سير عمل متكامل لدراسة بنية الجينوم المكاني والزماني المتمحورة حول المروج في مجموعات الخلايا النادرة

Summary

يتم تنظيم التعبير الجيني من خلال تفاعلات محفزات الجينات مع العناصر التنظيمية البعيدة. هنا ، نحدد كيف يسمح انخفاض الإدخال Capture Hi-C (liCHi-C) بتحديد هذه التفاعلات في أنواع الخلايا النادرة ، والتي كانت غير قابلة للقياس في السابق.

Abstract

يتم تنظيم النسخ الجيني الزماني المكاني بإحكام من خلال العناصر التنظيمية البعيدة ، مثل المعززات وكاتمات الصوت ، والتي تعتمد على القرب المادي مع مروجي الجينات المستهدفة للتحكم في النسخ. على الرغم من سهولة تحديد هذه العناصر التنظيمية ، إلا أنه من الصعب التنبؤ بجيناتها المستهدفة ، نظرا لأن معظمها خاص بنوع الخلية ويمكن فصلها بمئات الكيلوقواعد في تسلسل الجينوم الخطي ، متخطية الجينات الأخرى غير المستهدفة. لعدة سنوات ، كان Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) هو المعيار الذهبي لربط العناصر التنظيمية البعيدة بجيناتها المستهدفة. ومع ذلك ، يعتمد PCHi-C على توافر ملايين الخلايا ، مما يحظر دراسة مجموعات الخلايا النادرة مثل تلك التي يتم الحصول عليها عادة من الأنسجة الأولية. للتغلب على هذا القيد ، تم تطوير Capture Hi-C (liCHi-C) منخفض المدخلات ، وهي طريقة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتخصيص لتحديد ذخيرة العناصر التنظيمية البعيدة التي تتحكم في كل جين من جينوم. يعتمد liCHi-C على إطار تجريبي وحسابي مماثل ل PCHi-C ، ولكن من خلال استخدام الحد الأدنى من التغييرات في الأنبوب ، وتعديل تركيز الكاشف وأحجامه ، وتبديل الخطوات أو إزالتها ، فإنه يمثل الحد الأدنى من فقدان المواد أثناء بناء المكتبة. بشكل جماعي ، يتيح liCHi-C دراسة تنظيم الجينات وتنظيم الجينوم الزماني المكاني في سياق علم الأحياء التنموي والوظيفة الخلوية.

Introduction

يدفع التعبير الجيني الزمني تمايز الخلايا ، وفي النهاية ، تطور الكائن الحي ، ويرتبط تغييره ارتباطا وثيقا بعدد كبير من الأمراض¹،²،³،^4،5. يتم تنظيم النسخ الجيني بدقة من خلال عمل العناصر التنظيمية ، والتي يمكن تصنيفها على أنها قريبة (أي محفزات الجينات) وبعيدة (على سبيل المثال ، معززات أو كاتمات الصوت) ، وغالبا ما توجد الأخيرة بعيدا عن جيناتها المستهدفة وتتفاعل معها جسديا من خلال حلقات الكروماتين لتعديل التعبير الجيني⁶،^7،8

Protocol

لضمان الحد الأدنى من فقدان المواد ، (1) العمل مع أنابيب ونصائح منخفضة الارتباط بالحمض النووي (انظر جدول المواد) ، (2) ضع الكواشف على جدار الأنبوب بدلا من إدخال الطرف داخل العينة ، و (3) إذا أمكن ، امزج العينة عن طريق الانعكاس بدلا من سحب العينة لأعلى ولأسفل ، وقم بتدويرها لأسفل بعد ذلك لاستعادة العينة.

1. تثبيت الخلية

1. الخلايا التي تنمو في تعليق
   1. احصد 50000 إلى مليون خلية وضعها في أنبوب منخفض الارتباط للحمض النووي سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: أنواع الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة مفصلة في قسم النتائج التمثيلية.
   2. قم بطرد الخلايا لمدة 5 دقائق عند 600 × جم (عند 4 درجات مئوية) باستخ....

النتائج

يوفر liCHi-C إمكانية إنشاء مكتبات تفاعلية عالية الجودة وعالية الدقة على مستوى الجينوم مع أقل من 50000 خلية⁵³. يتم تحقيق ذلك عن طريق - إلى جانب التخفيض الحاد في أحجام التفاعل واستخدام الأواني البلاستيكية منخفضة الارتباط بالحمض النووي في جميع أنحاء البروتوكول - إزالة الخطوات غير الضر?.......

Discussion

يوفر liCHi-C القدرة على إنشاء مكتبات تفاعلية عالية الدقة باستخدام إطار تجريبي مماثل من PCHi-C ولكن مع عدد خلايا مخفض بشكل كبير. يتم تحقيق ذلك بشكل كبير من خلال القضاء على الخطوات غير الضرورية ، مثل تنقية الفينول وإزالة البيوتين. في بروتوكول Hi-C الكلاسيكي للربط داخل النواة⁵⁷ وتقنيته ا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP	Invitrogen	19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9260G
1 M Tris pH 8.0	Invitrogen	AM9855G
10x NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS	Fisher Scientific	BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer	New England Biolabs	B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free	Thermo Scientific	28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9000S
5 M NaCl	Invitrogen	AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes	Qiuantabio	2302820	For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification	Integrated DNA Technologies	-	Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers	Nunc	179693	Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)	Any brand
CHiCAGO R package	1.14.0
CleanNGS beads	CleanNA	CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Promega	U120A, U121A, U122A, U123A	Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	30108051
DNA LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL	New England Biolabs	M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads	Invitrogen	65002	For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads	Invitrogen	65602	For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2	Invitrogen	12321D	Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute	VWR	20821.321
FBS, qualified	Gibco	10270-106	Or any other brand
Glycine	Fisher BioReagents	BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant	Invitrogen	AM9515	Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP	0.8.2
HindIII, 100 U/µL	New England Biolabs	R0104T
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL	New England Biolabs	M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)	ZeroTip	PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator	Covaris	500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials	Covaris	520045	For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL	New England Biolabs	R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water	Sigma-Aldrich	W4502
PCR primers for quality controls	Integrated DNA Technologies	-
PCR strips and caps	Agilent Technologies	410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA	Sigma-Aldrich	P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531L	For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)	Roche	11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade	Roche	3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit	Invitrogen	Q33230	For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
rCutsmart buffer	New England Biolabs	B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX	Gibco	61870-010	Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology	PanReac AppliChem	A0676
Sodium acetate pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library	Agilent Technologies	5190-4831	Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1	Agilent Technologies	5190-8645	Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter	Agilent Technologies	931107	Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL	Invitrogen	15224025	For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL	New England Biolabs	M0202T	For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL	New England Biolabs	M0203L
T4 PNK 10000 units/mL	New England Biolabs	M0201L
Tapestation 4200 instrument	Agilent Technologies		For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents	Agilent Technologies	5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,	For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology	PanReac AppliChem	A4975
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML