاجة إلى المراقبة في الجسم الحي لتلف RGC. قام Vis-OCT بتحسين الدقة المحورية ، حيث وصل إلى 1.3 ميكرومتر في شبكية العين10,11 ، مما يسمح بتصور حزم محور RGC الفردية في RNFL. بعد ذلك ، تم إنشاء الألياف vis-OCT (vis-OCTF) لتتبع وقياس تلف RGC على مستوى حزمة محور عصبي واحد في الفئران11،12،13. ومع ذلك ، غالبا ما يكون التصوير متحد البؤر خارج الجسم الحي لشبكية العين مثل المعيار الذهبي ضروريا للتحقق من صحة النتائج في الجسم الحي. لذلك ، ستوضح هذه الدراسة كيفية محاذاة الصور في الجسم الحي التي تم الحصول عليها بواسطة vis-OCTF مع الصور متحدة البؤر خارج الجسم الحي لشبكية العين لنفس الفأر. يهدف البروتوكول إلى التحقق من صحة النتائج في الجسم الحي عن طريق التصوير خارج الجسم الحي متحد البؤر وإنشاء أساس لفحص التغيرات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء تلف RGC في الحالات المرضية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة فيرجينيا وتتوافق مع المبدأ التوجيهي بشأن استخدام من المعهد الوطني للصحة (NIH). راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. في الجسم الحي مقابل التصوير OCT

  1. نظام OCT
    1. تخيل عيون الفئران باستخدام نظام OCT لحيوان صغير يستخدم مصدر ضوء فائق الاستمرارية ، والذي يوفر إضاءة الضوء المرئي بين 480 نانومتر و 650 نانومتر. تأكد من أن الطاقة الساقطة على القرنية هي 1 ميغاواط واستخدم معدل خط A يبلغ 25 كيلو هرتز وزمن تكامل يبلغ 39.3 ميكروثانية لكل خط A.
    2. تأكد من أن نطاق الكشف الطيفي لمقياس الطيف يتراوح بين 508 نانومتر و 613 نانومتر ، مما يوفر دقة محورية تبلغ 1.3 ميكرومتر في شبكية العين. يبلغ إجمالي حجم التصوير حوالي 700 ميكرومتر (x) × 700 ميكرومتر (y) × 1500 ميكرومتر (z). تتراوح الدقة الجانبية بين 4.5 ميكرومتر في مركز مجال الرؤية و 8.7 ميكرومتر عند 350 ميكرومتر من المركز11,13.
  2. تخدير الفأر
    1. تخدير الفئران من خلفية C57BL / 6 وممارسة الجنس مع حقن داخل الصفاق من الكيتامين (114 ملغم / كغم) وكوكتيل زيلازين (17 ملغ / كغ) وتوسيع حدقة العين باستخدام قطرات تروبيكاميد 1٪. تأكد من التخدير الكافي عن طريق فقدان منعكس الدواسة بعد قرصة إصبع القدم الثابت.
    2. أثناء التصوير ، حافظ على دفء الماوس باستخدام مصباح حرارة الأشعة تحت الحمراء. بعد كل صورة ، ضع الدموع الاصطناعية لمنع جفاف القرنية.
  3. وضع الماوس للتصوير
    1. ضع الماوس المخدر على حامل واحتفظ بالماوس في موضعه بمساعدة شريطين فيلكرو.
      ملاحظة: يسمح حامل بالحركة في ثلاثة أبعاد (الضبط الرأسي ، الضبط الأفقي الدقيق ، بالإضافة إلى تعديلات الميل والانحراف) لوضع الليزر في عين الماوس.
  4. ضبط معلمات التصوير
    1. قم بتشغيل الكمبيوتر وافتح البرنامج المشار إليه ، والذي سيقوم بتشغيل الليزر تلقائيا.
    2. اضبط حامل حتى يستقر الليزر ويتمركز في عين الماوس. تصور الجزء الخلفي من العين من خلال معاينة En Face في واجهة البرنامج ، ومجال الرؤية (FOV) للضفيرة الوعائية السطحية ، و B-scan، المقطع العرضي للشبكية داخل مجال الرؤية.
    3. احصل على وحدة تخزين مقابل OCT بالنقر فوق الزر "اكتساب " على واجهة البرنامج بعد إجراء تعديلات طفيفة على التركيز البصري ، والذي يتكون من 512 خطا A / B-scan و 512 B-scans / volume.
      ملاحظة: تستغرق هذه العملية ~ 10.5 ثانية. يتم توجيه الحصول على الصور بواسطة مقدر مؤشر جودة مدمج (QI) لضمان عدم تضمين الصور التي تقل عن عتبة محددة مسبقا (QI < 45).
      1. لكل ماوس ، احصل على أربعة مجلدات مقابل OCT من نفس العين. قم بمحاذاة رأس العصب البصري (ONH) في كل زاوية من الزوايا الأربع في مجال الرؤية لتغطية مناطق مختلفة من شبكية العين.
        ملاحظة: يقلل هذا التنسيب من انحناء الشبكية ، مما يزيد من انعكاس RNFL في جميع أنحاء مجال الرؤية. يتطلب ~ 1 دقيقة لإعادة وضع العين بين كل عملية اكتساب (الشكل 1 أ ، ب).
  5. تحليل OCTF
    ملاحظة: يستخدم MATLAB لإجراء تحليل الصور.
    1. لتوليد ألياف vis-OCT من حجم vis-OCT ، استخدم طريقة عتبة قائمة على الشدة (خط رمز MATLAB 808) للكشف عن سطح شبكية العين.
      ملاحظة: تستخدم هذه الخطوط وظيفة imadjust لضبط قيم شدة bscan. تحدد الوسيطة [0.0087 0.08] التي تم تمريرها للضبط نطاق الشدة المراد تعيينه إلى النطاق الديناميكي الكامل لصورة المخرجات.
    2. قم بقص RNFL عن طريق تحديد أول ~ 16 ميكرومتر في العمق. انظر سطر كود Matlab 782.
      ملاحظة: سمك RNFL النموذجي في الجسم الحي في ماوس C57BL / 6 من النوع البري البالغ هو ~ 14 ميكرومتر ويمكن أن يختلف بين طرق التجزئة المختلفة13.
    3. قم بتغيير مسارات ملف RAW (السطر 9) وملفات إعادة الإعمار (السطر 11) واسم الملف (السطر 15) وانقر فوق تشغيل وانتظر حتى يتم تحليل صورة OCT بواسطة كود MATLAB. احسب متوسط الإسقاط على طول الاتجاه المحوري (z) (خطوط كود MATLAB 905-908) لإنشاء صورة مخطط الألياف المكونة من حزم محور عصبي RGC والأوعية الدموية المحيطة. قم بمونتاج الصور الأربع بعد معالجة الألياف لكل مجال رؤية عن طريق محاذاة الأوعية الدموية مع محرر رسومات من اختيارك ، يغطي ~ 1.2 × 1.2 مم في المجموع. عادة ما يتم حفظ ملفات RAW في المجلد: Halo Data ، تحت تاريخ تصوير OCT (على سبيل المثال ، 0606 Opticent).
      ملاحظة: رموز MATLAB متوفرة في الملف التكميلي 1.

2. التصوير البؤري خارج الجسم الحي

  1. القتل الرحيم للفأر
    1. بعد الحصول على بيانات OCT ، القتل الرحيم للفئران بمزيج من صوديوم بنتوباربيتال (390 مجم / مل) وصوديوم الفينيتوين (50 مجم / مل). يعمل الصوديوم الفينيتوين عن طريق تضخيم آثار الصوديوم بنتوباربيتال ، والذي تم تطبيقه على نطاق واسع في القتل الرحيم للقوارض14،15. لكل فأر ، استخدم 0.2 مل / 20 جم من الخليط المخفف (156 مجم / مل) وبيرفيوز مع 20 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثم 20 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS16,17.
  2. تشريح العين وتوجيهها
    1. قم باستئصال العينين ووضع علامة على الجانب الزمني للإشارة إلى الاتجاه.
    2. بعد إزالة الغرفة الأمامية بعناية ، عدسة العين ، الجسم الزجاجي ، وإصلاح أكواب العين في PFA لمدة 30 دقيقة.
    3. اغسل أكواب العين باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة ، واستبدل محلول PBS 3x أثناء الغسيل. ثم اغسل باستخدام 0.5٪ Triton X-100 في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.5) لمدة 30 دقيقة.
    4. احتضان أكواب العين في حاجز مانع (5٪ مصل حمار مع 2.5٪ ألبومين مصل بقري و 0.5٪ Triton X-100 في محلول ملحي مخزن تريس [درجة الحموضة 7.5]) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
  3. تلطيخ مناعي
    ملاحظة: أكواب العين جاهزة الآن للتلطيخ بالأجسام المضادة الأولية للفأر المضاد ل Tuj1 للكشف عن حزم محور عصبي RGC والفئران المضادة ICAM-2 للكشف عن الأوعية الدموية.
    1. احتضان أكواب العين طوال الليل بالأجسام المضادة الأولية ، مضاد Tuj1 للفأر (1: 200 في المخزن المؤقت للحجب) والفئران المضادة ل ICAM-2 (1: 500 في العازلة للحجب) ، عند 4 درجات مئوية.
    2. اغسل أكواب العين 3-5x لمدة 1 ساعة في كل مرة ، بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات يحتوي على 0.5٪ Triton X-100 (PBST) لتقليل الخلفية وإزالة أي جسم مضاد غير مرتبط.
    3. بعد الغسيل ، احتضن أكواب العين طوال الليل بالأجسام المضادة الثانوية ، والغلوبولين المناعي G المضاد للحمار المضاد للفأر المترافق مع صبغة Alexa Fluor 488 (مضان أخضر) ومضاد للحمار IgG مترافق مع صبغة Alexa Fluor 594 (مضان أحمر) ، وكلها مخففة 1: 1000 في حاجز مانع ، عند 4 درجات مئوية.
    4. في اليوم التالي ، اغسل أكواب العين 3-5x لمدة 1 ساعة لكل منها باستخدام PBST لتقليل الخلفية وإزالة الأجسام المضادة غير المنضمة.
    5. انقل أكواب العين إلى طبق بتري من برنامج تلفزيوني قبل التثبيت المسطح.
  4. شبكية مسطحة مثبتة
    1. بعد عملية التلوين المناعي ، اعزل شبكية العين عن أكواب العين تحت المجهر.
    2. قطع شبكية العين إلى أربع أوراق وتثبيتها بشكل مسطح مع توجيه طبقة RGC لأعلى. اترك العلامة على الجانب الصدغي متصلة بالشبكية للإشارة إلى الاتجاه.
    3. تغطية شبكية العين مع تصاعد المتوسطة13,18. ختم الشرائح بطلاء الأظافر13،18،19.
  5. التصوير البؤري
    ملاحظة: تم إجراء معالجة الصور للصور متحدة البؤر باستخدام برنامج ZEN المجهري.
    1. قم بتشغيل المجهر متحد البؤر ، وضمن وضع تحديد الموقع ، ابحث عن منطقة الاهتمام باستخدام عدسة المجهر.
    2. ضمن وضع الاكتساب ، قم بإعداد مربعات لتغطية شبكية العين بالكامل وشرائح z-stack لتغطية جميع طبقات المعلومات. قم بتصوير 25 بلاطة على الأقل عبر شبكية العين بأكملها لتغطية الحجم الإجمالي البالغ 5.99 مم (x) × 5.88 مم (y) × 30 μm (z) بحجم بكسل يبلغ 1.24 ميكرومتر / بكسل.
    3. اعرض شرائح Z-stack لإنشاء صور مجهرية متحدة البؤر ثنائية الأبعاد (الشكل 1C ، D) 11،13،19،20،21.

3. محاذاة الصور داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي

  1. بعد معالجة مخطط الألياف ، قم بإنشاء صورة مركبة تتضمن الصور الأربع التي تم الحصول عليها من كل ماوس عن طريق محاذاة جميع الأوعية الدموية مع محرر رسومات من اختيارك.
    ملاحظة: في المتوسط، تبلغ الصورة المركبة النهائية حوالي 1.2 مم (x) × 1.2 مم (y)، كما هو موضح في الشكل 1B.
  2. استخدم رأس العصب البصري (ONH) ونمط الأوعية الدموية كمعالم لمحاذاة مخطط الألياف المركب. احصل على المحاذاة داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي عن طريق تداخل نمط الأوعية الدموية لصور OCT المركبة مع الصور متحدة البؤر لنفس شبكية العين الملطخة ب ICAM-2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تمت مقارنة المركب مقابل الألياف OCT مع الصورة البؤرية المقابلة لشبكية العين المثبتة بشكل مسطح والمناعية مع Tuj-1 لمحاور RGC (الشكل 1D ، اللوحة العلوية). يمكن مطابقة الحزم المحورية المصورة بواسطة vis-OCTF مع الحزم المحورية التي تحمل علامة Tu-j1 على الصورة متحدة البؤر. عادة ما تظهر الأوع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هناك خطوتان في هذا البروتوكول تتطلبان الاهتمام. أولا ، من الضروري التأكد من أن يخضع للتخدير العميق وأن عيونه متوسعة بالكامل قبل التصوير المقطعي المحوسب. إذا لم يتم تخدير الفئران بشكل كاف ، فقد يؤدي تنفسها السريع إلى حركات غير مستقرة لصور الوجه ، مما قد يؤثر سلبا على جودة الألياف. علاو?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

تشانغ ، س. ، لا شيء ؛ شو ، دبليو ، لا شيء ؛ مروحة ، دبليو ، لا شيء ؛ ماكدانيال ، ج. أ. ، لا شيء ؛ د. أ. ميلر, اي; م. جرانونيكو ، اي; م. ليو, اي; خ. ليو, اي; لدى H.F. Zhang مصالح مالية في Opticent Health ، والتي لم تدعم هذا العمل.

Acknowledgements

هذه الدراسة مدعومة من قبل مؤسسة أبحاث الجلوكوما شافير جرانت ، وجائزة 4-CA Cavalier التعاونية ، R01EY029121 ، R01EY035088 ، ومؤسسة Knights Templar Eye.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Halo 100Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscopeCarl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)Santz Cruz Biotechnology, SC-2816921-2 drops
Bovine serum albumin powderFisher Scientific, BP9706-1001:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dyeThermo Fisher Scientific, Cat# A-212021:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dyeThermo Fisher Scientific, Cat# A-212091:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))Covetrus, NDC 11695-4860-115.6 mg/mL
KetamineCovetrus, NADA043304114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia1:200
Normal donkey serum(NDS)Millipore Sigma, S30-100 mL1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4
(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)		Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K31:10
Rat anti-ICAM-2BD Pharmingen, Cat#5533251:500
Tropicamide drops Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100
(Reagent Grade)		VWR, CAS: 9002-93-11:20
Vectashield mounting mediumVector Laboratories Inc. H2000-10
XylazineCovetrus, NDC59399-110-2017 mg/kg

References

  1. Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
  2. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  3. Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
  4. Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
  5. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
  6. Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
  7. Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769(2019).
  8. Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
  9. Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
  10. Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
  11. Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
  12. Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756(2021).
  13. Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
  14. Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
  15. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
  16. Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
  17. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
  18. Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
  19. Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
  20. Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
  21. Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Vis OCTF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved