JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه التقنية سير عمل فعال لتصور وقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق داخل خلايا هيلا باستخدام التصوير الحي القائم على التألق.

Abstract

الميتوكوندريا عضيات ديناميكية ضرورية للاتزان الداخلي الأيضي من خلال التحكم في إنتاج الطاقة عن طريق تخليق الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP). لدعم التمثيل الغذائي الخلوي ، تتعاون آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا المختلفة للحفاظ على شبكة ميتوكوندريا صحية. أحد هذه المسارات هو الميتوفاجي ، حيث يسهل كيناز 1 الناجم عن PTEN (PINK1) و Parkin phospho-ubiquitination للميتوكوندريا التالفة عزل البلعمة الذاتية والإزالة اللاحقة من الخلية عن طريق اندماج الليزوزوم. الميتوفاجي مهم للاتزان الخلوي ، وترتبط الطفرات في باركين بمرض باركنسون (PD). بسبب هذه النتائج ، كان هناك تركيز كبير على التحقيق في تلف الميتوكوندريا ودورانها لفهم الآليات الجزيئية وديناميكيات مراقبة جودة الميتوكوندريا. هنا ، تم استخدام تصوير الخلايا الحية لتصور شبكة الميتوكوندريا لخلايا HeLa ، لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بعد العلاج باستخدام سيانيد الكربونيل m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) ، وهو عامل فك ارتباط الميتوكوندريا. بالإضافة إلى ذلك ، تم التعبير عن طفرة مرتبطة بمرض باركين (ParkinT240R) والتي تثبط الميتوفاجي المعتمد على باركين لتحديد كيفية تأثير التعبير الطافر على شبكة الميتوكوندريا مقارنة بالخلايا التي تعبر عن باركين من النوع البري. يصف البروتوكول الموضح هنا سير عمل بسيط باستخدام مناهج قائمة على التألق لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بشكل فعال.

Introduction

شبكة الميتوكوندريا عبارة عن سلسلة من العضيات المترابطة التي تلعب دورا حاسما في إنتاج الطاقة1 ، والمناعة الفطرية2,3 ، وإشارات الخلية 4,5. ارتبط عدم تنظيم الميتوكوندريا بالأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون (PD)6,7. PD هو اضطراب تنكسي عصبي تدريجي يؤثر على الخلايا العصبية الدوبامينية للمادة السوداء التي تؤثر على ما يقرب من 10 ملايين شخص في جميع أنحاء العالم8. تم ربط PD وراثيا ب mitophagy ، وهو مسار لمراقبة جودة الميتوكوندريا ضروري للحفاظ على التوازن الخلوي الذي يزيل بشكل انتقائي الميتوكوندرياالتالفة 9,10. حددت الدراسات العديد من مسارات الميتوفاجي المستقلة ، بما في ذلك مجال FUN14 الذي يحتوي على ميتوفاجي بوساطة 1 (FUNDC1) ، وبروتين Bcl-2 المتفاعل 3 (BNIP3) الميسر ، والميتوفاجي المعتمد على NIX ، والكيناز 1 الناجم عن PTEN (PINK1) / الميتوفاجي المنظم بمرض باركين10،11. يعمل PINK1 (كيناز مفترض) وباركين (E3 ubiquitin ligase) جنبا إلى جنب مع الميتوكوندريا التالفة من فوسفو-يوبيكوتينات ، والتي تدفع إلى تكوين البلعمة الذاتية التي تبتلع العضية التالفة وتندمج مع الليزوزومات لبدء التدهور12،13،14،15،16. ارتبطت الطفرات في باركين بالأنماط الظاهرية المرتبطة بمرض باركين مثل التنكس العصبي عن طريق فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية17,18.

هنا ، يتم وصف بروتوكول تستخدم فيه خلايا HeLa ، وهي خلايا خلدة تستخدم بشكل روتيني مشتقة من سرطان عنق الرحم ، للتحقيق في دور Parkin في الحفاظ على صحة شبكة الميتوكوندريا. تعبر خلايا هيلا عن مستويات ضئيلة من باركين داخلي المنشأ وبالتالي تتطلب تعبير باركين خارجيالمنشأ 19. لدراسة دور باركين في صحة شبكة الميتوكوندريا ، يتم نقل خلايا هيلا إما باستخدام باركين من النوع البري (ParkinWT) ، أو متحور باركين (ParkinT240R) ، أو ناقل تحكم فارغ. ParkinT240R هو طفرة وراثية جسدية متنحية في مرض باركنسون الأحداث تؤثر على نشاط Parkin E3 ligase ، مما يقلل بشكل كبير من كفاءة مسار الميتوفاجي20. تخضع خلايا هيلا لتركيزات خفيفة (5 ميكرومتر) أو شديدة (20 ميكرومتر) من سيانيد الكربونيل م-كلوروفينيل هيدرازون (CCCP) ، وهو عامل فصل الميتوكوندريا. يستخدم العلاج بتركيزات شديدة من CCCP بشكل روتيني للحث على الميتوفاجي بوساطة باركين في خطوط الخلايا المختلفة ، مثل خلايا HeLa و COS-721،22،23.

بعد العلاج ، يستخدم البروتوكول التصوير الحي لشبكة الميتوكوندريا باستخدام اثنين من الأصباغ الفلورية المستهدفة للميتوكوندريا المتاحة حاليا. رباعي ميثيل رودامين ، إستر الإيثيل ، بيركلورات (TMRE) عبارة عن صبغة كاتيونية تتألق بناء على إمكانات غشاء الميتوكوندريا24 ، في حين أن MitoSOX هو مؤشر فائق أكسيد الميتوكوندريا حيث تكون شدة التألق دالة لتركيز الأكسيد الفائق25. أخيرا ، يستخدم البروتوكول المبين تقديرا كميا قائما على التألق وسير عمل بسيط لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بشكل فعال مع الحد الأدنى من نطاق تحيز المستخدم. على الرغم من أن هذا البروتوكول تم تصميمه لدراسة وظيفة الميتوكوندريا في خلايا هيلا ، إلا أنه يمكن تكييفه مع خطوط الخلايا الإضافية وأنواع الخلايا الأولية لتوصيف صحة شبكة الميتوكوندريا كميا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تحضير العينات البيولوجية

ملاحظة: نفذ الخطوات التالية باستخدام تقنية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية. رش سطح الخزانة وجميع المواد بنسبة 70 ٪ من الإيثانول.

  1. زراعة خلايا هيلا ونقلها
    1. استزرع 30000 خلية هيلا في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco تحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ومحلول L-glutamine بنسبة 1٪ (HeLa media ؛ انظر جدول المواد). ضع الخلايا على أطباق تصوير ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم (انظر Table of Materials) تحتوي على 2 مل من وسائط HeLa المسخنة مسبقا. الحفاظ على مزارع هيلا عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية26,27.
    2. في اليوم التالي للطلاء ، افحص أطباق التصوير مقاس 35 مم باستخدام مجهر ضوئي للتأكد من أن الخلايا ~ 50٪ -60٪ متقاربة. بمجرد أن تتلاقى ، قم بنقل خلايا HeLa بناقل البروتين الفلوري الأصفر الفارغ (YFP) ، أو YFP-ParkinWT ، أو YFP-ParkinT240R (الشكل 1 أ).
    3. تحضير خليطين منفصلين في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة لكل عملية نقل. امزج عن طريق النقر على الأنبوب أو سحب الإصبع برفق لأعلى ولأسفل.
      1. في الأنبوب 1 ، امزج 200 ميكرولتر من وسائط المصل المختزلة (انظر جدول المواد) مع 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي.
      2. في الأنبوب 2 ، امزج 200 ميكرولتر من وسائط المصل المختزلة مع 6 ميكرولتر من كاشف النقل (انظر جدول المواد)28.
    4. احتضان الأنابيب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). أضف الأنبوب 2 إلى الأنبوب 1 ، واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، واحتضنه لمدة 20 دقيقة في RT.
    5. أضف مجمعات النقل بالتنقيط إلى أطباق التصوير الموجودة التي تحتوي على مزارع خلايا هيلا ، مما يضمن التوزيع المتساوي عبر الطبق بأكمله. ضع أطباق التصوير في حاضنة CO2 و 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ طوال الليل.
      ملاحظة: قم بتسمية كل طبق بالبلازميد المنقول المناسب. لكل تجربة ، قم بتسمية أطباق YFP-ParkinWT الثلاثة (ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO ؛ انظر جدول المواد] ، 5 ميكرومتر CCCP ، و 20 ميكرومتر CCCP). كرر وضع العلامات مع أطباق YFP-ParkinT240R الثلاثة وأطباق ناقلات YFP الثلاثة الفارغة.
  2. تحضير CCCP والأصباغ الفلورية
    تنبيه: غالبا ما تكون الأصباغ الفلورية حساسة للضوء. قم بتخزين الأصباغ في الظلام باستخدام رقائق الألومنيوم أو أنابيب الطرد المركزي البنية لتقليل التعرض للضوء.
    1. اصنع مخزونا عاملا قدره 5 مللي متر من CCCP (انظر جدول المواد) عن طريق إذابة 5 مجم من CCCP في 4.89 مل من DMSO. اصنع مخزونا عاملا قدره 20 مللي متر من CCCP عن طريق إذابة 5 مجم من CCCP في 1.22 مل من DMSO.
    2. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من محلول مخزون MitoTracker Deep Red (انظر جدول المواد) 1 مللي متر في 390 ميكرولتر من DMSO لعمل مخزون عامل 25 ميكرومتر.
    3. قم بإذابة 50 ميكروغرام من MitoSOX Red25 (انظر جدول المواد) في 13 ميكرولتر من DMSO لإنشاء مخزون عامل 5 مللي متر.
    4. قم بإذابة 10 مجم من TMRE24 (انظر جدول المواد) في 19.4 مل من DMSO لعمل محلول مخزون 1 mM. قم بتخفيف TMRE بإضافة 10 ميكرولتر من 1 mM TMRE إلى 990 μL من DMSO لعمل مخزون عامل 10 ميكرومتر.

2. علاج CCCP ووضع العلامات على الميتوكوندريا مع مجسات الفلورسنت في خلايا هيلا

تنبيه: قم بتنفيذ الخطوات التالية بسرعة للتأكد من عدم خروج خلايا هيلا من الحاضنة لفترة طويلة.

  1. في اليوم التالي للتحويل ، أضف 2 ميكرولتر من 5 أو 20 mM CCCP (التركيز النهائي: 5 ميكرومتر و 20 ميكرومتر ، على التوالي) إلى كل لوحة تجريبية. بالنسبة للوحات التحكم ، أضف 2 ميكرولتر من DMSO. أعد الألواح إلى حاضنة CO2 و 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ لمدة 1.5 ساعة (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: علاج CCCP هو لمدة 2 ساعة. ومع ذلك ، يتم تمييز الميتوكوندريا بمجسات الفلورسنت خلال آخر 30 دقيقة من علاج CCCP.
  2. بعد 1.5 ساعة ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة وإضافة مجسات الفلورسنت إلى أطباق التصوير. أعد الألواح إلى حاضنة CO2 و 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ لمدة 30 دقيقة (الشكل 1 أ).
    1. تجربة TMRE: أضف 2 ميكرولتر من 25 ميكرومتر MitoTracker (التركيز النهائي: 25 نانومتر) و 2 ميكرولتر من 10 ميكرومتر TMRE (التركيز النهائي: 10 نانومتر).
    2. تجربة MitoOX: أضف 2 ميكرولتر من 25 ميكرومتر MitoTracker (التركيز النهائي: 25 نانومتر) و 1 ميكرولتر من 5 مللي متر MitoSOX (التركيز النهائي: 2.5 ميكرومتر).
  3. بعد علاج CCCP لمدة ساعتين ، قم بإعداد خلايا HeLa للتصوير (الشكل 1A ، B).
    1. تجربة TMRE: خلايا هيلا جاهزة على الفور للتصوير. ضمان بقاء TMRE في وسط زراعة خلايا هيلا.
    2. تجربة MitoSOX: اغسل الخلايا 3x ب 2 مل من وسائط HeLa المسخنة مسبقا لإزالة صبغة MitoSOX المجانية. أضف 2 مل من الوسائط الدافئة مسبقا. خلايا هيلا جاهزة الآن للتصوير.
      ملاحظة: غسل خلايا هيلا بوسائط هيلا طازجة ومسخنة مسبقا تحتوي على نفس تركيز DMSO أو CCCP مثل الحالة التجريبية ؛ لا تقم بتضمين MitoSOX أو MitoTracker.

3. إعداد الحصول على صورة المجهر البؤري

ملاحظة: قم بتصوير خلايا HeLa باستخدام مجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد) مزود بهدف غمر الزيت بفتحة رقمية 63x / 1.40 (NA) وغرفة بيئية (انظر جدول المواد).

  1. في 1 ساعة قبل التصوير ، قم بتشغيل CO2 عن طريق فتح صمام الخزان. اضغط على الزر تشغيل لتشغيل وحدة التحكم البيئية للمجهر. استخدم السهمين لأعلى ولأسفل على لوحة اللمس لضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربونمن 2 إلى 5٪. اضغط على تعيين عند الانتهاء.
    ملاحظة: تأكد من إغلاق أبواب الغرفة البيئية وانتظر استقرار الظروف.
  2. إعدادات الليزر
    1. قم بتشغيل ليزر الضوء الأبيض (WLL) واضبط طاقة الليزر على 85٪ والتحكم في الإثارة على أقصى طاقة. انقر فوق علامة التبويب اكتساب، وحدد إضافة ليزر، وفي مربع الحوار الذي يظهر، قم بتبديل WLL إلى تشغيل. انقر فوق الزر طاقة الليزر وأدخل 85٪. انقر فوق الزر "التحكم في الإثارة" وحدد الطاقة القصوى من القائمة المنسدلة (الشكل 2 أ).
    2. تجربة TMRE: اضبط أطياف الإثارة والانبعاث ل YFP و MitoTracker و TMRE.
      1. بالنسبة ل YFP ، اضبط ليزر الإثارة على 514 نانومتر ونافذة أطياف الانبعاث على 524-545 نانومتر. في ال اكتساب علامة التبويب، انقر فوق إضافة إعداد جديد زر؛ ثم انقر فوق إضافة ليزر واسحبه إلى الإعداد 1. انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة وأدخل 514 كطول موجي في مربع الحوار. انقر نقرا مزدوجا فوق الكاشف المقابل وأدخل 524 للبداية و 545 لطول الموجة النهائية.
      2. بالنسبة إلى MitoTracker Deep Red ، اضبط ليزر الإثارة على 641 ونافذة أطياف الانبعاث على 650-750 نانومتر. في علامة التبويب اكتساب ، انقر فوق الزر "إضافة ليزر" واسحبه إلى الإعداد 1. انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة وأدخل 641 كطول موجي في مربع الحوار. انقر نقرا مزدوجا فوق الكاشف المقابل وأدخل 650 للبداية و 750 للطول الموجي النهائي.
      3. بالنسبة ل TMRE ، اضبط ليزر الإثارة على 555 نانومتر ونافذة أطياف الانبعاث على 557-643 نانومتر. في ال اكتساب علامة التبويب، انقر فوق إضافة إعداد جديد زر؛ ثم ، انقر فوق أضف ليزر زر واسحبه إلى الإعداد 2. انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة وأدخل 555 كطول موجي في مربع الحوار. انقر نقرا مزدوجا فوق الكاشف المقابل وأدخل 557 للبداية و 643 لطول موجة النهاية.
    3. تجربة ميتو سوكس: اضبط أطياف الإثارة والانبعاث ل YFP و MitoTracker و MitoSOX (الشكل 2 ب).
      1. بالنسبة ل YFP ، اضبط ليزر الإثارة على 507 نانومتر ونافذة أطياف الانبعاث على 517-540 نانومتر. في ال اكتساب علامة التبويب، انقر فوق إضافة إعداد جديد زر؛ ثم ، انقر فوق إضافة ليزر زر واسحبه إلى الإعداد 1. انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة وأدخل 507 كطول موجي في مربع الحوار. انقر نقرا مزدوجا فوق الكاشف المقابل وأدخل 517 للبداية و 540 لطول موجة النهاية.
      2. بالنسبة ل MitoSOX ، اضبط ليزر الإثارة على 547 نانومتر ونافذة أطياف الانبعاث على 564-636 نانومتر. في ال اكتساب علامة التبويب، انقر فوق إضافة إعداد جديد زر؛ ثم ، انقر فوق أضف ليزر زر واسحبه إلى الإعداد 2. انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة وأدخل 547 كطول موجي في مربع الحوار. انقر نقرا مزدوجا فوق الكاشف المقابل وأدخل 564 للبداية و 636 للطول الموجي النهائي.
      3. بالنسبة إلى MitoTracker Deep Red ، اضبط ليزر الإثارة على 641 نانومتر ونافذة أطياف الانبعاث على 652-742 نانومتر. في ال اكتساب علامة التبويب، انقر فوق إضافة إعداد جديد زر؛ انقر على إضافة ليزر زر واسحبه إلى الإعداد 3. انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة وأدخل 641 كطول موجي في مربع الحوار. انقر نقرا مزدوجا فوق الكاشف المقابل وأدخل 652 للبداية و 742 لطول موجة النهاية.
  3. إعدادات الحصول على الصور (الشكل 2C)
    1. اضبط التنسيق على 1024 × 1024 ، وسرعة المسح الضوئي على 600 هرتز ، ومتوسط الخط على 3.
      1. حدد علامة التبويب اكتساب وانقر فوق الزر تنسيق . من القائمة المنسدلة، حدد 1024 × 1024. انقر فوق الزر "سرعة" وحدد 600 من القائمة المنسدلة. ثم ، انقر فوق متوسط الخط زر ، ومن القائمة المنسدلة ، حدد 3.
      2. قم بتشغيل المسح ثنائي الاتجاه واضبط عامل الطور والتكبير / التصغير على 22.61 و 1.50 على التوالي.
        1. في علامة التبويب اكتساب، قم بتبديل الزر ثنائي الاتجاه إلى تشغيل. انقر فوق إعداد Phase X واضبطه على 22.61. انقر فوق إعداد عامل التكبير واضبطه على 1.50.

4. الحصول على الصور

تنبيه: يجب على المجرب إصدار حكم مرئي لتحديد الخلايا بناء على إشارة مضان YFP. تجنب وحدات البكسل المفرطة التشبع ، لأنها يمكن أن تؤثر بشكل كبير على تحديد كثافة التألق. استخدم جدول بحث فوق/أقل يشير إلى تشبع البكسل لتجنب الحصول على صور مشبعة.

  1. انقر فوق إعداد الاهتمام واضغط على Fast Live لتوفير معاينة مباشرة للصورة الفلورية.
  2. اضبط الكسب والشدة بالنقر المزدوج على الكاشف المقابل. في مربع الحوار الذي يظهر، اضبط ملف كسب باستخدام شريط التمرير. لتغيير الشدة ، انقر نقرا مزدوجا فوق خط الإثارة واستخدم السهمين لأعلى ولأسفل في النافذة المنبثقة لتغيير الشدة. انقر فوق إيقاف لإنهاء المعاينة.
    1. تجربة TMRE: صور لوحة التحكم DMSO أولا. اضبط كسب وشدة إشارة TMRE (الإعداد 2) بحيث تكون كثافة شبكة الميتوكوندريا أقل بقليل من التشبع ؛ حافظ على الكسب والشدة ثابتين للتجربة. اضبط كسب وشدة MitoTracker و YFP (الإعداد 1) بحيث تكون شبكة الميتوكوندريا مرئية ولكنها خافتة.
    2. تجربة MitoOX: صور لوحة تحكم DMSO أولا. اضبط كسب وشدة إشارة MitoSOX (الإعداد 2) بحيث يكون التألق مرئيا ولكنه خافت ؛ حافظ على الكسب والشدة ثابتين للتجربة. اضبط كسب وشدة YFP (الإعداد 1) و MitoTracker (الإعداد 3) بحيث تكون شبكة الميتوكوندريا مرئية ولكنها خافتة.
      ملاحظة: سجل كسب وشدة TMRE و MitoSOX ، حيث يجب أن تظل هذه القيم ثابتة طوال التجربة. لا يتم تحديد إشارات مضان YFP و MitoTracker في هذا البروتوكول. لذلك ، يمكن ضبط الكسب والشدة لكل صورة. من الأكثر فعالية أن يكون لديك إعدادات الكسب والشدة حيث يسهل رؤية الخلايا ولكنها لا تزال خافتة ، لضمان عدم تعرض الخلايا لشدة الليزر المفرطة التي تسبب تلف الخلايا أو التبييض الضوئي.
  3. بمجرد اكتمال إعدادات الكسب والشدة ، انقر فوق ابدأ للحصول على صورة. الحصول على صور من 20 خلية لكل حالة تجريبية (على سبيل المثال ، خمس صور مع أربع خلايا لكل صورة ؛ الشكل 2 د).

5. القياس الكمي لشدة التألق باستخدام ImageJ

ملاحظة: يتم حفظ ملفات التصوير ك ".lif" وتكون متوافقة مع ImageJ29. يتم تحديد أنواع الملفات المتوافقة مع ImageJ على موقع الويب الخاص بهم. قد يكون من الضروري تحويل نوع الملف إذا كان غير متوافق.

  1. إنشاء منطقة اهتمام (ROI) وحفظها.
    1. في ImageJ، انقر على ملف | جديد | صورة. في مربع الحوار الذي يظهر، انقر فوق موافق.
    2. انقر زر أداة المستطيل وارسم مربع 6 ميكرون × 6 ميكرون. افتح مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار وانتظر ظهور مربع حوار مع مدير عائد الاستثمار (الشكل 3 أ). أضف عائد الاستثمار المستطيل إلى المدير بالنقر فوق إضافة في مربع الحوار مدير. احفظ عائد الاستثمار عن طريق تحديد المزيد ، ثم انقر فوق الزر حفظ وموافق.
  2. قياس شدة مضان.
    1. في الصورة J، انقر فوق ملف وحدد فتح. في الشاشة، حدد ملفات التصوير للتجربة وانقر فتح.
    2. انتظر حتى تظهر نافذة خيارات استيراد التنسيقات الحيوية (الشكل 3 ب). حدد تقسيم القنوات وانقر فوق فتح.
      ملاحظة: تسمح ميزة تقسيم القنوات بفتح كل قناة في الصورة كنافذة منفصلة. يتوافق أمر القناة مع أمر الاستحواذ.
      1. تجارب TMRE: YFP (الإعداد 1) هو القناة الأولى (c = 0) ؛ MitoTracker (الإعداد 1) هي القناة الثانية (c = 1) ؛ و TMRE (الإعداد 2) هي القناة الثالثة (c = 2).
      2. تجارب MitoSOX: YFP (الإعداد 1) هي القناة الأولى (c = 0) ؛ MitoSOX (الإعداد 2) هي القناة الثانية (c = 1) ؛ و MitoTracker (الإعداد 3) هي القناة الثالثة (c = 2).
    3. اضبط السطوع عن طريق تحديد صورة | ضبط | السطوع (الشكل 3 ج).
      ملاحظة: لا تضغط على Set أو Apply (تطبيق) لضمان عدم تغيير سطوع الصورة بشكل دائم. في بعض الأحيان ، لا تكون شدة التألق مرئية في قنوات TMRE أو MitoSOX. اضبط السطوع للسماح بتصور أسهل. لا يؤثر تغيير السطوع على قيم شدة التألق الخام.
    4. انقر فوق تحليل وحدد تعيين القياسات. حدد مربعات المساحة ومتوسط القيمة الرمادية وانقر فوق "موافق " (الشكل 3 د).
      ملاحظة: متوسط القيمة الرمادية هو شدة التألق.
    5. افتح مدير عائد الاستثمار وقم بتحميل عائد الاستثمار المحفوظ في الخطوة 5.1 بالنقر فوق تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار. في مدير عائد الاستثمار، انقر على المزيد، ثم فتح من القائمة التي تظهر، وحدد عائد الاستثمار المحفوظ.
    6. قم بقياس شدة التألق لخمس مناطق عشوائية في خلية واحدة عن طريق تحديد عائد الاستثمار المحفوظ من مدير عائد الاستثمار ونقل عائد الاستثمار إلى موقع عشوائي داخل الخلية (الشكل 3E). قم بقياس شدة التألق بالضغط على M. كرر هذه الخطوة مع أربع مناطق إضافية غير متداخلة. عندما يظهر مربع حوار يحتوي على المساحة ومتوسط القيم الرمادية (الشكل 3F) ، انسخ القيم والصقها في جدول بيانات لتحليلها.
      1. تجربة TMRE : حدد الصورة (c = 2).
      2. تجربة MitoOX: حدد الصورة (c = 2).
    7. احصل على متوسط قيم شدة التألق. باستخدام برنامج جداول البيانات (انظر جدول المواد) ، قم بحساب متوسط القيم الرمادية الخمسة. كرر هذه العملية لكل خلية.
    8. تحليل ومقارنة TMRE أو MitoSOX متوسط القيم الرمادية عبر الظروف التجريبية باستخدام برنامج إحصائي (انظر جدول المواد; الشكل 4 والشكل 5). تقديم البيانات كرسوم بيانية شريطية أو مخططات كمان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في هذا البروتوكول ، تم استخدام القياس الكمي القائم على التألق لقياس إمكانات الغشاء ومستويات الأكسيد الفائق لشبكة الميتوكوندريا بعد معالجة CCCP (الشكل 1). استخدم سير العمل هذا خلايا هيلا ، وهي خط خلوي خالد مشتق من سرطان عنق الرحم. تستخدم خلايا هيلا بشكل روتيني لدراسة بيولوجيا ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يمكن استخدام سير العمل الموضح هنا لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بقوة وقابلية التكرار باستخدام التصوير القائم على التألق30. هناك قيود فنية مهمة يجب مراعاتها عند تصميم هذه التجارب. تم نقل خلايا هيلا باستخدام ناقل YFP فارغ ، YFP-ParkinWT ، أو YFP-ParkinT2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة يعلنونها.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبر إيفانز على ملاحظاتهم المدروسة حول هذه المخطوطة. يتم دعم هذا العمل من قبل علماء ديوك وايتهيد ، وعلماء ديوك للعلوم والتكنولوجيا ، وزمالة هانا جراي في معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI). تم عمل الشكل 1 أ باستخدام BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucoseGibco11-965-084
DMSO, AnhydrousThermoFisher ScientificD12345
Fetal Bovine SerumHycloneSH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  Red ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (Redued Serum media)ThermoFisher scientific31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty VectorN/AN/A
YFP-Parkin T240RThis PaperGenerated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)Microsoft Office https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted MicroscopeLeicaN/A
LIGHTNING Deconvolution SoftwareLeicaN/A
STELLARIS 8 confocal microscopeLeicaN/A

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847(2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64(2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260(2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.25 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543(2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961(2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778(2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30(2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved