A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية إعادة بناء cristae الميتوكوندريا لتحقيق التصوير 3D بدقة عالية ودقة عالية وإنتاجية عالية.

Abstract

إن فهم السمات الديناميكية للبنية الفائقة لعضية الخلية ، والتي ليست غنية بالمعلومات غير المعروفة فحسب ، بل متطورة أيضا من منظور ثلاثي الأبعاد (3D) ، أمر بالغ الأهمية للدراسات الميكانيكية. يوفر المجهر الإلكتروني (EM) عمق تصوير جيد ويسمح بإعادة بناء مكدسات الصور عالية الدقة للتحقيق في التشكل الفائق للعضيات الخلوية حتى على مقياس النانومتر. لذلك ، تكتسب إعادة الإعمار 3D أهمية بسبب مزاياها التي لا تضاهى. يوفر المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) تقنية الحصول على الصور عالية الإنتاجية التي تسمح بإعادة بناء الهياكل الكبيرة في 3D من نفس المنطقة ذات الاهتمام في شرائح متتالية. لذلك ، أصبح تطبيق SEM في إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع لاستعادة البنية التحتية ثلاثية الأبعاد الحقيقية للعضيات شائعا بشكل متزايد. في هذا البروتوكول ، نقترح مزيجا من المقطع التسلسلي فائق النحافة وتقنيات إعادة البناء 3D لدراسة cristae الميتوكوندريا في خلايا سرطان البنكرياس. يتم وصف تفاصيل كيفية تنفيذ هذه التقنيات في هذا البروتوكول بطريقة خطوة بخطوة ، بما في ذلك طريقة الأوزميوم - ثيوكربوهيدرازيد - الأوزميوم (OTO) ، والتصوير التسلسلي للمقطع فائق النحافة ، وعرض التصور.

Introduction

الميتوكوندريا هي واحدة من أهم العضيات في الخلية. إنها بمثابة المحور المركزي للطاقة الحيوية الخلوية والتمثيل الغذائي 1,2 وتلعب دورا مهما في السرطان3. سرطان البنكرياس (PC) هو واحد من أصعب أنواع السرطان4 لعلاج بسبب انتشاره السريع وارتفاع معدل الوفيات. تم ربط الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا ، والذي يحدث بشكل رئيسي بسبب التغيرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا3،5،6،7 ، بآليات المرض الكامنة وراء PC8. الميتوكوندريا هي أيضا د....

Protocol

1. إعداد المواد

  1. مزرعة 2 × 106 خلايا Panc02 في 12 مل من وسط DMEM (10٪ مصل بقري جنيني و 100 وحدة / مل من البنسلين والستربتومايسين) ، والحفاظ على 37 درجة مئوية ورطوبة 95٪ في جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ هواء لمدة 48 ساعة.
  2. جمع خلايا Panc02 ، وأجهزة الطرد المركزي في 28 × غرام لمدة 2 دقيقة ، ثم تخلص من المادة الطافية. تأكد من أن العينة ذات حجم مناسب (1 × 107 خلايا) ، وإلا فإن خطوات التثبيت والجفاف التالية لن تعمل بشكل جيد.
  3. أضف 1 مل من 2.5٪ جلوتارالدهيد كمثبت لإصلاح خلايا Panc02 الطازجة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب طرد العينات بالطرد ا....

النتائج

أثناء زراعة الخلايا (الشكل 1 أ) ، قمنا أولا بتقسيم خلايا سرطان البنكرياس إلى مجموعة تحكم مستزرعة بوسط زراعة كامل ، ومجموعة (1S ، 3R) -RSL348 (RSL3 ، منشط فيروبتوسيس ، 100 نانومتر) ، ومجموعة RSL3 (100 نانومتر) بالإضافة إلى فيروستاتين -149 (Fer-1 ، مثبط داء الحديديات ، 100 .......

Discussion

الطريقة المعروضة هنا هي دليل مفيد خطوة بخطوة لتطبيق تقنية إعادة الإعمار 3D ، والتي تتضمن تطبيق المجهر الإلكتروني وتكنولوجيا معالجة الصور على تكديس وتجزئة الصور المقطعية 2D المتولدة من المقاطع التسلسلية فائقة النحافة. يسلط هذا البروتوكول الضوء على قيود على صور 2D التي يمكن معالجتها من خلال ?.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من خلال منح مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة تشجيانغ (Z23H290001 ، LY19H280001) ؛ منح المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82274364 و 81673607 و 81774011) ؛ بالإضافة إلى مشروع أبحاث الرفاهية العامة لمنحة هوتشو للعلوم والتكنولوجيا (2021GY49 ، 2018GZ24). نحن نقدر المساعدة الكبيرة والدعم الفني والدعم التجريبي من المنصة العامة لمركز البحوث الطبية ، أكاديمية العلوم الطبية الصينية ، جامعة تشجيانغ الطبية الصينية.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(1S,3R)-RSL3MCEHY-100218A
AcetoneSIGMA179124
AmiraVisage Imaging
Aspartic acidMCEHY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s mediumGibco11995115
EthanolMerck100983
Ferrostatin-1MCEHY-100579
Fetal bovine serumGibco10437010
Field emission scanning electron microscopeHITACHISU8010
GlutaraldehydeAlfa AesarA10500.22
Lead nitrateSANTA CRUZsc-211724
Osmium TetroxideSANTA CRUZsc-206008B
Panc02European Collection of Authenticated Cell Cultures 98102213
Penicillin-streptomycinBiosharpBL505A
Phosphate Buffered SalineBiosharpBL302A
Pon 812 Epoxy resinSPI CHEMGS02660
Potassium ferrocyanideMacklinP816416
ThiocarbohydrazideMerck223220
UltramicrotomeLEICAEMUC7
Uranyl AcetateRHAWNR0329292020.2

References

  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196 3D SEM OTO

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved