تصف الدراسة الحالية المنهجيات القائمة على إزالة الخلايا لتصور وقياس ترسب الأنسجة الدهنية العضلية (IMAT) من خلال حجم العضلات السليم ، بالإضافة إلى قياس مقاييس الخلايا الشحمية الفردية التي تتكون منها IMAT.
التسلل الدهني هو تراكم الخلايا الشحمية بين الألياف العضلية في العضلات الهيكلية وهو سمة بارزة للعديد من اعتلالات العضلات واضطرابات التمثيل الغذائي والضمور. سريريا في السكان البشريين ، يتم تقييم التسلل الدهني باستخدام طرق غير جراحية ، بما في ذلك التصوير المقطعي المحوسب (CT) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة). على الرغم من أن بعض الدراسات قد استخدمت التصوير المقطعي المحوسب أو التصوير بالرنين المغناطيسي لتحديد التسلل الدهني في عضلات الفئران ، إلا أن التكاليف والدقة المكانية غير الكافية لا تزال تمثل تحديا. تستخدم طرق الحيوانات الصغيرة الأخرى علم الأنسجة لتصور الخلايا الشحمية الفردية. ومع ذلك ، فإن هذه المنهجية تعاني من تحيز أخذ العينات في علم الأمراض غير المتجانسة. يصف هذا البروتوكول منهجية العرض النوعي والقياس الكمي للتسلل الدهني بشكل شامل في جميع أنحاء عضلة الفأر السليمة وعلى مستوى الخلايا الشحمية الفردية باستخدام إزالة الخلايا. لا يقتصر البروتوكول على عضلات معينة أو أنواع معينة ويمكن توسيعه ليشمل الخزعة البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء تقييمات نوعية وكمية إجمالية باستخدام معدات المختبرات القياسية بتكلفة قليلة ، مما يجعل هذا الإجراء أكثر سهولة عبر مختبرات البحوث.
يعد تراكم الخلايا الشحمية بين الألياف العضلية داخل العضلات الهيكلية سمة بارزة للحالات المتباينة ، من مرض السكري من النوع 2 إلى ساركوبينيا إلى إصابة العضلات والعظام1،2،3،4،5،6،7. يعد التقييم الشامل لهذا النسيج الدهني العضلي (IMAT) أمرا بالغ الأهمية لفهم التسبب في هذه الحالات ، حيث يرتبط ترسب IMAT ارتباطا وثيقا بمقاومة الأنسولين3،8،9،10 وضعف وظيفة العضلات الهيكلية11،12،13،14،15. وعلى الرغم من أن هذه الارتباطات قد لوحظت منذ عقود، فإن الآليات المرتبطة بالفريق ومنشأه لا تزال مجالا للتحقيق المكثف. ويرجع ذلك جزئيا إلى أن معظم الدراسات التي تقيم تسلل الدهون في العضلات الهيكلية قد أجريت على البشر ، حيث تكون التحقيقات الميكانيكية محدودة16,17. ومع ذلك ، في الآونة الأخيرة ، تم استخدام نماذج الحيوانات الصغيرة ، بما في ذلك الفئران ، للمساعدة في تحديد التنظيم الخلوي لتطوير IMAT والإشارةإلى 18،19،20. يهدف هذا العمل إلى توفير أداة جديدة للاستخدام مع النماذج الحيوانية الصغيرة لتصور نوعي وقياس تسلل الدهون في العضلات الهيكلية.
سريريا في السكان البشريين ، يتم تقييم التسلل الدهني باستخدام طرق غير جراحية ، بما في ذلك التصوير المقطعي المحوسب (CT) 6،21 ، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) 16،17،22،23 ، والموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة) 17،24. تحدد تقنيات التصوير هذه عادة منطقة اهتمام محددة (ROI) في العضلة وتكتسب شرائح صورة داخل تلك المنطقة ، على الرغم من استخدام مناهج شاملة أيضا25،26،27. تخضع شرائح الصور هذه للتصنيف النوعي6 ويتم قياسها كميا عبر عتبةالبكسل 28. تم استخدام أساليب مماثلة في الحيوانات سابقا29،30 ؛ ومع ذلك ، فهي مكلفة وتتطلب الوصول إلى أنظمة تصوير الحيوانات الصغيرة. يمثل الدقة المكانية عبر استخدام التصوير المقطعي المحوسب والتصوير بالرنين المغناطيسي أيضا مشكلة كبيرة ، حيث لا يمكنهم تحديد الخلايا الشحمية IMAT من ألياف العضلات الهيكلية داخل الفوكسل ويعتمدون بدلا من ذلك على الفصل الذاتي لمناطق العضلات في المقام الأول ومناطق IMAT في المقام الأول31,32. على هذا النحو ، فإن عدم القدرة على تحديد الأنسجة الدهنية أو العضلية بدقة يقدم أيضا تقديرا غير دقيق للكميات التمثيلية لهذه الأنسجة.
بسبب هذه القيود ، تعتمد التقنيات الحالية لتقييم تسلل الدهون في العضلات الهيكلية في النماذج الحيوانية الصغيرة بشكل شائع على علم الأنسجة كبديل غير مكلف ويمكن الوصول إليه33,34. تسمح إجراءات التلوين القياسية ، بما في ذلك الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) ، والزيت الأحمر O (ORO) ، والتلوين المناعي لعلامات الخلايا الشحمية مثل perilipin ، بالكشف والتصور البسيط للخلايا الشحمية التي تحتوي على تسلل دهني داخل العضلات. ومع ذلك، نادرا ما تكون نهج علم الأنسجة شاملة، وعادة ما يقتصر التقييم النوعي أو الكمي للمعهد الدولي للتنسيق الإداري على قسم واحد34. كما تم استخدام استخراج الدهون لتحديد إجمالي الدهون في العضلات35 ؛ ومع ذلك ، فشلت هذه التقنية في التمييز بين الدهون داخل الخلايا العضلية (IMCL) والأنسجة الدهنية العضلية (IMAT)36. باختصار ، لا تزال المنهجيات الحالية لتصور وقياس الدهون في العضلات محدودة إما بسبب التكاليف المالية أو الكشف المحدد عن IMAT.
هنا ، نصف طريقة مفصلة لتقييم تسلل الدهون في العضلات الهيكلية عن طريق التصور النوعي والقياس الكمي متعدد المقاييس. تستخدم هذه المنهجية تقنية بسيطة لإزالة الخلايا الخلوية تزيل الهياكل الخلوية العضلية ، بما في ذلك IMCL ، ولكنها تحافظ على قطرات الدهون المشتقة من الخلايا الدهنية IMAT الأكبر سليمة. تم نشر التحقق من خصوصية هذه التقنية37 ، بما في ذلك استخدام استخراج الدهون لإظهار استنفاد IMCL مع إزالة الخلايا ، μCT لإظهار الاحتفاظ بنمط IMAT مع إزالة الخلايا ، والأنسجة لإظهار توزيع الحجم المماثل لقطرات الدهون IMAT مقارنة بتلك المحددة مع إزالة الخلايا. بمجرد إزالة الخلايا ، يمكن تلطيخ العضلات بأصباغ قابلة للذوبان في الدهون من أجل التصور النوعي للنمط ومدى تسلل الدهون و / أو التصوير الكمي لقطرات الدهون IMAT الفردية. يمكن بعد ذلك استخراج الأصباغ باستخدام الأيزوبروبانول ، ويمكن استخدام الكثافة البصرية (OD) للمحلول الناتج لتقدير حجم الدهون في IMAT. تم نشر التحقق الصارم من هذه التقنية في مكان آخر37. توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لاستخدام هذه المنهجية مع عضلات الماوس وتوفر نصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها لدعم اعتماد هذه الطريقة في تطبيقات أخرى ، مثل العضلات من الأنواع الأخرى أو الأنسجة الأخرى.
تم تنفيذ رعاية الفئران والتضحية بها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لاستخدام ورعاية المختبر. تمت الموافقة على جميع الأعمال من قبل لجنة الدراسات الحيوانية في جامعة واشنطن في كلية سانت لويس للطب. تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 2-3 أشهر (انظر جدول المواد) لإنشاء أمثلة الصور المضمنة في هذا البروتوكول. يتم تنفيذ جميع الخطوات الموضحة أدناه في درجة حرارة الغرفة.
1. إزالة الخلايا العضلية
2. تصور IMAT مع النفط الأحمر O
3. تصور قطرات الدهون IMAT مع BODIPY
ملاحظة: التصوير البؤري هو الأكثر فعالية مع العضلات رقيقة مثل EDL أو الحجاب الحاجز (~ 2 مم سمك). بدلا من ذلك ، يمكن استخدام شرائط سمك مماثلة للعضلات مثل TA.
4. تقدير إجمالي حجم الدهون عن طريق استخراج الدهون
5. القياس الكمي لمقاييس قطرات الدهون IMAT من الصور متحدة البؤر
ملاحظة: يتطلب هذا القسم الوصول إلى ImageJ الإصدار 1.47 (انظر جدول المواد) أو أحدث ومهارات ImageJ الأساسية40.
التصور النوعي للتسلل الدهني للعضلات الهيكلية
العضلات المنزوعة الخلايا بشكل صحيح بيضاء وشبه شفافة (القسم 1 ؛ الشكل 1). عندما تكون العضلات غير الخلوية ملطخة ب ORO لتصور IMAT (القسم 2) ، تظهر قطرات الدهون IMAT داخل هياكل العضلات الواضحة ككرات حمراء (الشكل 1). تحتوي عضلات الأطراف الخلفية السليمة للفأر على القليل من IMAT الطبيعي ، ويتضح ذلك من القليل من الدهون الحمراء الإيجابية ORO (الشكل 1 أ). وبالمقارنة ، فإن عضلات الأطراف الخلفية المحقونة بسم القلب (CTX; الشكل 1 ب) أو الجلسرين (GLY; الشكل 1 ج) قبل 14 يوما من إزالة الخلايا ، زاد تراكم IMAT ، مع تركيز أكبر من IMAT بعد CTX مقارنة ب GLY كما لوحظ سابقا37.
يمكن تحديد إزالة الخلايا غير المكتملة مباشرة بعد معالجة SDS الأولية أو بعد غسل تلطيخ ORO كألياف وردية فاتحة شبه معتمة (الشكل 2B مقارنة بالشكل 2A). يمكن تحديد الخلوص غير الكامل ل ORO بعد غسل ORO كخلفية موحدة وردية أو حمراء ، بدلا من خطوط الألياف المميزة (الشكل 2C). يحتوي الشكل 2 أ ، ب أيضا على الدهون فوق العضلية (العلامات النجمية) ، وهي مجموعة من قطرات الدهون خارج العضلة المنزوعة الخلايا. يوضح الشكل 2 ج أيضا الطي العضلي الذي يمكن أن يحدث إذا لم تنتشر العضلات أثناء عملية إزالة الخلايا. إزالة الخلايا غير المكتملة ، وإزالة ORO غير المكتملة ، والدهون العضلية المتبقية كلها تزيد من (OD) من الدهون المستخرجة ، ولكنها لا تعيق بالضرورة التقييم النوعي للتسلل الدهني إذا تم التعرف عليها كقطعة أثرية.
التصوير الكمي للارتشاح الدهني للعضلات الهيكلية
يمكن تصوير قطرات الدهون الموسومة بالفلورسنت BODIPY عبر الفحص المجهري متحد البؤر لإجراء تقييم أكثر تفصيلا لمقاييس قطرات الدهون الفردية وتوزيعها (الشكل 3). هذه العملية شبه آلية ، كما هو موضح سابقا ، بما في ذلك رمز Matlab37. ينتج عن تلطيخ BODIPY الجيد أشكال بيضاوية ساطعة محددة من الأشكال المجاورة عند تصويرها في المستوى (الشكل 3 أ). يوفر تقسيم العتبة والشكل تمريرة أولى جيدة لتوليد عائد استثمار لكل قطرة دهون (الشكل 3 ب) ، ولكن هناك حاجة إلى تعديلات يدوية لتصحيح الأخطاء. الخطأ الأكثر انتشارا هو قطرات الدهون العميقة في الأنسجة وبالتالي فهي ليست ساطعة على أي شرائح (الشكل 3 ب ؛ الأسهم المزدوجة الوردية). يمكن معالجة ذلك عن طريق إضافة عائد استثمار يدويا باستخدام الأداة البيضاوية في ImageJ (الشكل 3C). والثاني هو تحديد مجموعة من قطرات الدهون كعائد استثمار واحد (الشكل 3 ب ؛ علامة النجمة الحمراء). يمكن تصحيح ذلك عن طريق حذف عائد الاستثمار الأصلي واستبداله بعدة عائد استثمار جديد (الشكل 3D). أخيرا ، يتم تحديد قطرة دهنية واحدة على أنها عائد استثمار فريد في شرائح متعددة ، لذلك يجب دمج عائد الاستثمار المكرر في عائد استثمار واحد (الشكل 3E ؛ السهم الأزرق). يتم ذلك بسهولة أكبر باستخدام أداة معالجة البيانات مثل Matlab ، ولكن يمكن أيضا القيام به يدويا عن طريق تحديد أكبر عائد استثمار وحذف الباقي. يمكن العثور على متوسط القيم لكل مقياس في الماوس C57BL6 / J و 129Sv في Biltz et al.37.
الشكل 1: مثال على تلطيخ الزيت الأحمر O (ORO) للعضلات غير الخلوية. العضلات الملطخة ب ORO بعد 14 يوما من الحقن بالمحلول الملحي (SAL) أو سم القلب (CTX) أو الجلسرين (GLY). تحتوي عضلات الباسطة الرقمية الطويلة (EDL) وعضلات الظنبوب الأمامية (TA) على القليل من IMAT (الكرات الحمراء) مع علاج SAL (A) ، ولكنها تتراكم IMAT استجابة لعلاج CTX (B) و GLY (C). هناك إزالة كاملة للخلايا وغسل ORO ، يتضح من قطرات الدهون الإيجابية ORO المميزة في خلفية العضلات البيضاء الشفافة. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أمثلة على نتائج تلطيخ ORO السيئة. يؤدي إزالة الخلايا غير المكتملة أو إزالة ORO غير المكتملة إلى خلفية وردية / حمراء شبه معتمة. بالمقارنة مع الخلفية البيضاء الشفافة لعضلة الحجاب الحاجز للفأر المنزوعة الخلايا بالكامل (A) ، تتميز عملية إزالة الخلايا غير المكتملة بمسارات ألياف وردية / حمراء فاتحة (B) ، وتتميز إزالة ORO غير المكتملة بخلفية وردية / حمراء منتشرة (C). قضبان المقياس: الألواح العلوية = 1 مم ؛ الألواح السفلية = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: أمثلة على تحديد قطرات الدهون الفردية مع تلطيخ BODIPY الفلوري والفحص المجهري متحد البؤر يمكن تحديد قطرات الدهون الملطخة BODIPY الفردية وقياسها في العضلات منزوعة الخلايا باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. تظهر الشرائح الفردية من خلال مكدس متحد البؤر قطرات الدهون في المستوى كقطع ناقص أخضر فاتح ، وقطرات الدهون خارج المستوى كأشكال أكثر خفوتا (A ؛ الأسهم الزرقاء). يمكن أن يؤدي العتبة جنبا إلى جنب مع تجزئة كائن مستجمعات المياه وتحديد عائد الاستثمار إلى تعيين عائد الاستثمار الملطخ ب BODIPY (B). قد تفوت العتبة بعض قطرات الدهون الخافتة (B ؛ السهم المزدوج الوردي) ، مما يتطلب تحديد الهوية باليد (C). قد يقوم تجزئة مستجمعات المياه بتجميع عدة قطرات دهنية معا (B ؛ علامة النجمة الحمراء) ، مما يتطلب حذف عائد الاستثمار وإعادة التقدير يدويا (D). يتم تحديد نفس قطرة الدهون في شرائح متعددة تتطلب تسجيل الصورة (E) لحذف عائد الاستثمار المكرر. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تصف هذه المخطوطة طرقا للتصور النوعي والقياس الكمي للتسلل الدهني للعضلات الهيكلية في نماذج حيوانية صغيرة يمكن تطبيقها لزيادة فهم التسبب في تطور الأنسجة الدهنية العضلية (IMAT) والتوسع المرضي. يسمح استخدام إزالة الخلايا من العضلات بالكامل والتلوين القابل للذوبان في الدهون بمنهجية فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكرار وبسيطة لتقييم شامل لوجود IMAT في العضلات بأكملها.
أساس هذا البروتوكول هو أن إزالة الخلايا من العضلات مع SDS يزيل المكونات الخلوية للألياف العضلية ، بما في ذلك قطرات الدهون الصغيرة من IMCL ، ولكن يجنب قطرات الدهون الكبيرة في الخلايا الشحمية داخل الخلايا العضلية. تم استخدام SDS على نطاق واسع42 في هندسة الأنسجة لإزالة الخلايا من المصفوفات. تتطلب الأنسجة مثل العضلات الدهنية والهيكلية عادة تفككا ميكانيكيا إضافيا و / أو استخراج الكحول لإزالة الدهون الشحمية المتبقية42,43. لقد أظهرنا سابقا أن هذا يرجع إلى أنه في حين أن إزالة الخلايا باستخدام SDS تقضي على IMCL ، فإنها توفر قطرات الدهون الكبيرة في الخلايا الشحمية37. أثبت تصوير العضلات السليمة الملطخة برباعي أكسيد الأوزميوم قبل وبعد إزالة الخلايا باستخدام μCT أن النمط المكاني ل IMAT لم يتعطل بسبب إزالة الخلايا. علاوة على ذلك ، كان قياس كمية الدهون الثلاثية العضلية في عضلة منزوعة الخلايا مع IMAT ضئيل ~ 5٪ من قيم العضلات السليمة ، مما تحقق من إزالة IMCL. لذلك ، تحتفظ هذه المنهجية بقطرات الدهون IMAT في توزيعها التشريحي الأصلي من خلال مصفوفة عضلية شبه شفافة.
إزالة الخلايا المناسبة هي الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول. إذا كانت عملية إزالة الخلايا غير مكتملة ، فسيكون من الصعب تصور قطرات الدهون IMAT وسيتسبب IMCL المتبقي في تلطيخ الخلفية العالية إما باستخدام ORO أو BODIPY (الشكل 2). الأخطاء الشائعة من قبل المستخدمين عديمي الخبرة هي عدم كفاية تغطية SDS لكل عضلة (داخل كل بئر) ، بحيث لا يتم تغطية كل عضلة بالكامل في محلول SDS ، وعدم استخدام الروك لتحريك الحل أثناء إزالة الخلايا ، وعدم إجراء تغييرات الحل بشكل متكرر بما فيه الكفاية. في هذه المخطوطة ، أوصينا بكمية SDS اللازمة لكل وحدة كتلة عضلية ، لكن المستخدم سيظل بحاجة إلى التأكد من تغطية العضلات بالكامل بالحلول ، حيث أن كل عضلة لها هندسة فريدة. ينصح المستخدمون أيضا بتغيير الحلول بحرية (بقدر مرتين في اليوم) لضمان اكتمال إزالة الخلايا. تم تحقيق تلطيخ عالي الجودة لقطرات الدهون IMAT بعد ما يصل إلى 4 أيام من علاج SDS. للحصول على نتائج تلطيخ ORO عالية الجودة ، يعد التثبيت المناسب وإعداد محلول ORO مهمين أيضا. على غرار علاج SDS الموصوف أعلاه ، هناك حاجة إلى تغطية كافية لمحلول الفورمالديهايد بنسبة 3.7٪ لكل عينة عضلية. إذا تمت إزالة العضلات من المثبت في وقت مبكر جدا ، فإن قطرات الدهون سوف تلطخ بشكل ضعيف فقط باستخدام ORO. يجب أن يكون ما مجموعه 1-2 ساعة كافيا ، ولكن يوصى بالتثبيت بين عشية وضحاها لضمان اختراق المثبت لمركز العضلات وإصلاح جميع قطرات الدهون بالكامل. التحدي الإضافي مع تلطيخ ORO هو أنه عندما يتم تقليل تركيز الكحول إلى 60٪ ، تبدأ الجسيمات في التكون. يمكن أن تستقر هذه الجسيمات على السطح وتصبح عالقة على حدود العضلات. أفضل طريقة لتجنب ذلك هي عمل حل عمل جديد لكل تلطيخ واستخدام مرشحات 40 شبكة ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك ، سيساعد الحفاظ على الهياج مع الروك والحد من وقت التلوين إلى 10 دقائق في منع أي جسيمات تتشكل من الاستقرار. إذا استمرت المشكلة ، فقد يساعد إنشاء حل جديد لمخزون ORO. إذا بقيت بعض القطع الأثرية عالقة على سطح العضلات المنزوع الخلايا ، فيمكن استخدام مجهر ستيريو وملقط ومقص جراحي لإزالة هذه القطعة الأثرية. سيؤدي الفشل في التخلص من القطع الأثرية إلى التأثير على جودة صورة العضلات والمبالغة في تقدير محتوى IMAT أثناء جزء استخراج الدهون استعدادا لقراءة OD.
بشكل عام ، هذه التقنية واضحة ومباشرة وتوفر العديد من المزايا مقارنة بالطرق القياسية الذهبية لتصور وقياس تسلل الدهون في العضلات الهيكلية. التقنيات غير الباضعة ، مثل التصوير المقطعي المحوسب والتصوير بالرنين المغناطيسي والولايات المتحدة ، والتي تستخدم على نطاق واسع في البشر وأحيانا في النماذج الحيوانية ، لها دقة مكانية محدودة وغير قادرة على التمييز بين قطرات الدهون وألياف العضلات. وبالتالي ، يتم تعيين بكسل أو فوكسل من شدة الإشارة المتوسطة ك "عضلة" أو "دهون" ، بينما في الواقع من المحتمل أن يكون مزيجا من الألياف العضلية والخلايا الشحمية. بشكل أكثر شيوعا ، يتم تقييم التسلل الدهني في عضلات الحيوان عن طريق الأنسجة ، في أغلب الأحيان بواسطة ORO في عمليات تشريح العضلات. ومع ذلك ، يتم إجراء ذلك عادة في قسم تمثيلي واحد فقط ويصعب تحديده كميا بسبب تشتت الدهون فوق القسم. على النقيض من ذلك ، يوفر تلطيخ ORO لعضلة كاملة منزوعة الخلايا تقييما شاملا ل IMAT بتكاليف وجهد مماثل للتشكل السليم. علاوة على ذلك ، بالإضافة إلى تعزيز التصور ، يتيح تلطيخ ORO لإزالة الخلايا تحديد كمية التسلل الدهني عن طريق استخراج الدهون. للغوص بشكل أعمق في ميزات التسلل الدهني ، يمكن استخدام صبغة الفلورسنت ، BODIPY ، جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر. وهذا يتيح إعادة بناء قطرات الدهون IMAT الفردية لرسم خريطة المشهد 3D ، وهو أمر غير ممكن مع الأنسجة ما لم يتم تحليل المقاطع على طول العضلات. في حين أن المجهر متحد البؤر ليس من معدات المختبر القياسية ، فمن المرجح أن يكون متاحا في بيئة جامعية أو صناعية أكثر من التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانات الصغيرة أو التصوير المقطعي المحوسب. علاوة على ذلك ، يمكن أتمتة الكثير من هذه العملية ، مما يقلل من تكلفة الوقت مقارنة بالأنسجة المتسلسلة. يعد تحسين الإعدادات على المجهر متحد البؤر اعتبارا إضافيا لتلطيخ BODIPY. هذه فريدة من نوعها لكل مجهر. القيمة الحرجة هي شدة الليزر ، والتي يجب أن تكون عالية بما يكفي للكشف عن قطرات الدهون على السطح البعيد للعضلة مع عدم تشبع الإشارة من قطرات الدهون على الجانب القريب. لهذا السبب ، يقترح أن استخدام تلطيخ BODIPY مع الفحص المجهري متحد البؤر هو الأنسب للعضلات الرقيقة ، بما في ذلك EDL أو الحجاب الحاجز.
وهناك عدة قيود على هذا النهج تستحق المناقشة. أولا ، في حين أنه من المتوقع أن يكون لهذه التقنية قابلية تطبيق واسعة تتجاوز نماذج الإصابة (سم القلب والجلسرين) في الفئران المعروضة هنا ، قد تتطلب التطبيقات الجديدة (على سبيل المثال ، نموذج mdx) التحسين ، حيث يمكن أن يؤثر حجم وتكوين العضلات (على سبيل المثال ، التليف) على إزالة الخلايا ، مما يتطلب زيادة تركيز SDS أو أوقات الحضانة. تتطلب نماذج الأمراض الأخرى ذات الكتلة العضلية المتغيرة أيضا تحليل كل من المقاييس المطلقة والطبيعية (لكتلة العضلات) للتسلل الدهني لتحديد الكمية المطلقة من الدهون أو النسبة المئوية للدهون بالنسبة لحجم العضلات لتوفير مقياس نتائج أكثر وضوحا. علاوة على ذلك ، من المتوقع أن تكون هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع على النماذج الحيوانية الأكبر حجما والخزعات البشرية ، ولكن هذا قد يتطلب تحسينا لكل تطبيق جديد. ثانيا ، في هذه الاستراتيجية ، يجب تخصيص العضلات بأكملها لهذا الفحص ولا يمكن استخدامها لتقييم ميزة مرضية أخرى. يتم تقديم الدراسات التي تهدف إلى تقييم التغيرات الطولية في IMAT بشكل أفضل من خلال تقنيات التصوير غير الباضعة والدراسات التي يتطلب هدفها الأساسي العضلات لأغراض أخرى (علم الأنسجة ، تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي ، النشاف الغربي) يتم تقديمها بشكل أفضل من خلال التقييم النسيجي ، حيث يمكن تخصيص ما تبقى من العضلات المجمدة لفحوصات أخرى. ومع ذلك ، فإن هذا الفحص مناسب تماما للاقتران بالاختبار في الجسم الحي ، مثل تشغيل جهاز المشي ، أو اختبار انقباض خارج الجسم الحي ، حيث يمكن إجراء هذه التدابير قبل إزالة الخلايا44. ثالثا ، على الرغم من أن استخدام صبغة BODIPY مع الفحص المجهري متحد البؤر يوفر تصورا عالي الدقة وتقديرا كميا لقطرات الدهون ، إلا أنه لا يمكنه تحديد قطرات الدهون بشكل قاطع كخلايا دهنية فردية ، حيث تتم إزالة غشاء الخلية وفقدان بروتينات الخلايا الشحمية الذاتية. يمكن تحديد الخلايا الشحمية متعددة العينين ، التي تمثل الخلايا الشحمية غير الناضجة أو النمط الظاهري "البني / البيج" ، على أنها قطرات دهنية متعددة. أخيرا ، لا يعمل البروتوكول بشكل جيد على العضلات المجمدة مسبقا. ربما تكون هذه القيود أكثر عمقا بالنسبة للخزعات البشرية ، لأنه في حين يمكن إزالة الخلايا من الخزعة بأكملها ، فمن غير المحتمل أن يكون التوزيع المكاني ل IMAT في الخزعة أكثر تمثيلا للعضلة بأكملها من شريحة نسيجية. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه التقنية غير حساسة نسبيا لظروف معالجة الخزعة غير المجمدة (على سبيل المثال ، ساعات على الجليد في برنامج تلفزيوني) ، يمكن تقسيم الخزعة لاحقا لمقايسات مختلفة ، بما في ذلك جزء لإزالة الخلايا ، مما يوفر دقة أفضل لقطرات الدهون الفردية.
في الختام ، تم تطوير طريقة جديدة للتحليل النوعي والكمي للتسلل الدهني للعضلات الهيكلية عن طريق تلطيخ وتصوير الدهون المحتفظ بها للتركيبات المنزوعة الخلايا. تقدم هذه المنهجية تحسينات على الأساليب القياسية الذهبية ، من حيث أنها تتيح التصوير الشامل للتسلل الدهني ثلاثي الأبعاد داخل العضلات والقياس الكمي السريع والرخيص مع تلطيخ ORO. للحصول على مقاييس أكثر تفصيلا ، توفر صبغة BODIPY الثانية القابلة للذوبان في الدهون تقديرا كميا أكثر تفصيلا لعدد قطرات الدهون وحجمها ونمط توزيعها ، كما تم تصويرها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. توفر هذه المقاييس معا للباحثين طريقة لقياس تسلل العضلات الهيكلية الدهنية بدقة على مستوى قطرات الدهون الفردية دون أخذ عينات أو تصوير غير جراحي باهظ الثمن.
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
وحظي هذا العمل بدعم R01AR075773 إلى أمانة عمان الكبرى.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm Syringe Filter | Fisher Scientific | SLGP033RS | |
1 mL LuerLock Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
12 mm Coverslips | Fisher Scientific | 12545F | |
12 well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
24 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
2-Propanol (Isopropanol) | Sigma Aldrich | I9516 | 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month. Working solution must be made fresh. |
37% Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 8187081000 | |
40 µm Mesh Filter | Fisher Scientific | 87711 | |
6 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
96 well plates | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
BODIPY 493/503 | Fisher Scientific | D-3922 | |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
Confocal Imaging Dish | VWR | 734-2905 | |
Confocal Microscope | Leica | TCS SPEII | |
Dissecting/stereo Microscope | Zeiss | 4107009123001000 | |
Dissection scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 033361.K2 | |
ImageJ | NIH | ||
Matlab | Mathworks | ||
Oil Red O Powder | Sigma Aldrich | O0625 | |
Plate reader | Bio-tek | Synergy II | |
Rocker/Shaker | Reliable Scientific | 55D | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119D | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved