In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم استخدام نظام تحليل تدفق مضان مزدوج القناة ثلاثي القنوات لتطوير مقايسة مناعية متعددة القائمة على الخرز تقوم في نفس الوقت بتقييم عينات المصل ل IgG و IgM المستنبطة ضد مستضدات متعددة من أنواع بوريليا المختلفة التي تسبب داء لايم في أوروبا وأمريكا الشمالية.

Abstract

لمراقبة تطور الأمراض المعدية ، من المفيد تقييم النشاط المناعي مقابل محددات المستضدات المختلفة ، وقياس الأنماط المتماثلة المختلفة للأجسام المضادة لأنها تظهر في مراحل مختلفة من الاستجابة المناعية للمضيف. مع داء لايم ، يمكن أن يكون العامل الممرض أحد الأعضاء المتعددين في أنواع بوريليا . لذلك ، يتطلب التصنيف الصحيح للعينة تقييم النشاط المناعي ضد المستضدات المختلفة لأنواع Borrelia المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون لاستجابات IgG و IgM المضادة للأمراض دورات زمنية مختلفة للاستنباط أثناء تطور المرض. نوضح هنا تطوير مقايسة مناعية متعددة الإرسال من مراسلين لها فائدة في تحديد الاستجابة المناعية الخاصة بالبوريليا في عينات المصل البشري من خلال تقييم كل من النشاط المناعي IgG و IgM في وقت واحد ضد المستضدات البكتيرية المختلفة في نفس التفاعل جيدا. يحتفظ نهج المراسل المزدوج هذا بالأداء التحليلي لأساليب المراسل الفردي مع الحفاظ على الوقت والموارد وتقليل متطلبات حجم العينة. يسمح هذا الفحص بشكل أساسي بمضاعفة المعلومات المصلية التي يتم إنشاؤها من عينة الدم في نصف الوقت.

Introduction

داء لايم هو أكثر الأمراض المعدية المنقولة بالقراد شيوعا في المناخات المعتدلة في نصف الكرة الشمالي1. وهو ناتج عن بكتيريا spirochete من جنس Borrelia ، مع خمسة مسببات الأمراض البشرية المعروفة التي تختلف في التوزيع الجغرافي2. أنواع بوريليا المسببة للأمراض الرئيسية في أوروبا هي B. afzelii و B. garinii ، مع B. burgdorferi s.s. و B. spielmanii و B. bavariensis متورطة بشكل أقل. في أمريكا الشمالية ، B. burgdorferi s.s. هو العامل المسبب الوحيد لمرض لايم2،3. تنتقل مسببات الأمراض Borrelia من قبل أعضاء جنس القراد Ixodes ، مع انتقال يمكن أن يحدث في غضون 24 ساعة من لدغة القراد4.

عادة ما يتم تشخيص داء لايم من خلال الأعراض السريرية ويتم تأكيده لاحقا بواسطة الأمصال. في كل من أوروبا وأمريكا الشمالية ، توصي الإرشادات التشخيصية بسلسلة اختبار من خطوتين تتكون من مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) مع لطخة مناعية منعكسة لتقييم استجابة الأجسام المضادة ضد مستضدات بوريليا المحددة1،5،6،7،8،9. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يفتقر إلى الحساسية وهو دون المستوى الأمثل ، لا سيما في المرحلة المبكرة من العدوى عندما يكون التحويل المصلي غير مكتمل ويكون عيار Borrelia IgG و IgM منخفضا جدا6.

تعمل المقايسات المناعية المتعددة على تحسين المقايسات المناعية التقليدية التي تقيس هدفا واحدا فقط في كل مرة ، ويمكنها في وقت واحد تقييم استجابات النمط المتماثل للأجسام المضادة المتعددة مقابل واحد أو أكثر من المستضدات10،11،12. تقتصر المقايسات مثل ELISAs على تحديد وقياس مادة تحليلية واحدة لكل تفاعل ، في الحالة الحالية إما تعميم IgG أو IgM المستحث ضد مستضد بكتيري واحد بعد الإصابة بالبوريليا. يوضح هذا التقرير استخدام تقنية التنميط التحليلي القائمة على الخرز لتطوير مقايسة مناعية متعددة الإرسال تكتشف في نفس الوقت كلا من الأجسام المضادة IgG و IgM ضد أي من مستضدات Borrelia المختارة هنا في عينات المصل البشري. اخترنا أربعة مستضدات تغطي معا أكثر أنواع بوريليا المسببة للأمراض شيوعا في أوروبا (B. غاريني ، ب. أفزيلي ، ب. بورغدورفيري س.) وأمريكا الشمالية (B. burgdorferi s.s.) (الجدول 1) 2,3. وهذا يسمح بتحديد مسببات الأمراض بشكل حاسم والقدرة على تمييز النشاط المناعي المبكر IgM ولاحقا الأكثر متانة في عينات المرضى.

النمط المتماثل المستهدفقناة المراسلمستضدأنواع بوريلياوترتركيز اقتران المستضد
الغلوبولينبىأوسب سيب. غاريني200475.0 ميكروغرام / 106 حبات
IgGBV421VlsEب. بورغدورفيري س. سب 311.25 ميكروغرام / 106 حبات
IgGBV421دبباب. بورغدورفيري س. س.ZS710.0 ميكروغرام / 106 حبات
IgGBV421دبباب. أفزيليبكو5.0 ميكروغرام / 106 حبات

الجدول 1: مستضدات بوريليا التمثيلية المستخدمة لتطوير مقايسة تعدد الإرسال.

قمنا في البداية بتطوير مقايسة مناعية أحادية البلاغات اكتشفت إما الأجسام المضادة لمستضد بوريليا IgG أو IgM في تفاعلين منفصلين ثم دمجنا هذه المقايسات في مقايسة متعددة الإرسال مزدوجة المراسل تقيس كلا النمطين المتماثلين للأجسام المضادة في نفس خليط التفاعل. تقترن الخرزات المغناطيسية بمستضد مستهدف ممرض مهم ، ثم يتم تحضينها بعينات مصل المريض. يتعرف المستضد المقترن بالخرزة على كل من IgG و IgM المنتشرين في المصل الذي يتم إنشاؤه في استجابة مناعية ضد مستضد مسببات الأمراض. يتم تحديد خصوصية الفحص IgG مقابل IgM من خلال اختيار جسم مضاد ثانوي يرتبط إما ب IgG أو IgM ، ولكل منهما إشارة فلوروفور مميزة مرتبطة بالجسمين المضادين الثانويين. يتم الكشف عن كل إشارة فلورية في إحدى قناتي Reporter للأداة (أي المراسل المزدوج) التي تحتوي على ليزر إثارة مختلف والتقاط انبعاث خاص بالفلوروفور الفردي المستخدم للكشف إما IgG أو IgM (هنا Brilliant Violet 421 أو phycoerythrin ، على التوالي). تحدد قناة تصنيف الأداة الصبغة المرمزة بالألوان المتأصلة في مجموعات الخرز المختلفة. وبالتالي ، يمكن إقران المستضدات المستهدفة المتعددة بخرز مصبوغ بشكل مختلف ، ويتم خلط مجموعات الخرزات معا واستخدامها لإجراء تقييم شامل للتفاعل المناعي المتنوع المضاد لمسببات الأمراض في عينات المصل. تحدد قناة التصنيف كل مجموعة خرزة فردية (أي مستضد محدد) وتقيس التألق المرتبط ب IgG أو IgM مقابل هذا المستضد. يوفر الفحص المتعدد الناتج الوقت والموارد مقابل الاختبار الكلاسيكي الأقل شمولا ويفهرس بدقة التفاعل المناعي لايم في أحجام عينات محدودة. في حين تم استخدام نهج مماثل للمراسل المزدوج سابقا لتصنيف الاستجابات المناعية في أمراض أخرى مثل عدوى SARS-CoV-213 ، يفصل هذا التقرير تطبيق تقنية مقايسة الفلورسنت المتعدد لتوصيف النشاط المناعي في داء لايم.

Protocol

تم استلام الموافقة المناسبة من مجلس المراجعة المؤسسية / لجنة الأخلاقيات لاستخدام عينات المصل البشري في هذه السلسلة التجريبية. كانت العينات عبارة عن مواد متبقية مجهولة المصدر من دراسة وطنية ألمانية للانتشار المصلي ل SARS-CoV-214. تم منح الموافقة على استخدام العينات البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في هانوفر ، ألمانيا (9086_BO_S_2020). تم استخدام ما مجموعه 21 عينة مصل بشرية في الدراسة الحالية.

1. الموافقة الأخلاقية على استخدام العينات البشرية

  1. الحصول على الموافقات الأخلاقية المناسبة لاستخدام العينات البشرية.

2. الكواشف والمعدات

  1. عينات المصل البشري: إجراء التحقق من صحة الفحص الفني ومراقبة الجودة باستخدام عينات المصل من الأشخاص الذين تم تشخيصهم سابقا بداء لايم أو من الحالة المناعية السلبية للبوريليا المثبتة 12,14.
  2. أجهزة مراسل واحد. استخدم أداة مراسل واحد ذات قناتين (جدول المواد) لتطوير الفحص الأولي والتحقق من الصحة الفنية.
    ملاحظة: يحتوي نظام المراسل الفردي على جهازي ليزر: 1) يحدد ويحدد التألق الخاص بمجموعة الخرزات لتمييز مجموعات الخرز المختلفة ، إذا تم استخدامه (قناة التصنيف) ، و 2) يكتشف ويحدد مضان phycoerythrin (PE) المرتبط بالخرز (قناة المراسل ؛ إثارة 532 نانومتر ، انبعاث "برتقالي" 565-585 نانومتر). وبالتالي ، يمكن تحليل فئة واحدة فقط من النمط المتماثل للأجسام المضادة (على سبيل المثال ، إما IgG أو IgM) في وقت واحد باستخدام قناة مراسل واحدة.
    1. قم بإجراء دراسات التحقق الأولية لتقييم Anti-Borrelia IgG و IgM بشكل منفصل ، بتنسيق 96 بئرا لمراسل واحد يستخدم كواشف الكشف التي تحمل علامة PE لفئتي الأجسام المضادة.
      ملاحظة: يقوم الفحص الحالي بتقييم IgGs المنتشرة الخاصة بمستضد Borrelia VlsE ونوعين مختلفين من DbpA ، وتعميم IgM الخاص بالمستضد OspC ، كأمثلة تمثيلية. يمكن توسيع الفحص لتقييم النشاط المناعي للمصل ضد مستضدات أخرى مضادة للبوريليا ، حسب الرغبة12.
  3. أجهزة المراسل المزدوج. استخدم أداة مراسل مزدوج ثلاثية القنوات (جدول المواد) تسمح بتحليل IgG / IgM المتزامن في نفس التفاعل ، من أجل التطوير والتحقق الفني من مقايسة IgM / IgG المزدوجة (مفصلة أدناه). تحتوي هذه الأداة على 3 قنوات للكشف عن التألق الكلي ، منها 2 قنوات مراسلة تقوم بتقييم الإشارات المستهدفة المرتبطة ب Ig.
    ملاحظة: يحتوي نظام المراسل المزدوج على ثلاثة ليزر: 1) يحدد ويحدد التألق الخاص بمجموعة الخرزات (قناة التصنيف) ؛ 2) يكتشف ويحدد مضان phycoerythrin (PE) الخاص بالهدف (قناة المراسل 1 ؛ إثارة 532 نانومتر ، انبعاث "برتقالي" 565-585 نانومتر) ، و 3) يقيم مضان Brilliant Violet 421 (BV421) الخاص بالهدف لتحليل الهدف الثاني (قناة المراسل 2 ؛ إثارة 405 نانومتر ، انبعاث "أزرق" 421-441 نانومتر). يتوافق نظام المراسل المزدوج مع كل من تنسيقات فحص لوحة المعايرة الدقيقة ذات 96 بئرا و 384 بئرا (المناولة شبه الآلية). يظهر مخطط الفحص العام في الشكل 1. خطوات البروتوكول مفصلة أدناه.

3. اقتران المستضد

  1. قم بإقران مستضدات Borrelia بكرات مجهرية مغناطيسية وكربوكسيلية وفلورية مرمزة بالألوان 6.5 ميكرومتر (حبات; جدول المواد) باستخدام كيمياء 1-إيثيل-3- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كاربوديميد (EDC) / سلفو-N-هيدروكسي سكسينيميد (sNHS).
    ملاحظة: يمكن العثور على وصف مفصل في المرجع11والمرجع12. أوجد تركيز اقتران كل مولد ضد في الجدول 1. يجب تخزين الخرزات المقترنة في الظلام عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. يتم تفصيل جميع المخازن المؤقتة المستخدمة في تفاعلات الاقتران والكشف في المواد التكميلية.

4. إجراء الفحص: الفحص المصلي IgG أو IgM لمراسل واحد: تنسيق 96 بئرا

  1. قم بتخفيف العينة في خطوتين (خطوتان ، كلاهما في 96 لوحة بئر ؛ تخفيف عينة المصل 200 ضعف في محلول الفحص).
    ملاحظة: تركيبة المخزن المؤقت للفحص عبارة عن خليط 1: 4 من Low Cross Buffer: PBS يحتوي على 1٪ (وزن / حجم) من ألبومين مصل الأبقار. يضاف Tween-20 إلى الخليط إلى تركيز نهائي قدره 0.05٪ (v / v).
    1. خطوة تخفيف العينة 1: امزج 5 ميكرولتر من عينة المصل مع 120 ميكرولتر من محلول الفحص (تخفيف 25 ضعفا).
    2. خطوة تخفيف العينة 2: قم بتخفيف تخفيف العينة بمقدار 25 ضعفا بالإضافة إلى 8 أضعاف عن طريق خلط 10 ميكرولتر من التخفيف مع 70 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص لجعل تخفيف العينة النهائي 200 ضعف.
  2. مزيج حبة مغناطيسية تخفيف
    1. تحضير مزيج من الخرز يحتوي على 1.0 × 106 حبات / مل لكل حبة (أي لكل مستضد مستهدف فريد).
    2. قم بتخفيف مزيج الخرزة المحضر 25 ضعفا في محلول الفحص لجعل تركيز الخرزة النهائي في هذا المعلق المخفف الآن 4 × 104 حبات / مل لكل حبة (أي لكل مستضد مستهدف فريد).
  3. حضانة عينة المصل مع الخرز
    1. ماصة 25 ميكرولتر من معلق حبات متعددة الإرسال مقترن مخفف (يحتوي على 4.0 × 104 حبات / مجموعة / مل) في الآبار المخصصة للوحة عيار نصف مساحة 96 بئرا (جدول المواد).
    2. أضف 25 ميكرولتر من عينة المصل المخففة 200 ضعف (من الخطوة 4.1 أعلاه) إلى الآبار المناسبة التي تحتوي على 25 ميكرولتر من معلق الخرز المقترن.
      ملاحظة: ينتج عن ذلك تخفيف إضافي بمقدار 2 أضعاف ، وبالتالي فإن التخفيف النهائي لعينة المصل في البئر هو 400 ضعف وعدد الخرزات النهائي هو 1000 حبة / مجموعة خرزة / تفاعل 50 ميكرولتر.
    3. قم بتغطية لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا بختم صفيحة دقيقة (رقائق لاصقة أو أغطية ألواح بلاستيكية).
    4. احتضان لوحة لمدة 2 ساعة عند 20 درجة مئوية ، عند 750 دورة في الدقيقة على شاكر لوحة.
  4. غسل حبة
    1. قم بإزالة لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا من شاكر اللوحة وقم بإزالة ختم اللوحة اللاصقة بعناية.
    2. ضع لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا في غسالة الألواح.
    3. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام مخزن مؤقت للغسيل سعة 100 ميكرولتر (1× PBS + 0.05٪ v / v Tween 20) باستخدام غسالة الألواح المغناطيسية الآلية.
  5. أعد تعليق الخرز المغسول في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل ، وقم بتغطية اللوحة بورق لاصق أو غطاء لوحة بلاستيكية ، وهز اللوحة على شاكر لوحة لمدة 1 دقيقة عند 20 درجة مئوية عند 1000 دورة في الدقيقة.
  6. تقسيم الخرز المغسول
    1. قم بإزالة لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا من شاكر اللوحة وقم بإزالة ختم اللوحة اللاصقة بعناية.
    2. امزج التفاعلات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل خمس مرات وانقل 50 ميكرولتر من كل حجم تفاعل 100 ميكرولتر إلى كل من لوحتي تفاعل جديدتين من 96 بئرا ، لوحة واحدة للكشف عن IgG والأخرى لاكتشاف IgM.
  7. الكشف عن الأجسام المضادة / حضانة الكاشف
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، تم تحضين حبات مستهدفة مقترنة بالمستضد مع عينات مصل لاستخراج الأجسام المضادة المنتشرة في المصل (إن وجدت) التي تتفاعل مع المستضد (المستضدات). تم تقسيم الحبيبات المتفاعلة مع الغلوبولين المناعي المرتبط إلى لوحين ، ويتم الآن اكتشاف IgG و IgM وقياسهما في لوحاتهما المنفصلة باستخدام أجسام مضادة ثانوية خاصة بالنمط المتماثل مع ملصق PE. معالجة لوحة متداخلة لمدة 20 دقيقة.
    1. نضح المادة الطافية من الآبار التي تحتوي على خرز مغناطيسي باستخدام غسالة الألواح المغناطيسية.
    2. لكل لوحة ، قم بعمل مزيج كاشف الكشف عن Ig المناسب (إما مضاد IgG أو مضاد IgM) ، يحتوي على IgG للماعز المترافق PE المضاد للإنسان (3 ميكروغرام / مل) أو الحمار المترافق PE المضاد للإنسان IgM (5 ميكروغرام / مل) في المخزن المؤقت للفحص. لكل بئر يحتوي على حبة ، يتم استخدام 30 ميكرولتر من كاشف الكشف. قم بإعداد أحجام كاشف الكشف IgG و IgM الكافية لآبار التفاعل ، مع وجود كمية إضافية كافية لاستيعاب خسائر السحب.
    3. ماصة 30 ميكرولتر من كاشف الكشف عن IgG في كل بئر تحتوي على حبات متفاعلة على لوحة IgG وتغطي لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا بختم صفيحة دقيقة.
    4. ماصة 30 ميكرولتر من كاشف الكشف عن IgM في كل بئر تحتوي على حبات متفاعلة على لوحة IgM وتغطي لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا بختم صفيحة دقيقة.
    5. احتضان لمدة 45 دقيقة عند 20 درجة مئوية بينما رج عند 750 دورة في الدقيقة على لوحة الخفق.
  8. غسل حبة
    1. قم بإزالة لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا من شاكر اللوحة وقم بإزالة ختم اللوحة اللاصقة بعناية.
    2. ضع لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا في غسالة الألواح المغناطيسية.
    3. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام مخزن مؤقت للغسيل سعة 100 ميكرولتر باستخدام غسالة الألواح المغناطيسية.
  9. أعد تعليق الخرز في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل.
  10. تحليل النتائج على أداة المراسل الواحد.
    1. قم بتغطية لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا بختم صفيحة دقيقة.
    2. هز لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا لمدة 3 دقائق عند 20 درجة مئوية ، عند 1000 دورة في الدقيقة على شاكر اللوحة.
    3. انقل لوحة التفاعل ذات 96 بئرا من شاكر اللوحة وضعها في أداة تحليل تدفق مراسل واحد (جدول المواد).
    4. لكل عينة ، قم بتحليل متوسط كثافة الفلورسنت (MFI) باستخدام إعدادات الجهاز التالية: حجم الامتصاص = 80 ميكرولتر ، العدد = 50 / عدد حبة ، المهلة = 60 ثانية ، البوابة = 7,500-15,000) 12,13.

5. إجراء الفحص: الفحص المصلي IgG و IgM ثنائي المراسل: تنسيق 96 بئرا

  1. تخفيف العينة (خطوتان ، كلاهما في 96 لوحة بئر ؛ تخفيف عينة المصل 200 ضعف في مخزن المقايسة)
    1. خطوة تخفيف العينة 1: امزج عينة مصل 5 ميكرولتر مع مخزن مؤقت للفحص 120 ميكرولتر (تخفيف 25 ضعفا).
    2. خطوة تخفيف العينة 2: قم بتخفيف مخففات العينة 25 ضعفا بمقدار 8 أضعاف إضافية عن طريق خلط 10 ميكرولتر من التخفيف الأول (عينة مخففة 25 ضعفا من القسم 5.1.1) مع مخزن مؤقت للمقايسة 70 ميكرولتر (تخفيف 8 أضعاف) ، للحصول على تخفيف العينة النهائي إلى 200 ضعف.
  2. مزيج حبة مغناطيسية تخفيف
    1. قم بإعداد مزيج من الخرز يحتوي على 1.0 × 106 حبات مستهدفة مقترنة بمستضد / مل لكل مجموعة حبات (أي لكل مستضد مستهدف فريد).
      ملاحظة: في هذه السلسلة التجريبية ، قمنا بتقييم كل من النشاط المناعي IgG و IgM مقابل أربعة مستضدات بوريليا فريدة في كل تفاعل.
    2. تمييع مزيج حبة أعدت 50 أضعاف في العازلة المقايسة. تركيز الخرزة في هذا المعلق المخفف هو الآن 2.0 × 104 حبات / مل لكل مجموعة حبات.
      ملاحظة: انخفض عدد الخرزات في تفاعل الفحص المزدوج إلى النصف عن ذلك المستخدم في تفاعل المراسل الفردي للسماح بإجراء مقارنة مباشرة بين المقايستين والحفاظ على الموارد ، بعد أن أكدت الدراسات الأولية أن إشارة التألق تم الحفاظ عليها ضمن النطاق الخطي للقياس الكمي عند استخدام نصف عدد الخرزات.
  3. حضانة عينة المصل مع الخرز
    1. ماصة 25 ميكرولتر من معلق حبة الخرز المخفف المستهدف المقترن بالمستضد (يحتوي على 2.0 × 104 حبات / مجموعة / مل) في الآبار المخصصة مسبقا للوحة عيار ميكرو نصف مساحة 96 بئرا. يعتمد العدد الدقيق لآبار التفاعل ووضعها على اللوحة على العدد الإجمالي الذي يحدده المشغل للعينات التي تم اختبارها وما إذا كان سيتم تشغيل الآبار المفردة أو المكررة لكل عينة.
      ملاحظة: سيتم تفاعل الحبيبات المغناطيسية المستهدفة المقترنة بالمستضد مع عينات المصل البشرية. كل من مستضد بوريليا المناعي IgG و IgM ، إذا كانا موجودين في العينات ، سوف يرتبطان ويتجمدان على نفس الحبيبات المقترنة بالمستضد. سيتم بعد ذلك إجراء القياس الكمي للأجسام المضادة الثانوية ل IgG و IgM المرتبطين على نفس الخرزات في نفس التفاعلات ، باستخدام فلوروفورات مختلفة لتحديد IgG و IgM الذي يسمح بتمييزها.
    2. أضف 25 ميكرولتر من المصل المخفف 200 ضعف (من الخطوة 5.1 أعلاه) إلى كل بئر يحتوي على 25 ميكرولتر من معلق حبة الخرز المختلطة الهدف المقترن بالمستضد (الخطوة 5.2).
      ملاحظة: ينتج عن هذا تخفيف إضافي بمقدار 2 أضعاف ، وبالتالي فإن تخفيف عينة المصل النهائي في البئر هو 400 ضعف ، وعدد الخرزات النهائي هو 500 حبة / مجموعة خرزة / تفاعل 50 ميكرولتر.
    3. قم بتغطية لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا بختم صفيحة دقيقة (رقائق لاصقة أو غطاء لوحة بلاستيكية).
    4. احتضان لوحة مع الخرز لمدة 2 ساعة عند 20 درجة مئوية ، عند 750 دورة في الدقيقة على شاكر لوحة.
  4. غسل الخرزة (لإزالة عينة المصل الزائدة)
    1. قم بإزالة لوحة التفاعل ذات 96 بئرا من شاكر اللوحة وقم بإزالة ختم اللوحة اللاصقة.
    2. ضع لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا في غسالة الألواح المغناطيسية.
    3. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام مخزن مؤقت للغسيل سعة 100 ميكرولتر باستخدام غسالة الألواح المغناطيسية.
  5. نضح حجم الغسيل النهائي من الخرز بعد خطوة الغسيل الأخيرة.
  6. كشف الأجسام المضادة (الحضانة - الجزء الأول)
    1. اصنع كاشف الكشف المزدوج IgG و IgM الطازج الذي يحتوي على IgG المضاد للإنسان (1 ميكروغرام / مل) مع IgM المضاد للإنسان (5 ميكروغرام / مل) في مخزن المقايسة. لكل بئر يحتوي على حبة ، يتم استخدام 30 ميكرولتر من كاشف الكشف المزدوج. قم بإعداد أحجام كافية من كاشف الكشف المزدوج IgG و IgM لآبار التفاعل ، مع ما يكفي من الإضافات لاستيعاب خسائر الماصة.
    2. ماصة 30 ميكرولتر من كاشف الكشف المزدوج IgG و IgM في كل بئر مخصص وتغطية لوحة تفاعل 96 بئرا بختم صفيحة دقيقة.
    3. احتضن الطبق لمدة 45 دقيقة عند 20 درجة مئوية أثناء الرج عند 750 دورة في الدقيقة على شاكر اللوحة.
  7. غسل الخرزة (لإزالة الأجسام المضادة للكشف الزائدة)
    1. قم بإزالة لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا من شاكر اللوحة وقم بإزالة ختم اللوحة اللاصقة بعناية.
    2. ضع لوحة التفاعل ذات 96 بئرا في غسالة الألواح المغناطيسية الآلية.
    3. اغسل الخرز ثلاث مرات باستخدام مخزن مؤقت للغسيل سعة 100 ميكرولتر باستخدام غسالة الألواح المغناطيسية الآلية.
  8. نضح حجم الغسيل النهائي من الخرز بعد خطوة الغسيل الأخيرة.
  9. مراسل مقترن بالستربتافيدين (الحضانة - الجزء الثاني)
    1. تمييع الستربتافيدين الطازج المسمى BV421 في محلول الفحص إلى تركيز 0.2 ميكروغرام / مل. لكل بئر يحتوي على حبة ، يتم استخدام 30 ميكرولتر من الستربتافيدين المسمى BV421. قم بإعداد حجم كاف من الستربتافيدين المسمى BV421 لآبار التفاعل ، مع وجود كمية إضافية كافية لاستيعاب خسائر الماصات.
    2. ماصة 30 ميكرولتر من BV421-Streptavidin المخفف في كل بئر تفاعل وتغطية لوحة تفاعل 96 بئر بختم الصفيحة الدقيقة.
    3. احتضن الطبق لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية أثناء الرج عند 750 دورة في الدقيقة على شاكر الطبق.
  10. غسل الخرز (لإزالة BV421-Streptavidin الزائدة)
    1. قم بإزالة لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا من شاكر اللوحة وقم بإزالة ختم اللوحة اللاصقة بعناية.
    2. ضع لوحة التفاعل ذات 96 بئرا في غسالة اللوحة المغناطيسية.
    3. اغسل الخرز ثلاث مرات باستخدام مخزن مؤقت للغسيل سعة 100 ميكرولتر باستخدام غسالة الألواح المغناطيسية الآلية.
  11. أعد تعليق الخرز داخل الآبار إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر في محلول الغسيل.
  12. تحليل النتائج على أداة المراسل المزدوج
    1. قم بتغطية لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا بختم صفيحة دقيقة.
    2. احتضان لوحة التفاعل المكونة من 96 بئرا لمدة 3 دقائق عند 20 درجة مئوية ، عند 1000 دورة في الدقيقة على شاكر الصفيحة.
    3. انقل لوحة التفاعل ذات 96 بئرا من شاكر اللوحة إلى أداة محلل التدفق ثنائي المراسل (جدول المواد).
    4. قم بتقييم متوسط كثافة الفلورسنت للعينة (MFI) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (إعدادات الجهاز: وضع المراسل المزدوج ، حجم الامتصاص = 80 ميكرولتر ، العدد = 50 / عدد حبة ، المهلة = 60 ثانية ، البوابة = 7500-15000).

6. الفحص المصلي IgG و IgM للمراسل المزدوج: تنسيق شبه آلي 384 بئر

  1. قم بإجراء اختبار المراسل المزدوج بتنسيق لوحة 384 بئرا باستخدام خطوات الفحص المفصلة في القسم 5 ، ولكن قم بمعالجة العينات باستخدام روبوت سحب العينات وغسالة الألواح المغناطيسية الآلية (جدول المواد). في شكل 384 بئرا ، هز الألواح أثناء الحضانة والغسيل عند 1450 دورة في الدقيقة ، وقبل قياس التألق ، هز اللوحة لمدة 5 دقائق عند 21 درجة مئوية و 1800 دورة في الدقيقة.

النتائج

نظرة عامة تجريبية
يوضح الشكل 1 المخططات العامة لمقايسات بوريليا القائمة على حبة المراسل الواحد والمراسل المزدوج. بالنسبة لأهداف الأجسام المضادة الفردية (أي IgG أو IgM) المتولدة ضد مستضد بوريليا معين ، تم تقييم كلتا فئتي الأجسام المضادة بشكل مستقل في عينات مصل الإنسان باستخدام جسم مضاد للنمط المتماثل المترافق PE للإبلاغ. بالنسبة للمقايسة المزدوجة للمراسل مع التحليل المتزامن لكل من التفاعل المناعي IgG و IgM ، استخدم اكتشاف IgG الخاص بمستضد Borrelia نظام مراسل Streptavidin (مضان أزرق) مضاد للإنسان ، مع الاحتفاظ بالمراسل المترافق PE (مضان برتقالي) للكشف عن IgM. يشبه سير عمل مقايسة المراسل المزدوج مقايسة المراسل الفردي ، باستثناء حضانة نظام الكشف الإضافية لمدة 30 دقيقة مع كاشف الكشف عن مضان القناة الثانية BV421-Streptavidin.

figure-results-912
الشكل 1: رسم تخطيطي لمقايسات بوريليا القائمة على حبة المراسل الواحد والمراسل المزدوج. (أ) تم استخدام أداة المراسل الواحد لتطوير والتحقق من صحة الفحص القائم على الخرزة الذي يميز إما Anti-Borrelia IgG أو IgM بشكل فردي ، وكلاهما باستخدام ملصق مراسل الفلورسنت phycoerythritin (PE) الذي يصدر إشارة في الأطياف "البرتقالية". يمكن إقران أي مستضد بوريليا مرغوب فيه بالخرز واستخدامه لالتقاط وتحديد إما IgG أو IgM الموجود في عينات المصل. هناك حاجة إلى مقايستين مناعيتين منفصلتين لتقييم كل من تفاعل IgG و IgM ضد مستضد معين. (ب) سمح نظام المراسل المزدوج بالتحليل المتزامن لعينات المصل لكل من الأجسام المضادة IgG و IgM ضد أي مستضد بوريليا فردي في نفس البئر. يستخدم هذا النهج نفس الجسم المضاد للكشف المترافق PE لاستهداف Anti-Borrelia IgM ، ولكنه يحل محل اكتشاف IgG من نظام قائم على PE إلى استخدام جسم مضاد للكشف الأولي biotinylated و Streptavidin المسمى BV421 (باعث "أزرق") يحتاج إلى خطوة حضانة إضافية لنظام الكشف لمدة 30 دقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

دقة الفحص الداخلي
أظهر تحليل ارتباط سبيرمان لثلاثة مستضدات بوريليا تمثيلية (الشكل 2) استنساخا موحدا لقيم MFI عند اكتشاف الأجسام المضادة المضادة للبوريليا الموجودة في الأمصال البشرية.

figure-results-2525
الشكل 2: دقة الفحص الداخلي لمقايسة بوريليا المزدوجة القائمة على الخرزة. أظهر تحليل ارتباط سبيرمان دقة عالية داخل الفحص للمقايسة المزدوجة عندما تم استخدام نظام الكشف عن PE للكشف عن الأجسام المضادة IgM الخاصة ببوريليا (A) وتم استخدام نظام الكشف BV421 للكشف عن الأجسام المضادة IgG الخاصة ببوريليا (B ، C). تم تحليل ما مجموعه 21 عينة مصل في نسختين باستخدام إجراء شبه آلي. في كل رسم بياني ، تم رسم إشارات MFI ضد بعضها البعض وتحليلها عن طريق الانحدار الخطي. يشير المنحنى الخطي (x = y) الموضح كخط أحمر متقطع إلى إشارات MFI متطابقة لأنظمة الكشف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الدقة بين المقايسة
وقد لوحظت قابلية جيدة للفحص مع الفحص المزدوج للتقرير. أظهرت مخططات Levey-Jennings (الشكل 3) مع قيم MFI لعينة مراقبة الجودة التي تم قياسها على مدى سبع جولات مستقلة الدقة العالية بين المقايسة لجميع المستضدات التمثيلية. كان متوسط النسبة المئوية لمعامل الاختلاف (CV٪ = الانحراف المعياري / المتوسط × 100) لمستضدات بوريليا التمثيلية الأربعة 5.3٪.

التخفيف الخطي
نظرا لأن الفحص الأصلي للمراسل الفردي والمقايسة المزدوجة الجديدة تستخدم منصات قياس خلوي مختلفة للتدفق ، فقد قارنا مخرجات التألق المتوسطة لنفس المقايسة المناعية للمستضد بين أداتي قياس التدفق الخلوي (الشكل 4). قدمت سلسلة تخفيف العينة منحنيات تخفيف خطية لكل من تقييم IgM و IgG ، مع توازي جيد لاستجابة الجرعة بين الأدوات من خلال نطاق التخفيف الكامل الذي تم تقييمه (1: 100-1: 12,800).

figure-results-4383
الشكل 3: دقة الفحص الداخلي لمقايسة بوريليا المزدوجة القائمة على الخرز. لتقييم دقة الفحص البيني ، تم تحليل استجابة الأجسام المضادة IgM (A) و IgG (B-D) الخاصة ببوريليا لعينة مراقبة الجودة على مدى سبع جولات مستقلة ، في آبار مكررة في كل مرة. تم إجراء المقايسات يدويا. تم رسم قيم MFI في مخطط ليفي جينينغز. الخط الأخضر يعطي متوسط جميع القيم. يشير خطان متقطعان أحمران إلى نطاق التسامح لدقة الفحص البيني. تم حساب ذلك من القيمة المتوسطة ± 2.5 ضعف الانحراف المعياري (2.5 S.D.). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5244
الشكل 4: خطي التخفيف لمقايسة بوريليا القائمة على حبة المراسل المزدوج. عند تخفيفات العينة من 100 ضعف إلى 12800 ضعف، كانت منحنيات التخفيف لكل من اكتشاف IgM (A) واكتشاف IgG (B) متشابهة عند إجراؤها يدويا باستخدام أداة المراسل الواحد وأداة المراسل المزدوج. في جميع التخفيفات المختبرة ، كانت قيم MFI أعلى قليلا باستخدام أداة المراسل الفردي (الرموز الحمراء) من أداة المراسل المزدوج (الرموز الزرقاء). تظهر منحنيات التخفيف لمستضدات تمثيلية 2 ، حيث تمثل كل نقطة تخفيف متوسط قياس الآبار الثلاثية ذات الانحراف المعياري (SD *) المشار إليها بأشرطة الخطأ. ملاحظة: SDs الصغيرة غير مرئية على هذا النطاق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المواد التكميلية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

يسلط هذا التقرير الضوء على تطوير اختبار منافي Borrelia قائم على الخرز ثنائي التقارير والذي يحدد بشكل متكرر وحساس النشاط المناعي المضاد للبوريليا في عينات المصل12. يمكن التمييز بين أنواع Borrelia المسببة للأمراض المختلفة التي تسبب مرض لايم عن طريق عدم تجانس المستضد الخاص بالمتغيرات6،7،8،9. يقوم الفحص متعدد الإرسال بشكل متزامن بتقييم النشاط المناعي المضاد للبوريليا بوساطة IgG و IgM داخل نفس بئر التفاعل ، وبالتالي الحفاظ على الكواشف والعمالة ومواد العينة اللازمة لإجراء مقايستين مفردتين بشكل منفصل. قد تسمح مقارنة استجابات IgM و IgG بمرور الوقت بتتبع أفضل لتطور المرض حيث يحدث التحويل المصلي من IgM إلى IgG بعد الإصابة6.

يستخدم نظام المراسل المزدوج نظامين مختلفين للكشف عن الأجسامالمضادة 13,15. أظهرت التجارب ذات الصلة عدم وجود تفاعل متقاطع كبير يمكن اكتشافه بين أنظمة الكشف عن Borrelia anti-IgM و Anti-IgG عندما تم تحليل فئتي الأجسام المضادة معا في نفس بئرالتفاعل 12. بالنظر إلى تقارب الارتباط المنخفض للأجسام المضادة IgM مقابل IgG16,17 ، اخترنا جسما مضادا للكشف عن PE مترافقا للكشف عن IgM (أول قناة مراسل لأداة المراسل المزدوج) لأن PE هي واحدة من أقوى الفلوروفورات الباعثة المستخدمة بشكل روتيني في المقايسات المناعية18. لتقييم IgG ، استخدمنا جسما مضادا للكشف عن البيوتينيلات تم إضاءته لاحقا باستخدام الستربتافيدين المترافق BV421 (قناة المراسل الثانية للأداة)19. على الرغم من خطوة الحضانة الإضافية البالغة 30 دقيقة مقارنة بنظام المراسل الواحد ، فإن نظام المراسل المزدوج ينتج ضعف المعلومات لكل تفاعل. بشكل عام ، يتطلب الفحص المتعدد الإرسال للتقرير المزدوج وقتا تراكميا ومدخلات مادية أقل من تشغيل مقايستين لتقرير واحد.

تم تجسيد الأداء القوي والاستقرار لمقايسة Borrelia متعددة الإرسال من خلال قابلية عالية للتكرار في دراسات الدقة داخل وبين المقايسة ، ومن خلال إظهار خطية التخفيف وتوازي التخفيف على نطاق واسع من تركيزات العينة لكل من تقييم IgG و IgM. لاحظنا مستويات انبعاث مضان مطلقة أعلى لنفس الفلوروفورات باستخدام أداة أحادية القناة مقابل نظام ثنائي القناة (≈1.7× أعلى مع PE) ، ويعزى ذلك إلى الاختلافات في البصريات وإعدادات المعايرة بين الجهازين (الشكل 4). ومع ذلك ، ظلت منحنيات انبعاث التألق مع كلا الفلوروفورين ضمن النطاق الخطي لكلا الجهازين عند أقصى درجات تخفيف العينة العالية والمنخفضة ، ولم يؤثر أي تباين في التألق المطلق المقاس على تصنيف حالة التعرض لبوريليا . 12

تتمثل الميزة الرئيسية لمقايسة Borrelia multiplex القائمة على الخرزة في السهولة التي يمكن بها تعديل الفحص أو توسيعه لتقييم التحليلات المختلفة أو الإضافية ، على سبيل المثال ، للكشف عن الأجسام المضادة ضد مستضدات أنواع Borrelia الأخرى. تحتوي مجموعات الخرزات المغناطيسية xMAP على مجموعات صبغ مختلفة يمكن تمييزها في قناة تصنيف الأداة ويمكن تنفيذها نظريا في مقايسات متعددة يمكنها تقييم ما يصل إلى 500 تحليل فريد في نفس الوقت داخل نفس العينة. بينما تسلط الدراسة الحالية الضوء على أربعة مستضدات بوريليا تمثيلية لإثبات وظيفة الفحص واستقراره ومقارنة نظام المراسل الفردي والمزدوج ، يستجوب الفحص النهائي ثمانية مستضدات يمكنها معا تحديد جميع مسببات الأمراض الخمسة ذات الصلة سريريا المنتشرة في جميع أنحاء أوروبا وأمريكا الشمالية12.

يمكن الحصول على أداء عالي الإنتاجية باستخدام لوحات معايرة دقيقة قياسية ذات 384 بئرا بتنسيق فحص شبه آلي. يسمح توافق الفحص والأداة مع كل من لوحات 96 و 384 بئرا باستخدام مقايسة Borrelia multiplex كأداة فحص فعالة لتحليل مجموعات العينات الكبيرة بسرعة ، مثل الدراسات الوطنية20. يظل الأداء اليدوي للفحص ممكنا لمجموعات العينات الأصغر باستخدام لوحات أصغر من 96 بئرا.

تشمل قيود الدراسة التقييم المقارن لعدد قليل فقط من أهداف النشاط المناعي Borrelia في عدد صغير من عينات المصل البشري. ومع ذلك ، أكدت الدراسة الأصلية أنه تم الحفاظ على أداء الفحص لكل من IgG و IgM عند تحليل ثمانية مستضدات من جميع أنواع Borrelia الخمسة المعروفة ضمن مجموعة عينات أكبر12. أيضا ، يمكن لأداة المراسل المزدوج تقييم نمطين متماثلين من الأجسام المضادة فقط في وقت واحد داخل كل تفاعل ، لذا فإن التنميط الكامل للنمط المتماثل سيتطلب إجراء تفاعلات فحص إضافية13.

في الختام ، يفصل هذا التقرير الاندماج الناجح وتحويل المقايسات المناعية أحادية المراسل القائمة على الخرز إلى مقايسات مزدوجة المراسل يمكنها في نفس الوقت تقييم الأجسام المضادة IgG و IgM الخاصة ببوريليا في عينات المصل البشري. يوفر هذا النهج المشترك إجمالي الوقت والمواد ومدخلات العمل لتوليد نفس حجم البيانات مثل مقايستين مستقلتين لتقرير واحد. يمكن توسيع نطاق الفحص المتعدد من 96 بئرا إلى تنسيق لوحة معايرة دقيقة 384 بئرا ويمكن أن يكون شبه آلي باستخدام الألواح الآلية وأجهزة معالجة السوائل ، مما يجعله مناسبا للتطبيقات عالية الإنتاجية مثل المسوحات السكانية الكبيرة. أثبتت أنظمة الفحص المزدوج القائمة على الخرز سابقا فائدتها في تقييم ، على سبيل المثال ، الاستجابات المناعية لمسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية الأخرى13،21 ، وتقييم استجابات الأجسام المضادة الخيفية ضد حوامل HLA في زرع الأعضاء22 ، واستكشاف آليات أمراض المناعة الذاتية23. فصل التقرير الحالي استخدام تقنية تعدد الإرسال لتحديد التعرض لمسببات الأمراض Borrelia التي تسبب مرض لايم ، كمثال على كيفية قيام المختبرات بتكييف هذا النهج لاستكشاف آليات المناعة المعقدة في أمراض متنوعة.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا التقرير من قبل Luminex (أوستن ، تكساس). يشكر المؤلفون ماثيو سيلفرمان دكتوراه (حلول النشر الطبية الحيوية ، مدينة بنما ، فلوريدا ؛ mattsilver@yahoo.com) للمساعدة في التحرير التحليلي والعلمي. يشكر المؤلفون أيضا هارالد كلاين وكريستوف فون إيتشل شترايبر من tgcBIOMICS GmbH (بينجن ، ألمانيا) لتوفير مستضدات بوريليا المستخدمة في الدراسة. تم الحصول على عينات مصل بشرية للتحقق من صحة الفحص الفني ومراقبة الجودة من: 1) دراسة الانتشار التسلسلي والمتعدد على الأجسام المضادة ضد SARS-CoV-2 في ألمانيا عبر قسم علم الأوبئة ، مركز هيلمهولتز لأبحاث العدوى ، براونشفايغ ، ألمانيا. و 2) قسم طب الأعصاب ، Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (رودويش ، ألمانيا). تم منح الموافقة على استخدام العينات البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في هانوفر ، ألمانيا (9086_BO_S_2020).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies and Detection ReagentsSourceCatalog Number
Biotinylated Goat Anti-Human IgGJackson ImmunoResearch (Dianova)109-066-098 
Brilliant Violet 421-StreptavidinBD Biosciences563259
Donkey Anti-Human IgM Jackson ImmunoResearch (Dianova)709-116-073
Borrelia AntigenstgcBIOMICS (Bingen, Germany)
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)Thermo Scientific Pierce77149 ProteoChem (100 mg)
10x PBSFisher ScientificBP399-4
BSACarl RothT844.3
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer)Carl Roth4256.2
Na2HPO4Carl Roth4984.1
ProClin300Sigma48914-U
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)Thermo Scientific Pierce24510 (500 mg)
Triton X-100Thermo Scientific85111
Instrumentation and Ancillary Lab SuppliesSource
384-well plateCorning, Cat# 3570
96-well deep-well platesThermoFisher Scientific, Cat# 95040450
96-well half-area plates Corning, Cat# 3690
BioTek 405 TS Plate WasherBioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
BioTek MultiFlo FX Plate WasherBioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes)ThermoFisher, Cat# 12320D
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument)Luminex Corp., Austin, TX
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates) ThermoFisher, Cat# A31508
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads)Luminex Corp., Austin, TX
SmartBlock PlatesEppendorf, Cat# 5363000039
ThermoMixer CEppendorf, Cat# 5382000015
ThermoTopEppendorf, Cat# 5308000003
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument)Luminex Corp., Austin, TX

References

  1. Stanek, G., Strle, F. Lyme borreliosis-from tick bite to diagnosis and treatment. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 233-258 (2018).
  2. Stanek, G., Wormser, G. P., Gray, J., Strle, F. Lyme borreliosis. The Lancet. 379 (9814), 461-473 (2012).
  3. Rizzoli, A., et al. Lyme borreliosis in Europe. Eurosurveillance. 16 (27), 19906 (2011).
  4. Cook, M. J. Lyme borreliosis: a review of data on transmission time after tick attachment. International Journal of General Medicine. 8, 1-8 (2015).
  5. Strle, F., Stanek, G., Lipsker, D., Jaulhac, B. Clinical Manifestations and Diagnosis of Lyme Borreliosis. Lyme Borreliosis: Biological and Clinical Aspects. , 51-110 (2009).
  6. Wilske, B., Fingerle, V., Schulte-Spechtel, U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 49 (1), 13-21 (2007).
  7. Dessau, R. B., et al. To test or not to test? Laboratory support for the diagnosis of Lyme borreliosis: a position paper of ESGBOR, the ESCMID study group for Lyme borreliosis. Clinical Microbiology and Infection. 24 (2), 118-124 (2018).
  8. Eldin, C., et al. Review of European and American guidelines for the diagnosis of Lyme borreliosis. Médecine et Maladies Infectieuses. 49 (2), 121-132 (2019).
  9. Lantos, P. M., et al. Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America (IDSA), American Academy of Neurology (AAN), and American College of Rheumatology (ACR): 2020 Guidelines for the Prevention, Diagnosis and Treatment of Lyme Disease. Clinical Infectious Diseases. 72 (1), e1-e48 (2021).
  10. Gerritzen, A., Brandt, S. Serodiagnosis of Lyme borreliosis with bead based immunoassays using multiplex technology. Methods. 56 (4), 477-483 (2012).
  11. Embers, M. E., et al. Five-antigen fluorescent bead-based assay for diagnosis of Lyme disease. Clinical Vaccine Immunology. 23 (4), 294-303 (2016).
  12. Häring, J., et al. Borrelia multiplex: a bead-based multiplex assay for the simultaneous detection of Borrelia specific IgG/IgM class antibodies. BMC Infectious Diseases. 22 (1), 859 (2022).
  13. Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
  14. Gornyk, D., et al. SARS-CoV-2 Seroprevalence in Germany. Deutsches Ärzteblatt International. 118 (48), 824-831 (2021).
  15. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. . xMAP Cookbook. , (2022).
  16. Racine, R., Winslow, G. M. IgM in microbial infections: Taken for granted. Immunology Letters. 125 (2), 79-85 (2009).
  17. Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature Reviews Immunology. 10 (11), 778-786 (2010).
  18. Kovaleski, G., et al. Extraction and purification of phycobiliproteins from algae and their applications. Frontiers in Chemistry. 10, 1065355 (2022).
  19. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: A new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry Part A. 81 (6), 456-466 (2012).
  20. Coors, A., et al. Regional seropositivity for Borrelia burgdorferi and associated risk factors: findings from the Rhineland Study, Germany. Parasites & Vectors. 15 (1), 241 (2022).
  21. Gürsoy, M., et al. Salivary IgA and IgG antibody responses against periodontitis-associated bacteria in Crohn's Disease. International Journal of Molecular Science. 24 (3), 2385 (2023).
  22. Argani, H. Anti-HLA Antibody: The role of epitopes in organ transplantation. Experimental and Clinical Transplantation. 17 (Suppl 1), 38-42 (2019).
  23. Laman, J. D., Huizinga, R., Boons, G. J., Jacobs, B. C. Guillain-Barré syndrome: expanding the concept of molecular mimicry. Trends in Immunology. 43 (4), 296-308 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

IgG IgM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved