JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول نموذج تراكم الليبوفوسين في الثقافات الظهارية الصبغية الشبكية البشرية شديدة التمايز والاستقطاب (RPE) ومقايسة البلعمة المحسنة للجزء الخارجي (OS) للكشف عن إجمالي سعة استهلاك / تدهور نظام التشغيل ل RPE. تتغلب هذه الطرق على قيود نماذج ليبوفوسين السابقة ومقايسات البلعمة الكلاسيكية لمطاردة النبض.

Abstract

تساهم البلعمة اليومية للأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية بواسطة ظهارة صبغة الشبكية (RPE) في تراكم صبغة الشيخوخة داخل الخلايا التي تسمى ليبوفوسين. سمية ليبوفوسين راسخة في مرض ستارغاردت ، وهو تنكس الشبكية الوراثي الأكثر شيوعا ، ولكنه أكثر إثارة للجدل في الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو السبب الرئيسي للعمى الذي لا رجعة فيه في العالم المتقدم. كان تحديد سمية الليبوفوسين في البشر أمرا صعبا ، والنماذج الحيوانية ل Stargardt لها سمية محدودة. وبالتالي ، هناك حاجة إلى نماذج في المختبر تحاكي RPE البشري في الجسم الحي لفهم توليد الليبوفوسين وإزالته وسميته بشكل أفضل. كانت غالبية نماذج ليبوفوسين زراعة الخلايا حتى الآن في خطوط الخلايا أو تضمنت تغذية RPE بمكون واحد من خليط الليبوفوسين المعقد بدلا من شظايا / أطراف الجزء الخارجي للمستقبل الضوئي بأكمله ، مما يولد نموذجا أكثر اكتمالا وفسيولوجيا ليبوفوسين. الموصوف هنا هو طريقة للحث على تراكم المواد الشبيهة بالليبوفوسين (تسمى مادة التألق الذاتي غير القابلة للهضم ، أو UAM) في RPE البشري الأولي قبل الولادة (hfRPE) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المشتقة من RPE. تراكمت UAM في الثقافات عن طريق التغذية المتكررة لشظايا OS المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية التي تمتصها RPE عن طريق البلعمة. كما تمت مناقشة الطرق الرئيسية التي يقترب بها UAM ويختلف عن lipofuscin في الجسم الحي . يرافق هذا النموذج من التراكم الشبيه بالليبوفوسين ، يتم تقديم طرق التصوير لتمييز طيف التألق الذاتي الواسع لحبيبات UAM من تلطيخ الأجسام المضادة المتزامن. أخيرا ، لتقييم تأثير UAM على قدرة البلعمة RPE ، تم تقديم طريقة جديدة لتحديد كمية امتصاص الجزء الخارجي / الأطراف وتفكيكها. تتغلب هذه الطريقة ، التي يطلق عليها "السعة الاستهلاكية الكلية" ، على التفسيرات الخاطئة المحتملة لقدرة البلعمة RPE المتأصلة في فحوصات "مطاردة النبض" الكلاسيكية للجزء الخارجي. يمكن استخدام النماذج والتقنيات المقدمة هنا لدراسة توليد الليبوفوسين ومسارات الإزالة والسمية المفترضة.

Introduction

توفر ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) دعما حاسما للمستقبلات الضوئية العلوية ، بما في ذلك الامتصاص اليومي وتدهور أطراف أو شظايا الجزء الخارجي للمستقبلات الضوئية (خلال هذا البروتوكول ، يشير اختصار OS إلى نصائح أو شظايا نظام التشغيل بدلا من الأجزاء الخارجية بأكملها). هذا الامتصاص اليومي في RPE بعد الانقسام يؤدي في النهاية إلى زيادة التحميل على قدرة البلعمة ويؤدي إلى تراكم مادة غير قابلة للهضم ، ذاتية الفلورسنت داخل الخلايا ، تسمى ليبوفوسين. ومن المثير للاهتمام ، أن العديد من الدراسات أظهرت أيضا أن RPE lipofuscin يمكن أن يتراكم بدون البلعمةOS 1,2. يحتوي Lipofuscin على العديد من المكونات ، بما في ذلك المضافات المتشابكة المشتقة من الرتينوئيدات ذات الدورة البصرية ، ويمكن أن تشغل ما يقرب من 20٪ من حجم خلايا RPE لمن تزيد أعمارهم عن 803.

ما إذا كان ليبوفوسين ساما قد نوقش بشدة. مرض ستارغاردت هو تنكس صبغي جسدي متنحي للمستقبلات الضوئية و RPE حيث تؤدي طفرة في ABCA4 إلى معالجة غير صحيحة لراتينويدات الدورة البصرية الموجودة داخل الأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية. تؤدي معالجة الريتينويد غير الصحيحة إلى ربط متقاطع شاذ وتشكيل أنواع ثنائي الريتينويد ، بما في ذلك ثنائي الريتينويد N-retinylidene-N-retinylethanolamine (A2E). أظهرت الدراسات آليات متعددة لسمية A2E 4,5. يساهم Lipofuscin في إشارات التألق الذاتي لقاع العين أثناء التصوير السريري ، ويظهر كل من مرضى Stargardt والنماذج الحيوانية زيادة في التألق الذاتي لقاع العين قبل تنكس الشبكية ، مما يشير إلى وجود علاقة بين مستويات الليبوفوسين والسمية 6,7. ومع ذلك ، مع تقدم العمر ، يتراكم الليبوفوسين في جميع البشر دون التسبب في تنكس RPE. علاوة على ذلك ، في التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، حيث يحدث تنكس RPE فقط في المرضى المسنين ، فإن أولئك الذين يعانون من أشكال مبكرة ومتوسطة من المرض لديهم إشارات تألق ذاتي قاع العين أقل من البشر غير المصابين بالعمر8. تم التحقق من هذه النتائج السريرية على المستوى النسيجي وكذلك 9,10.

كما تركت النماذج الحيوانية لتراكم الليبوفوسين RPE بعض الغموض حول سمية الليبوفوسين. لا يعرض ماوس خروج المغلوب ABCA4 تنكس الشبكية على خلفية مصطبغة ، بينما يفعل ذلك على خلفية ألبينو أو عند تعرضه للضوء الأزرق11,12. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن تختلف سمية ليبوفوسين المشتقة عن طريق خروج المغلوب ABCA4 عن تراكم الليبوفوسين ببطء والذي يحدث مع الشيخوخة الطبيعية ، كما هو موضح في AMD13.

توفر النماذج المختبرية لتراكم الليبوفوسين بديلا لدراسة آثار تراكم الليبوفوسين على صحة RPE. تسمح هذه النماذج بمعالجة مكونات الليبوفوسين ، من تغذية مكونات الريتينويد المفردة إلى تغذية نظام التشغيل ، وتسمح بالدراسة في RPE البشري بدلا من الحيواني. في العقدين الماضيين ، تم تطوير طرق متعددة لنمذجة RPE lipofuscin في الثقافة. جنبا إلى جنب مع مجموعات أخرى ، قامت مجموعة الدكتور بولتون بتغذية نظام التشغيل البقري يوميا لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر عند المرور من 4 إلى 7 خلايا RPE أولية بشرية من متبرعين تتراوح أعمارهم بين 4 و 85 عاما14 عاما. بدلا من ذلك ، أدى تثبيط الالتهام الذاتي أيضا إلى تراكم الليبوفوسين في الممرات من 3 إلى 7 ثقافات RPE البشرية الأولية15. ومع ذلك، فإن تثبيط الليزوزومات شبه المميتة في مزارع RPE البشرية الأولية قبل الولادة (hfRPE) شديدة التمايز في الممر 1 فشلت في تحفيز الليبوفوسين، حتى مع الإضافة المتكررة لنظام التشغيل على أساس يومي16.

كنهج أكثر اختزالا ، قام آخرون بتغذية مكونات ليبوفوسين مفردة للثقافات ، وخاصة ثنائي الريتينويد A2E 4,17. هذه الدراسات قيمة من حيث أنها تحدد الآليات المباشرة المحتملة للسمية لمكونات الليبوفوسين الفردية ، والتي تنطوي ، على سبيل المثال ، على الكوليسترول الليزوزومي وتوازن السيراميد18. في الوقت نفسه ، هناك جدل حول سمية A2E19 ، وإطعامه مباشرة إلى الخلايا يتحايل على المسار النموذجي لتراكم الليبوفوسين ، والذي ينطوي على البلعمة من مستقبلات الضوء OS. في محاولة لتوصيل جميع مكونات الليبوفوسين إلى ثقافات RPE ، قام بولتون ومارشال بتنقية الليبوفوسين من عيون الإنسان وتغذيته بالممر 4 إلى 7 ثقافات RPE الأولية البشرية المستمدة من كل من المتبرعين البشريين الجنين وكبار السن20. على الرغم من أن هذه الطريقة مبتكرة ، إلا أنها تمثل مصدرا محدودا للليبوفوسين للتجارب المتكررة.

في حين أن التغذية المتكررة لثقافات نظام التشغيل إلى RPE تنتج ليبوفوسين في العديد من الأنظمة ، إلا أنها تفشل في القيام بذلك في ثقافات RPE الأولية شديدة التمايز16. يحفز نظام التشغيل المؤكسد الضوئي تفاعلات الربط المتقاطع مثل تكوين ثنائي الريتينويد الذي يحدث بشكل طبيعي أثناء تكوين ليبوفوسين في الجسم الحي. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تسريع تكوين حبيبات تشبه الليبوفوسين في أنظمة زراعة RPE ، حتى تلك شديدة التمايز ومقاومة لتراكم الليبوفوسين16. هنا ، يتم تقديم طريقة للحث على تراكم الحبيبات الشبيهة بالليبوفوسين في hfRPE شديد التمايز و iPSC-RPE البشري ، وتعديلها من بروتوكول Wihlmark المنشور21. تتميز هذه الطريقة بتحفيز حبيبات شبيهة بالليبوفوسين تستخدم نفس المصدر (مستقبل ضوئي OS) والمسار (امتصاص OS البلعمي) كما يحدث في تكوين الدهون في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، يتم إجراؤه على ثقافات RPE البشرية المتباينة للغاية والتحقق من صحتها في دراسات متعددة لتكرار RPE البشري في الجسم الحي22،23،24. تسمى هذه الحبيبات الشبيهة بالليبوفوسين بالمواد الفلورية الذاتية غير القابلة للهضم (UAM) ، وتوفر بيانات ومناقشة في هذا البروتوكول تقارن UAM بالدهون في الجسم الحي. جنبا إلى جنب مع طرق لبناء وتقييم الثقافات المحملة ب UAM في RPE البشري شديد التمايز ، يتم أيضا تقديم طريقة محدثة لتقييم البلعمة RPE OS. تم إدخال العديد من طرق مطاردة النبض الممتازة لقياس البلعمة OS ، بما في ذلك النشاف الغربي ، والكيمياء الخلوية المناعية ، و FACS25،26،27. ومع ذلك ، في وقت مبكر من مطاردة نبض نظام التشغيل ، يمكن الخلط بين الظروف التي تؤدي إلى ضعف امتصاص نظام التشغيل مع الظروف التي تعزز التدهور السريع لنظام التشغيل الداخلي. تقيس الطريقة المعروضة هنا إجمالي كمية نظام التشغيل الذي تم إدخاله / تدهوره بالكامل بواسطة RPE ("إجمالي السعة الاستهلاكية") ، مما يساعد على إزالة هذا الغموض. ومن المتوقع أن يتم استخدام رؤى حول سمية ليبوفوسين باستخدام هذه البروتوكولات، بما في ذلك التأثيرات على معدلات البلعمة باستخدام طريقة "السعة الاستهلاكية الكلية"، لإلقاء الضوء على سمية ليبوفوسين في الجسم الحي.

Protocol

تمت مراجعة البروتوكول الحالي الذي يتضمن اقتناء واستخدام الأنسجة البشرية والموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة ميشيغان (HUM00105486).

1. إعداد نصائح وشظايا الجزء الخارجي المؤكسد بالصور

ملاحظة: تم شراء شبكية العين البقري المتكيفة مع الظلام وشحنها على الجليد (انظر جدول المواد). من شبكية العين هذه ، تم تنقية نظام التشغيل باتباع بروتوكول23 المنشور مسبقا.

  1. ربط متقاطع للجزء الخارجي مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية
    1. اغمر الشرائح المطلية بالبولي تترافلورو إيثيلين (انظر جدول المواد) تماما في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق في خزانة السلامة الحيوية لتعقيم الشرائح. اترك الشرائح تجف في الهواء في طبق زراعة خلية معقم مقاس 100 مم.
    2. ضع كل شريحة في طبق زراعة خلية جديد 100 مم وأضف 200 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا المحتوية على المصل (أيا كانت الوسائط المستخدمة عادة لمزارع RPE في متناول اليد) في كل مستطيل ، ثم ضع ضوء الأشعة فوق البنفسجية المحمول باليد 254 نانومتر (انظر جدول المواد) على طبق زراعة الخلايا 100 مم (بدون غطاء) مع لمبة تواجه الشريحة مباشرة ، وفضح لمدة 20 دقيقة. تم نشر الوسائط المستخدمة خصيصا لهذه الدراسة وأرقام المنتجات المحددة لمكونات الوسائط سابقا22,23. تسمى هذه الوسائط "وسائط RPE" في جميع أنحاء هذا البروتوكول.
      ملاحظة: المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية للوسائط تحجب السطح الزجاجي وتمنع نظام التشغيل من الالتصاق أثناء الخطوات التالية.
    3. قم بإذابة القسامات المجمدة لنظام التشغيل عند 37 درجة مئوية (في متناول اليد أو عن طريق حمام مائي). يعتمد مقدار نظام التشغيل المطلوب على التطبيق. بشكل عام ، يمكن للمرء معالجة ما يصل إلى 500 ميكرولتر من 2 × 108 OS / مل لكل مستطيل على الشريحة.
    4. بمجرد إذابته ، قم بتدوير نظام التشغيل عند 2400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم على الفور بشفط المادة الطافية في خزانة السلامة الحيوية باستخدام ماصة بدلا من الفراغ لمنع الفقد العرضي للحبيبات.
    5. أعد تعليق الحبيبات برفق باستخدام برنامج تلفزيوني معقم.
      ملاحظة: تتبع مستوى الصوت المعاد تعليقه والتركيز المتوقع. على سبيل المثال ، إعادة تعليق الحبيبات من أنبوب 1 مل من 1 × 10 8 OS / mL مع 500 ميكرولتر PBS ينتج 2 × 108 OS / mL. الحد الأقصى للحجم والتركيز لكل مستطيل على الشريحة المطلية بالبولي تترافلوروإيثيلين هو 500 ميكرولتر من 2 × 108 OS / mL.
    6. قم بشفط الوسائط من الشرائح وضع ما يصل إلى 500 ميكرولتر من محلول PBS 2 × 108 OS / mL على كل مستطيل من الشريحة. ضع ضوء الأشعة فوق البنفسجية المحمول باليد فوق طبق زراعة الخلايا (بدون غطاء) بحيث يكون المصباح مواجها لنظام التشغيل مباشرة. قم بتعريض حل نظام التشغيل لضوء 254 نانومتر لمدة 40 دقيقة.
      ملاحظة: أثناء التعرض لمدة 40 دقيقة ، قم بتغطية مصباح الأشعة فوق البنفسجية والطبق بمنشفة أو وسادة ماصة ، وأغلق وشاح خزانة السلامة الحيوية ، وأطفئ المنفاخ. هذا سيمنع حدوث أي تبخر كبير. إذا لم يكن مصباح الأشعة فوق البنفسجية المستخدم في هذا البروتوكول متاحا للباحث ، فهناك بديلان لضمان تحقيق القدر المناسب من الربط المتقاطع. الأول هو اتباع التعرض الكمي للأشعة فوق البنفسجية المبين في الخطوة 1.2 ، إما مع الجهاز المبين في الخطوة 1.2 أو جهاز آخر يمكن أن يوفر نفس التعرض الإشعاعي الكمي مثل الجهاز المذكور في 1.2. بديل آخر هو تعريض نظام التشغيل للإشعاع فوق البنفسجي لفترة تحفز درجة الارتباط المتقاطع على بقعة Coomassie الموضحة في الشكل 1C.
    7. اجمع محلول OS PBS المعالج في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة ، وأعد غسل مستطيل الشريحة المطلية ب 200-500 ميكرولتر من PBS (2-3x) ، وجمع كل غسلة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انظر إلى الشريحة الموجودة أسفل مجهر غرفة زراعة الأنسجة للتأكد من إزالة جميع أنظمة التشغيل تقريبا من الشريحة.
    8. قم بتدوير حل نظام التشغيل PBS عند 2400 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واستنشق PBS في خزانة السلامة الأحيائية باستخدام ماصة ، وأعد التعليق في وسائط قياسية 500 ميكرولتر سيتم استخدامها لثقافات RPE (على سبيل المثال - "وسائط RPE" المعرفة في القسم 1.1.2). يمكن ضبط حجم إعادة التعليق بناء على تركيز نظام التشغيل المؤكسد بالصور (OxOS) المطلوب.
    9. ضع 10 ميكرولتر من التعليق في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد ، وقم بتخفيف 50-100x بمزيد من وسائط زراعة الخلايا ، وعد أنظمة التشغيل باستخدام مقياس الدم.
    10. بناء على عدد نظام التشغيل ، قم بتخفيف تعليق OxOS إلى تركيز المخزون النهائي. لتغذية مستنبتات RPE عالية النضج في 24 بئرا (مساحة سطح 0.33 سم 2 ؛ انظر جدول المواد) ، يوصى بتركيز وسائط نهائي قدره2 × 107 OS / mL.
      1. لتحقيق ذلك ، قم بتوزيع OxOS في حصص 25 ميكرولتر بتركيز 5.6 × 107 OS / mL ، معلقة في وسائط ثقافة RPE القياسية. بعد إذابة حصة 25 ميكرولتر ، امزج القسمة بأكملها مع 45 ميكرولتر من وسائط زراعة RPE القياسية ، مما يوفر حجم وسائط نهائي يبلغ 70 ميكرولتر وتركيز OS يبلغ 2 × 107 OS / mL لكل تغذية OxOS Transwell.
    11. قبل اقتباس OxOS ، أضف روابط سد البلعمة (البروتين S و MFG-E8 ، انظر جدول المواد) ، والتي تسهل امتصاص OS وتراكم الليبوفوسين. تركيزات العمل من الروابط الجسرية في 24 بئر Transwell هي 4 ميكروغرام / مل للبروتين S المنقى بشريا و 1.5 ميكروغرام / مل للمؤتلف البشري MFG-E8. وبالتالي ، بالنسبة لقسمة 25 ميكرولتر من OxOS عند 5.6 × 107 OS / مل ، فإن تركيز المخزون للبروتين S هو 11.2 ميكروغرام / مل ، وبالنسبة ل MFG-E8 هو 4.2 ميكروغرام / مل.
      ملاحظة: تم تحسين تركيزات الرباط الجسري لمزارع hfRPE على 24 بئرا ، مع عدد خلايا تقريبي يبلغ 320000 خلية لكل بئر 0.33 سم2 . قد تحتاج تركيزات الربيطة إلى التعديل لأنواع RPE الأخرى وكثافات الخلايا لأن الروابط الموجودة بما يزيد عن توافر مستقبلات البلعمة قد تمنع بشكل متناقض امتصاص OS28.
    12. قم بتجميد القسامات في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: عمليات الذوبان بالتجميد المتعددة ضارة للغاية بسلامة نظام التشغيل.
  2. ربط الجزء الخارجي بجهاز ربط متشابك للأشعة فوق البنفسجية
    ملاحظة: اتبع الخطوة 1.1، باستثناء الخطوات أدناه، التي تحل محل الخطوتين 1.1.2 و1.1.6، على التوالي:
    1. (تحل محل الخطوة 1.1.2) ضع كل شريحة في طبق زراعة خلية جديد 100 مم وأضف 200 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا المحتوية على المصل (على سبيل المثال - "وسائط RPE" أو أي بديل آخر) في كل مستطيل ، ثم ضع الشرائح في جهاز Ultraviolet Crosslinker (انظر جدول المواد) ، مع المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر عند التعرض الإشعاعي من 3-6 جول / سم2 لسد السطح الزجاجي ومنع الالتصاق بنظام التشغيل أثناء الخطوات التالية.
    2. (تحل محل الخطوة 1.1.6) قم بشفط الوسائط من الشرائح وضع ما يصل إلى 500 ميكرولتر من 2 × 108 OS / mL في برنامج تلفزيوني معقم على كل مستطيل من الشريحة. ضع الشرائح في جهاز Ultraviolet Crosslinker ، واضبط التعرض الإشعاعي للعلاج حسب الحاجة (3-9 جول / سم2) ، وعالجها عند 254 نانومتر.
      ملاحظة: يمكن تحديد التعرض الإشعاعي المطلوب بعناية عن طريق معايرة التعرض المشع بين 3-9 جول / سم2 حتى يتم تحقيق درجة التألق الذاتي ، والربط المتقاطع للبروتين (كما هو موضح في الشكل 1B والشكل 1C).
      تنبيه: يمكن أن يؤدي التعامل مع نظام التشغيل خارج خزانة السلامة الحيوية إلى التلوث. بعد تعرض نظام التشغيل لجهاز UV Crosslinker ، اجمع نظام التشغيل بأطراف ماصة معقمة ، وانقله إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة ، وتعامل مع جميع الخطوات الإضافية في غطاء الأمان البيولوجي.
  3. توصيف نظام التشغيل المؤكسد
    1. تحديد طيف انبعاث التألق الذاتي عن طريق التصوير
      1. ضع 20-50 ميكرولتر من محلول المخزون من نظام التشغيل غير المعالج و OxOS في أنبوبين منفصلين لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة. أجهزة طرد مركزي عند 2400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وإعادة تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت (مثل PBS) 4٪ بارافورمالدهايد ، وإصلاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      2. بعد التثبيت ، قم بتدويره لأسفل على النحو الوارد أعلاه ، واغسله باستخدام PBS x 2 (يدور لأسفل بين الغسلات) ، ثم أعد التعليق في أقل من 30 ميكرولتر من PBS.
      3. ضع بضعة ميكرولترات من إعادة التعليق على شريحة مجهرية ، وأضف وسائط التثبيت (انظر جدول المواد) ، وأخيرا قسيمة غطاء.
      4. صورة OxOS على مجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد).
        ملاحظة: يمكن إثارة التألق الذاتي ل OxOS من خلال مجموعة واسعة من الأطوال الموجية لليزر ، ولكن عادة ما يتم استخدام خط ليزر 405 نانومتر أو 488 نانومتر. الانبعاث واسع بالمثل ، لكن إعداد مرشح الإثارة / الانبعاثات النموذجي ل GFP / FITC مناسب لعرض التألق الذاتي.
      5. لقياس طيف انبعاث OxOS ، استخدم λ-scanning على مجهر متحد البؤر. تتضمن إعدادات المسح النموذجية λ الإثارة مع 405 نانومتر أو 488 نانومتر ، والكشف عن الانبعاثات التي تتراوح من 10 نانومتر إلى اللون الأحمر من خط إثارة الليزر وصولا إلى حوالي 800 نانومتر ، مع حجم خطوة λ 10 نانومتر. كل نظام مجهري له توجيهاته الخاصة حول كيفية استخدام وضع λ ، ويحتاج القارئ إلى الرجوع إلى الدليل لمعرفة تركيزه المحدد.
    2. كبديل ، قم بقياس التألق الذاتي عن طريق قياس التدفق الخلوي.
      1. قم بتدوير 2 × 10 7 نظام تشغيل غير معالج وبشكل منفصل 2 × 107 OxOS في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وأعد التعليق في 1 مل من PBS.
        ملاحظة: التثبيت غير مطلوب إذا تم إجراء قياس التدفق الخلوي مباشرة بعد الذوبان.
      2. قم بتحميل عينات نظام التشغيل و OxOS غير المعالجة على مقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد). اضبط التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) على حيز مقبول في الرسم البياني للتشتت FSC-SSC. استخدم PBS كعنصر تحكم لاستبعاد أي جزيئات صغيرة ملوثة. لاحظ أن نظام التشغيل أصغر بكثير من الخلايا.
      3. استخدم قناة FITC القياسية لمقياس التدفق الخلوي لقياس كمية التألق الذاتي. عد ما لا يقل عن 10000 حدث. استخدم قيمة مساحة نبض الرسم البياني ل FITC لتمثيل شدة التألق.
        ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، يتم تحليل جميع البيانات باستخدام برنامج تحليل مقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد) ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    3. تقييم درجة الارتباط المتقاطع في OxOS
      1. تدور أسفل 2 × 10 7 نظام التشغيل غير المعالج وبشكل منفصل 2 × 107 OxOS في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. قم بإزالة حبيبات الطافية والتحلل المباشر عن طريق إضافة 1.2x Laemmli Sample Buffer (يكفي للتغطية ؛ انظر جدول المواد). دوامة ، يحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ويدور في درجة حرارة الغرفة عند 12000 × جم أو أكبر لمدة 10 دقائق ، ويجمع المواد الطافية.
        ملاحظة: يعطي تقييم درجة الارتباط المتقاطع للبروتين في OxOS إحساسا بكفاية العلاج بالأشعة فوق البنفسجية. يتم إجراء مقارنة بين نظام التشغيل غير المعالج و OxOS ، ويحدث الربط المتقاطع المناسب عندما يكون شريط رودوبسين الأحادي الذي يهيمن على تلطيخ Coomassie (الشكل 1C ، السهم) محسوسا فقط ، مع ظهور مجاميع أعلى مرتبة ومسحة بروتين في الجزء العلوي من الهلام.
        تنبيه: عند استخدام Sample Buffer لتحليل نظام التشغيل ، لا تقم بتسخين محلول التحلل لاحقا ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى تجميع رودوبسين. تجنب أيضا تبريد نظام التشغيل المحلل حتى يصبح جاهزا للتخزين ، لأن هذا سيعجل SDS. يمكن الاحتفاظ بالمحللات غير المستخدمة عند -20 درجة مئوية. في حالة إعادة الذوبان ، تأكد من إذابة المحللات تماما في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
      2. تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة البروتين التي تتحمل SDS العالية وتركيزات المختزلة29. انظر جدول المواد للحصول على اقتراحات بشأن كواشف فحص البروتين المناسبة ، واتبع بروتوكول الشركة المصنعة لهذه الكواشف.
      3. قم بتشغيل عينات نظام التشغيل و OxOS غير المعالجة بواسطة SDS-PAGE الكهربائي30 على هلام متدرج 4٪ -15٪ ، باستخدام مخزن مؤقت قياسي ثلاثي الجلايسين SDS. يتم تشغيل الجل عند 80 فولت حتى تدخل العينات إلى المكدس ، ثم عند 120 فولت لمدة 50-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      4. وصمة عار الجل مع الأزرق كوماسي باستخدام البروتوكولات القياسية31. سيوضح تلطيخ كوماسي مدى كفاية الربط المتقاطع الناجم عن العلاج بالأشعة فوق البنفسجية.

2. بناء حبيبات تشبه الليبوفوسين (UAM) في ثقافات RPE

  1. تغذية OxOS: الكمية والتكرار والبلعمة التي تربط الروابط
    ملاحظة: تحدث التغذية على ثقافات iPSC-RPE البشرية أو hfRPE في المقطع 1 ، والتي نمت وفقا للبروتوكول الذي حدده مختبر بهارتي (ل iPSC-RPE)32 أو بروتوكولنا المحدد مسبقا ل hfRPE ، المقتبس من مختبر شيلدون ميلر22,23. تستند جميع الحسابات أدناه إلى تغذية OxOS أو OS إلى Transwell واحد 24 بئرا (قطر 6.5 مم ، منطقة نمو 0.33 سم2).
    1. قم بإذابة 25 ميكرولتر من 5.6 × 107 OxOS / mL عند 37 درجة مئوية وأضف 45 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا إلى حصة OxOS ، مما ينتج عنه حجم نهائي يبلغ 70 ميكرولتر.
      ملاحظة: ستحتوي حصص OxOS المحضرة في الخطوة 1 على روابط سد البلعمة MFG-E8 والبروتين S. ومع ذلك ، إذا لم تتم إضافة هذه الروابط إلى الحصص قبل التجميد ، فيمكن إضافتها في هذه الخطوة ، مما يضمن أن التركيز النهائي للروابط في الوسائط المراد تغذيتها للخلايا هو 4 ميكروغرام / مل للبروتين S و 1.5 ميكروغرام / مل ل MFG-E8. وكما هو مذكور في الخطوة 1-1-11، قد يلزم تغيير تركيزات روابط التجسير بالنسبة لأنواع أخرى من قواعد الإجراءات الراديوية أو كثافات الخلايا.
    2. قم بإزالة الوسائط القمية من Transwell وأضف 70 ميكرولتر من 2 × 107 OxOS / mL مع البلعمة التي تربط الروابط إلى الغرفة القمية. بعد 24 ساعة ، قم بإزالته واستبداله بتغذية OxOS جديدة. تحدث التغذية يوميا خلال أيام الأسبوع ، وتخطي عطلات نهاية الأسبوع ، حتى اكتمال 20 تغذية (~ 1 شهر). تغيير وسائط زراعة الخلايا القاعدية (400-550 ميكرولتر) 2-3x / أسبوع.
    3. عند الانتهاء من 20 تغذية ، استأنف تغييرات الوسائط العادية للبئر.
      ملاحظة: يتطلب الأمر العديد من التغييرات الإضافية في الوسائط لغسل OxOS اللزج من السطح القمي RPE ، لذلك يجب إجراء التجارب مع الثقافات المحملة ب UAM بعد 1-2 أسابيع على الأقل من انتهاء تغذية OxOS.
      تنبيه: من المهم أن يكون لديك ضوابط مناسبة لتراكم UAM عبر تغذية OxOS. نظرا لأن التغييرات اليومية في الوسائط يمكن أن تؤثر على بيولوجيا RPE ، يوصى باستخدام آبار التحكم التالية: التحكم 1: استبدل الوسائط يوميا خلال أيام الأسبوع بنفس عدد الوجبات مثل المجموعة المعالجة ب OxOS. التحكم 2: تغذية نظام التشغيل RPE غير المعالج يوميا خلال أيام الأسبوع بنفس تركيز وحجم تغذية OxOS ، لنفس عدد الوجبات.
  2. مراقبة صحة الثقافات المحملة بحبيبات شبيهة بالليبوفوسين عن طريق مقايسات المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) ومقايسات موت الخلايا
    ملاحظة: أثناء وبعد تغذية OxOS ، يمكن قياس صحة مزارع RPE من خلال تقييم سلامة الوصلات الضيقة RPE وموت الخلايا. لقد ثبت سابقا أن تقييم سلامة الوصلات الضيقة ، من خلال قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) ، هو علامة حساسة لصحة الخلية العامة33. يمكن أيضا استخدام علامات غير جراحية أكثر تقليدية لموت الخلايا ، مثل إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH).
    1. أداء TEER
      ملاحظة: يتم اختبار TEER باستخدام مقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) وقطب TEER ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بشكل عام (انظر جدول المواد).
      1. لتعقيم قطب TEER ، استخدم ممسحة مهمة مبللة بنسبة 70٪ من الإيثانول لتنظيف القطب ثم اغمر أطراف مسبار القطب في 70٪ إيثانول لمدة 10 دقائق.
      2. دع القطب يجف تماما ، ثم اغمر القطب في وسائط معقمة.
      3. إزالة المسبار من الوسائط المعقمة وإدخال مجسات قطب TEER في الغرف القمية والقاعدية ل Transwell المستزرع ؛ يتناسب طرف المسبار الأطول مع الغرفة القاعدية.
        ملاحظة: من السهل كشط الجزء السفلي من الغرفة القمية باستخدام قطب TEER دون ممارسة ، وسيؤدي هذا الكشط إلى تغيير قراءات TEER بشكل كبير حيث يتم تعطيل الطبقة الأحادية RPE المتقاربة. وبالتالي ، يوصى بأن يتدرب المبتدئين على Transwells غير المهمة قبل الاختبار على ثقافات RPE التجريبية. علاوة على ذلك ، بعد اختبار كل لوحة من مزارع RPE ، يجب على المجرب التحقق من أي كشط للطبقة الأحادية RPE تحت مجهر زراعة الأنسجة القياسي.
      4. بمجرد وضع المجسات القمية والقاعدية في مكانها في Transwell ، اضغط على زر القراءة أو اضغط على مفتاح القدم الخاص بالعداد لتسجيل TEER. بين لوحات أو مجموعات من الخلايا ، اغسل مسبار القطب بوسائط معقمة. إذا كانت العدوى مصدر قلق كبير ، فقم بالتعقيم بين اللوحات.
      5. احسب TEER عن طريق أخذ قراءة المقاومة من العداد ، وطرح قيمة Transwell فارغة مع الوسائط ولكن بدون خلايا (بشكل عام 100-110 Ω ل Transwell 24 بئرا بمساحة سطح 0.33 سم2 ) ، ثم الضرب في مساحة سطح Transwell.
        ملاحظة: يجب الإبلاغ عن قيم TEER بشكل طبيعي إلى مساحة سطح الخلية. تتراوح القيم النموذجية لثقافات hfRPE الصحية من 350-1100 Ωcm2. تزداد قيم TEER مع انخفاض درجة الحرارة. وبالتالي ، عند إزالة الثقافات من حاضنة 37 درجة مئوية إلى غطاء درجة حرارة الغرفة ، تميل قيم TEER إلى الزيادة عبر اللوحة. للحماية من هذا التباين ، إما أن تعمل بسرعة (إذا واجهتها) أو انتظر لمدة 10-15 دقيقة حتى تتوازن درجة حرارة اللوحة مع درجة حرارة الغرفة.
    2. إجراء مقايسة إطلاق LDH
      ملاحظة: يحدث إطلاق LDH في طاف زراعة الخلايا أثناء موت الخلية ويتم قياسه باستخدام مجموعة قياسية (انظر جدول المواد).
      1. اجمع المادة الطافية من فوق الخلايا بعد حضانة لمدة 24 ساعة وقم بتخفيفها إلى 1: 100 باستخدام الوسائط القياسية.
      2. حث إجمالي إطلاق LDH المحتمل ، وهو أمر مهم لتطبيع جميع القيم من الخطوة 2.2.2.1 ، عن طريق إضافة 2 ميكرولتر 10٪ تريتون X-100 إلى 100 ميكرولتر من الوسائط القمية من خلايا التحكم في 24 بئر Transwell. بعد احتضان خليط التريتون / الخلية الطافية لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، امزج الوسائط فوق الخلايا المحللة الآن واجمعها لقياس إجمالي إطلاق LDH المحتمل.
      3. بمجرد جمع المواد الطافية ، قم بإجراء الفحص باستخدام التعليمات القياسية للشركة المصنعة ، وقياس التلألؤ بعد حضانة مدتها 30 دقيقة باستخدام محلول المخزن المؤقت للمجموعة.
        ملاحظة: تتم تسوية جميع قيم LDH إلى إجمالي المقدار الممكن لإطلاق LDH.
  3. توصيف طيف الحبيبات الشبيهة بالليبوفوسين وتكوينها
    1. الحصول على القياس الكمي والأطياف ذاتية التألق
      1. قم بإصلاح الثقافات المحملة ب UAM بنسبة 4٪ PFA في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، متبوعا بغسل PBS 5x.
      2. احتفظ بكمية صغيرة من برنامج تلفزيوني في الحجرة القمية ثم اقلب جهاز Transwell رأسا على عقب. باستخدام مجهر تشريح وشفرة حلاقة ، قم بقطع الغشاء شبه المسامي من Transwell ، مع تطبيق قوة القطع عند تقاطع الغشاء و Transwell.
        ملاحظة: حافظ على الاتساق حول مدى قرب إجراء القطع من شفة Transwell ، حيث يميل غشاء Transwell إلى الالتواء والتجاعيد عندما لا تكون الجروح متسقة.
      3. بمجرد قطع غشاء Transwell ، ضعه على الفور على شريحة مجهرية باستخدام ملقط ، مع الحرص على تجنب لمس أجزاء من غشاء Transwell بالخلايا. تخلص من PBS الزائد بمسح المهام ، مع تجنب لمس الخلايا. أضف وسائط التركيب وقسيمة غطاء. تأكد من تتبع أي جانب من Transwell هو "الجانب الأيمن لأعلى" عند تغطية Transwell.
      4. الحصول على شدة الفلورسنت الذاتي والأطياف باستخدام نفس الإعدادات والإجراءات الواردة في الخطوة 1-3-1-4 والخطوة 1-3-1-5.
        ملاحظة: عند تصوير UAM ، فإن الخلط المهم هو أن OxOS ذاتي الفلورسنت وغالبا ما يلتصق بالسطح القمي RPE لأيام وأحيانا حتى أسابيع بعد الانتهاء من تغذية OxOS. نتيجة لذلك ، عند تحديد UAM ، يجب استخدام طريقة لضمان أن التألق الذاتي المقاس يأتي من UAM وليس OxOS. أسهل طريقة هي المشاركة في تلطيخ ثقافات الليبوفوسين بجسم مضاد رودوبسين. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الأجسام المضادة للرودوبسين 4D2 بتخفيف 1: 1000 ومع بروتوكول الكيمياء الخلوية المناعية القياسي لتثبيت PFA34. يجب أن يكون الجسم المضاد الثانوي للرودوبسين جسما مضترانا أحمر متطرفا (على سبيل المثال مع أقصى إثارة بالقرب من 647 نانومتر) ، حيث يميل UAM و OxOS autofluorescence إلى أن يكون أضعف في هذا الطول الموجي. يمكن بعد ذلك الحصول على الصور متحدة البؤر بالتتابع في قناتين ، مما يثير التألق الذاتي UAM و OxOS باستخدام ليزر 405 نانومتر وانبعاث من 415 نانومتر إلى 550 نانومتر ، بينما يمكن إثارة رودوبسين المتبقي ، الذي يشير إلى OxOS غير المهضوم ، مع معلمات تصوير الصبغة الحمراء البعيدة القياسية في قناة منفصلة. بعد الاستحواذ ، يمكن استخدام قناة رودوبسين كقناع طرحي في برنامج مثل ImageJ لإزالة التألق الذاتي القادم من OxOS اللزج المتبقي ، تاركا وراءه فقط UAM autofluorescence لتحديد الكمية.
        تنبيه: حتى نظام التشغيل غير المؤكسد بالصور يعرض بعض التألق الذاتي ، وحتى مع الغسيل الصارم ، تلتصق بعض أنظمة التشغيل و OxOS بسطح RPE. وبالتالي ، بدون توليد قناع طرحي باستخدام التلوين المناعي للرودوبسين ، كما هو مقترح في الملاحظة أعلاه ، لا يمكن إجراء تقدير كمي دقيق لمستويات التألق الذاتي UAM في الثقافات التي تتغذى على OxOs أو نظام التشغيل القياسي.
    2. إجراء الكشف المتزامن عن الحبيبات الشبيهة بالليبوفوسين وغيرها من علامات التألق المناعي
      ملاحظة: كما هو مفصل في الخطوة 2.3.1 ، فإن طيف التألق الذاتي الواسع للليبوفوسين يحد من خيارات التلوين المشترك للتألق. يمكن اعتبار الطرق التالية لتسهيل التلوين المشترك.
      1. استخدم فلوروفور أحمر بعيد. التألق الذاتي من ليبوفوسين ضعيف في الأشعة تحت الحمراء القريبة. وبالتالي ، فإن استخدام صبغة حمراء بعيدة للكشف عن مضان مستضد مهم ، جنبا إلى جنب مع التعديلات الدقيقة لإعدادات القناة على مجهر متحد البؤر ، يمكن أن يميز عادة التألق الذاتي عن التألق المشترك.
      2. استفد من ذيل الانبعاث الفلوري الطويل للليبوفوسين.
        ملاحظة: نظرا لأن ليبوفوسين يحتوي على طيف انبعاث مضان واسع جدا ، فإنه يمكن أن يثار غالبا عند طول موجي منخفض نانومتر (على سبيل المثال ليزر 405 نانومتر) ولا يزال الانبعاث مكتشفا في الجزء البرتقالي / الأحمر من الطيف (على سبيل المثال 585-635 نانومتر). غالبا ما يمكن تصميم هذا المزيج الفريد من الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث حول فلوروفور آخر للتلطيخ.
        1. اكتشف المستضد محل الاهتمام باستخدام الفلوروفور الذي يبلغ ذروة الإثارة حوالي 488 نانومتر ، مع اكتشاف الانبعاثات عند 500-530 نانومتر. قم بإعداد قناة منفصلة للكشف عن التألق الذاتي مع إثارة 405 نانومتر وانبعاث 585-635 نانومتر. ستكتشف هذه القناة الثانية UAM فقط ، بينما ستكتشف القناة الأولى مستضد الاهتمام بالإضافة إلى lipofuscin.
        2. باستخدام برنامج مجاني مثل ImageJ ، استخدم قناة UAM الثانية هذه فقط كقناع طرح لإزالة إشارة UAM من القناة الأولى (التي تحتوي على كل من إشارة المستضد وإشارة UAM).
      3. الاستفادة من إلغاء الخلط الطيفي. تحتوي معظم المجاهر متحدة البؤر الحديثة على خيار فك الخلط الطيفي. هذا يسمح للمرء بالحصول على طيف عينة باستخدام UAM فقط وعينة أخرى مع الفلوروفور الملون المشترك المثير للاهتمام فقط. يمكن بعد ذلك الحصول على العينة التجريبية ، التي تحتوي على كل من UAM وفلوروفور التلوين المشترك ، وتعريضها لطرق فك الخلط الخطي لحساب النسبة المئوية للإشارة التي جاءت من التألق الذاتي مقابل التلوين المشترك.
        ملاحظة: تتوفر أدلة شاملة لعدم الخلط الطيفي مع معظم المجاهر متحدة البؤر الحديثة.
      4. الاستفادة من التصوير مدى الحياة مضان. في حين أن طيف الانبعاث بين UAM والفلوروفور الملطخ المشترك للاهتمام قد يكون مشابها ، فمن المحتمل أن يختلف عمر التألق بينهما اختلافا كبيرا. بشكل عام ، يوضح UAM عمرا مضانا أقصر من معظم الفلوروفورات المحددة. من خلال الوصول إلى مجهر متحد البؤر يسمح بالتصوير مدى الحياة ، يمكن للمرء أن بوابة إشارات مضان للكشف عن تلك التي هي أطول من عمر ليبوفوسين النموذجي.
        ملاحظة: بشكل عام ، فإن عمر البوابات الفلورية للإشارات الأطول من 2 نانوثانية يقلل بشكل كبير من تلوث UAM ، على الرغم من أنه لا يلغي الإشارة تماما.
      5. استخدام مثبط التألق الذاتي. تقليديا ، تم استخدام السودان الأسود لإخماد التألق الذاتي قبل تلطيخ المناعي المحدد35. تشير العديد من منتجات إخماد التألق الذاتي المتاحة تجاريا إلى تحسين نتائج سودان بلاك ، وهذه المنتجات مفصلة في جدول المواد. التبريد الذاتي ، بطبيعة الحال ، سوف يدمر القدرة على اكتشاف ليبوفوسين.
    3. تحديد تكوين حبيبات تشبه الليبوفوسين
      1. تقييم الدهون المحايدة
        1. قم بإصلاح RPE المحمل ب UAM وآبار التحكم (التي يتم تغذيتها بنظام التشغيل غير المعالج) في 4٪ PFA في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، واغسلها باستخدام PBS 5x.
        2. صبغ الدهون المحايدة باستخدام إما 10 ميكروغرام / مل من النيل الأحمر أو 3.33 ميكروغرام / مل Bodipy 493/503 في محلول 3٪ BSA PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، متبوعا بالغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق 3x.
        3. قم بقص وتركيب Transwell كما في الخطوة 2.3.1.2 و 2.3.1.3 والصورة. بشكل عام ، استخدم عرض النطاق الترددي للإثارة والانبعاث التالي للتصوير: النيل الأحمر - على سبيل المثال 543 نانومتر ، em 620-700 نانومتر و Bodipy 493/503 - ex 488 نانومتر ، em 500-550 نانومتر.
      2. تقييم الكوليسترول المستتر وغير الأستري
        1. اتبع الخطوة 2.3.3.1.1
        2. الفلبينية هي صبغة فلورية تتعرف على الكوليسترول غير الأستري ، ولكن ليس الكوليسترول المستتر36. وبالتالي ، لتقييم كمية الكوليسترول الكلي (غير الأسترة والأسترة) في UAM ، قم أولا بمعالجة العينة مسبقا باستخدام إستراز الكوليسترول لتحويل الكوليسترول الأستري إلى كوليسترول غير مستر. عالج الخلايا ب 20 وحدة / مل من إستراز الكوليسترول في محلول فوسفات البوتاسيوم 0.1 M (درجة الحموضة 7.2) (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية لمدة 3.5 ساعة ، متبوعا بالغسيل باستخدام PBS لمدة 5 دقائق 3x.
        3. تلطخ ب 50 ميكروغرام / مل فلبيني (انظر جدول المواد) في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، واغسله ب PBS لمدة 5 دقائق 3x. احتفظ بالعينات مغطاة ، بعيدا عن الضوء ، حيث يتم تبييض الضوء الفلبيني بسهولة.
          ملاحظة: إذا كان سيتم قياس كمية الكوليسترول غير الأستري فقط ، فيمكن تخطي إستراز الكوليسترول في الخطوة 2.3.3.2.2. إذا كان سيتم تحديد كمية الكوليسترول الأستري ، فيمكن استنتاجها من خلال الفرق بين الكوليسترول الكلي والكوليسترول غير الأستري في العينة.
        4. قص وتركيب Transwell كما في الخطوتين 2.3.1.2 و 2.3.1.3 والصورة.
          ملاحظة: عند تصوير الفلبين ، فإنه يبيض ضوئيا بسرعة كبيرة. يحتاج المرء إلى تقليل شدة ومدة الإثارة ، وتوقع أن بعض التبييض الضوئي قد يحدث حتى مع عرض العينة من خلال المناظير. لذلك ، عند التصوير ، يجب على المرء: (1) البحث عن منطقة مناسبة للتصوير باستخدام قناة مضان أخرى غير القناة الفلبينية ، (2) صورة فلبينية على مجهر واسع المجال بدلا من المجهر متحد البؤر (للحد من شدة التعرض للضوء) ، و (3) تجنب التصوير المتكرر لمنطقة ما. بشكل عام ، استخدم عرض النطاق الترددي للإثارة والانبعاث التالي لتصوير الفلبين - على سبيل المثال 380 نانومتر ، em 480 نانومتر.

3. تقييم آثار الحبيبات الشبيهة بالليبوفوسين على البلعمة RPE: القدرة الاستهلاكية الكلية

ملاحظة: الأساس المنطقي لقياس البلعمة OS عبر بروتوكول نبض نظام التشغيل فقط أدناه مفصل في قسم النتائج التمثيلية. تتجنب الطريقة ، التي يطلق عليها "السعة الاستهلاكية الكلية" ، الغموض حول كفاءة البلعمة التي يمكن أن تظهر مع فحوصات البلعمة التقليدية لمطاردة نبض نظام التشغيل. تتم الفحوصات على ألواح Transwell ذات 24 بئرا باستخدام 50 ميكرولتر من الوسائط التي تحتوي على 4 × 106 OS / mL.

  1. احسب عدد الآبار اللازمة للتجربة ثم قم بإذابة كمية مناسبة من نظام التشغيل العادي ، وقم بتدويره لأسفل عند 2400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وأعد التعليق في وسائط زراعة الخلايا RPE القياسية إلى 4 × 106 OS / mL. أضف روابط تجسير لتسهيل معدلات البلعمة.
    ملاحظة: التركيز النهائي للروابط الجسرية في الوسط المراد تغذية الخلايا هو 4 ميكروغرام / مل للبروتين S و 1.5 ميكروغرام / مل ل MFG-E8. وكما هو مذكور في الخطوة 1-1-11، قد يلزم تغيير تركيزات روابط التجسير بالنسبة لأنواع أخرى من قواعد الإجراءات الراديوية أو كثافات الخلايا.
  2. قم بإزالة الوسائط القمية وأضف 50 ميكرولتر 4 × 106 OS / مل ، من الناحية المثالية مع تركيزات مناسبة من روابط التجسير.
  3. في أوقات مختلفة بعد إضافة نظام التشغيل (على سبيل المثال - 0 ساعة و 1 ساعة و 4 ساعات و 24 ساعة) ، أضف 16.67 ميكرولتر 4x Laemmli عينة عازلة مع مثبطات الأنزيم البروتيني لتحلل كل من الخلايا والمادة الطافية التي تحتوي على نظام التشغيل. استخدم ماصة P-200 لخدش سطح Transwell ، مع الحرص على عدم ثقب غشاء Transwell أو فصل الغشاء عن Transwell ، وجمع طافية الخلية المدمجة بالإضافة إلى تحلل الخلية معا. دوامة ، تدور لأسفل ، وتترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لتمسخ شامل.
    تنبيه: على الرغم من استخدام Sample Buffer لتحليل نظام التشغيل ، لا تقم بتسخين محلول التحلل لاحقا ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى تراكم رودوبسين. تجنب أيضا تبريد نظام التشغيل المتحلل حتى يصبح جاهزا للتخزين ، لأن هذا سيترسب البروتين. قم بتجميد المحللات غير المستخدمة عند -20 درجة مئوية ، مع التأكد من إذابة المحللات تماما قبل الاستخدام.
  4. قم بتشغيل المحللين على SDS PAGE باستخدام نفس الإعدادات كما في الخطوة 1.3.3 ، مع تحميل كميات متساوية من المحللين لكل بئر. يجب استخدام GAPDH أو β-actin أو بروتين تدبير منزلي آخر لتطبيع عدد الخلايا ، حيث تعتمد معدلات البلعمة على عدد الخلايا.
  5. التحقيق في البقع الغربية مع الأجسام المضادة ضد إما N- أو C- نهاية رودوبسين. استخدم شروط النشاف الغربية القياسية ، ويتم سرد تخفيفات الأجسام المضادة في جدول المواد.
    ملاحظة: أسفل شريط رودوبسين الرئيسي ، سيكون هناك شظايا رودوبسين متعددة. تمثل هذه الشظايا رودوبسين مهضوم جزئيا ، وهي عملية تبدأ قبل اندماج البلعمة مع الليزوزوم32,33. يمكن أن تشير الزيادة في عدد شظايا رودوبسين في RPE المحملة ب UAM مقارنة بالتحكم RPE إلى وجود عيب في المصب في قدرة الجسيم البلعمي ، على مستوى اندماج الليزوزوم البلعمي ، والتحمض الليزوزومي ، و / أو وظيفة الإنزيم المتحلل16،34،35.

النتائج

يوضح الشكل 1Ai إعداد الأكسدة الضوئية لنظام التشغيل. تسمح الشرائح المطلية بالبولي تترافلورو إيثيلين بتحميل حجم كبير من نظام التشغيل في المحلول لكل مستطيل مفتوح دون الانتشار عبر بقية الشريحة. يتم احتواء الشريحة مع نظام التشغيل داخل طبق بتري معقم مع الغطاء ، ويتم وضع مصباح ال?...

Discussion

بينما تمت دراسة RPE lipofuscin لعقود من الزمن ، فإن سميته تناقش2،9،16،42. بالنظر إلى الغموض حول سمية الليبوفوسين من النماذج الحيوانية11 ، فإن النماذج في المختبر التي تستخدم RPE البشري قيمة. تم وصف مجموعة من نماذج ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من خلال منح من مؤسسة جراحة الشبكية والجسم الزجاجي (VRSF) ، والكفاح من أجل البصر (FFS) ، والمؤسسة الدولية لأبحاث الشبكية (IRRF). يتم دعم J.M.L.M. حاليا بمنحة K08 من المعهد الوطني للعيون (EY033420). لم يتم استخدام أي أموال فيدرالية لأبحاث HFT. يأتي المزيد من الدعم من مبادرة جيمس جروسفيلد ل Dry AMD والجهات المانحة الخاصة التالية: باربرا دن ودي وديكسون براون.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell culture dishCorning#353003Others also work
24-well TranswellsCorning#3470
Anti-LC3 antibodyCell Signaling Technology#4801S1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4Abcam#54171:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2EnCor BiotechMCA-B6301:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencherBiotium#23007TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencherVector LaboratoriesSP-8400Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503Life TechnologiesD3922
Cholesterol esterase Life TechnologiesFrom A12216 kit
Confocal microscopeLeicaLeica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinasW. L. Lawson CompanyDark-adapted bovine retinas (pre-dissected)Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
FilipinSigma-AldrichF4767
Flow cytometerThermo FisherAttune NxT
Flow cytometer analysis software BDFlowJo
Handheld UV light Analytik Jena USUVGL-55
Human MFG-E8Sino Biological10853-H08B
Human purified Protein SEnzyme Research LaboratoriesHPS
Laemmli sample bufferThermo FisherJ60015-AD
LDH assayPromegaJ2380LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting mediaInvitrogenP36930Prolong Gold antifade reagent
Nile redSigma-Aldrich#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slidesTekdonCustomizedCustomized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors Cell Signaling Technology#5872
Protein assayBio-Rad#5000122 RC DC protein assay
TEER electrodeWorld Precision InstrumentsSTX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meterWorld Precision InstrumentsEVOM3
Ultraviolet crosslinker deviceAnalytik Jena USUVP CL-1000

References

  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease--correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215 (2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582 (2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch's membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39 (2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118 (2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. , 51-60 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194 RPE OS AMD UAM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved