فحص القنوات الأيونية في الخلايا السرطانية

Summary

يعد الاستهداف الدوائي للقنوات الأيونية نهجا واعدا لعلاج الأورام الصلبة. يتم توفير بروتوكولات مفصلة لتوصيف وظيفة القناة الأيونية في الخلايا السرطانية وفحص آثار معدلات القناة الأيونية على صلاحية السرطان.

Abstract

القنوات الأيونية ضرورية لنمو الخلايا والحفاظ على الاتزان الداخلي الخلوي. يساهم اضطراب وظيفة القناة الأيونية في تطوير مجموعة واسعة من الاضطرابات أو اعتلال القنوات. تستخدم الخلايا السرطانية القنوات الأيونية لدفع تطورها ، وكذلك للتحسن كورم واستيعابها في بيئة دقيقة تضم العديد من الخلايا غير السرطانية. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي الزيادات في مستويات عوامل النمو والهرمونات داخل البيئة المكروية للورم إلى تعزيز تعبير القناة الأيونية ، مما يساهم في تكاثر الخلايا السرطانية وبقائها. وبالتالي ، فإن الاستهداف الدوائي للقنوات الأيونية من المحتمل أن يكون نهجا واعدا لعلاج الأورام الخبيثة الصلبة ، بما في ذلك سرطانات الدماغ الأولية والنقيلي. هنا ، يتم وصف بروتوكولات لتوصيف وظيفة القنوات الأيونية في الخلايا السرطانية وطرق تحليل معدلات القنوات الأيونية لتحديد تأثيرها على صلاحية السرطان. وتشمل هذه تلطيخ خلية (خلايا) لقناة (قنوات) أيونية ، واختبار الحالة المستقطبة للميتوكوندريا ، وإنشاء وظيفة القناة الأيونية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية ، وإجراء فحوصات الجدوى لتقييم فعالية الدواء.

Introduction

تعد بروتينات النقل الغشائي ضرورية للتواصل بين الخلايا، وكذلك للحفاظ على الاتزان الداخلي الخلوي. من بين بروتينات نقل الأغشية ، تعمل القنوات الأيونية على دفع نمو الخلايا وتطورها والحفاظ على حالة الخلايا في البيئات الصعبة والمتغيرة. كما تم الإبلاغ عن القنوات الأيونية لدفع ودعم تطور الأورام الصلبة ، سواء بشكل منهجي أو في الجهاز العصبي المركزي (CNS)^1,2. على سبيل المثال ، قنوات KCa3.1 مسؤولة عن تنظيم إمكانات الغشاء والتحكم في حجم الخلية ، وهو أمر مهم في تنظيم دورة الخلية. تم الإبلاغ عن قنوات KCa3.1 المعيبة للمساهمة في الانتشار غير الطبيعي للخلايا السرطانية³. علاوة على ذلك ، قد تساهم القنوات ا....

Protocol

1. القنوات الأيونية المناعية في الخلايا المستزرعة

1. تحضير الخلايا والإعداد التجريبي
   1. الحفاظ على الخلايا كثقافة تنمو بنشاط في قوارير ثقافة 75 سم² . قم بتمرير الخلايا مرة واحدة حتى تصبح متقاربة بنسبة 50٪ -90٪ ، اعتمادا على وقت مضاعفة خط الخلية المستخدم.
      ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام خلايا D283 ، وهي خط خلايا الورم الأرومي النخاعي من المجموعة 3.
   2. اجمع الخلايا من دورق المزرعة في أنبوب طرد مركزي (15 مل أو 50 مل) ، وأضف 2 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA لفصل الخلايا الملتصقة. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). بعد 5 دقائق ، اضغط على القارورة ثلاث إلى خمس مرات للمساعدة في فصل الخلايا. جمع الخلايا في 10 مل من المتوسط مع....

النتائج

أعلاه هي إجراءات مختارة يمكن استخدامها لتوصيف القنوات الأيونية في الخلايا السرطانية. يسلط البروتوكول الأول الضوء على تلطيخ قناة أيونية. كما هو مفصل ، هناك العديد من التحديات عند تلطيخ قناة أيونية أو ، في هذا الصدد ، أي بروتين موجود في الغشاء خارج الخلية. الموضح في الشكل 1 ه?.......

Discussion

التغييرات في وظيفة القناة الأيونية تغير شلالات الإشارات داخل الخلايا ، والتي يمكن أن تؤثر على الأداء العام للخلية. على مدى العقد الماضي ، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن القنوات الأيونية مهمة لنمو الخلايا السرطانية وورم خبيث. الأهم من ذلك ، أن العديد من القنوات الأيونية هي أهداف أساسية للعل.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABS SpectraMax Plate Reader	Molecular Devices	ABS
Accutase	Invitrogen	00-4555-56
Alexa Flor 488	Invitrogen	A32723	Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	100x
B27 Supplement	Gibco	12587-010	Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet	LABCONCO	302381101	Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1606-100
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13-998-211	Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C7902	Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm	Fisher Scientific	12-600-004	Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2	Fisher Scientific	430641U	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well	Fisher Scientific	353046	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well	Fisher Scientific	353072	Cell culture treated
Centrifuge	Eppendorf	EP-5804R	Refrigerated
Corning CoolCell	Fisher Scientific	07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-553-450	Corning brand
D283 Med	ATCC	HTB-185
DABCO Mounting Media	EMS	17989-97
D-Glucose	Sigma Life Sciences	D9434
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650	Cell culture grade
DMEM/F12, base media	Fisher Scientific	11330-032	With phenol red
DMEM/F12, phenol red free	Fisher Scientific	21041-025
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Epidermal Growth Factor	STEMCELL	78006.1
FCCP	Abcam	AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic	Millipore	GF003
GARBA5 Antibody	Aviva	ARP30687_P050	Rabbit Polyclonal
Glutamax	Gibco	35050-061
Glycerol Mounting Medium	EMS	17989-60	With DAPI+DABCO
Hemocytometer	Millipore Sigma
Heparin	STEMCELL	7980
HEPES	HyClone	SH3023701	Solution
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	Solid
ImageJ	Open platform		With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI	EMS	17989-97
KRM-II-08			experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X	Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor	Novus	N276314100U
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M9272	Hexahydrate
Microscope, Confocal	Leica	SP8
Microscope, Light	VWR	76382-982	DMiL Inverted
MTS - Promega One Step	Promega	G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL	Eppendorf	Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL	Eppendorf	Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL	Eppendorf	Z683957
Nest-O-Patch	Heka
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888022	Without vitamin A
Neurobasal-A Medium	Gibco	12348-017	Phenol red free
Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140-050
NOR-QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm	Fisher Scientific	50-998-944	4 inch width
Paraformaldehyde	EMS	RT-15710
PATHCHMASTER	Heka
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Perfusion System	Nanion	4000120
PFA	EMS	RT-15710
Phosphate Bufered Saline	Fisher Scientific	AAJ75889K2	Reagent grade
Poly-D-Lysine	Fisher Scientific	A3890401
Poly-L-Lysine	Sigma Life Sciences	P4707
Port-a-Patch	Nanion	21000072
Potassium Chloride	Sigma Life Sciences	P5405
Primary Antibody	Invitrogen	MA5-34653	Rabbit Monoclonal
Prism	GraphPad
Propofol	Fisher Scientific	NC0758676	1 mL ampule
QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs	VWR	89094-664	Sterile
Slides, 75 x 25 mm	Fisher Scientific	12-544-7	Frosted one side
Sodium Bicarbonate	Corning	25-035-Cl
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070
Synth-a-Freeze Medium	Gibco	R00550	Cryopreservation
TMRE	Fisher Scientific	50-196-4741	Reagent
TMRE Kit	Abcam	AB113852	Kit
Triton X-100	Sigma Aldrich	NC0704309
Trypan Blue	Gibco	15-250-061	Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA	Gibco	25200-072	Solution, 0.25%
Vortex Mixer	VWR	97043-562
Whatman Filter Paper	Fisher Scientific	09-927-841