تحديد الببتيدات للحويصلات الصغيرة خارج الخلية من الضامة المشتقة من نخاع العظام

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن الضامة عن طريق الطرد المركزي التفاضلي واستخراج الببتيدوم لتحديده بواسطة مطياف الكتلة.

Abstract

عادة ما يتم إفراز الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) عن طريق الإخراج الخلوي للأجسام متعددة الحويصلات (MVBs). هذه الحويصلات النانوية التي يبلغ قطرها <200 نانومتر موجودة في سوائل الجسم المختلفة. تنظم هذه الخلايا الجذعية عمليات بيولوجية مختلفة مثل نسخ الجينات وترجمتها ، وتكاثر الخلايا وبقائها ، والمناعة والالتهابات من خلال شحناتها ، مثل البروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي والمستقلبات. حاليا ، تم تطوير تقنيات مختلفة لعزل sEVs. من بينها ، تعتبر الطريقة القائمة على الطرد المركزي الفائق المعيار الذهبي وتستخدم على نطاق واسع لعزل sEVs. الببتيدات هي جزيئات حيوية بشكل طبيعي مع أقل من 50 من الأحماض الأمينية في الطول. تشارك هذه الببتيدات في مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية ذات النشاط البيولوجي ، مثل الهرمونات والناقلات العصبية وعوامل نمو الخلايا. يهدف الببتيدوم إلى التحليل المنهجي للببتيدات الداخلية في عينات بيولوجية محددة بواسطة قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS). هنا ، قدمنا بروتوكولا لعزل sEVs عن طريق الطرد المركزي الفائق التفاضلي واستخلصنا الببتيدوم لتحديد الهوية بواسطة LC-MS / MS. حددت هذه الطريقة المئات من الببتيدات المشتقة من sEVs من الضامة المشتقة من نخاع العظام.

Introduction

توجد حويصلات صغيرة خارج الخلية (sEVs) بقطر أقل من 200 نانومتر في جميع أنواع سوائل الجسم تقريبا وتفرزها جميع أنواع الخلايا ، بما في ذلك البول والعرق والدموع والسائل النخاعي^{والسائل} الأمنيوسي 1. في البداية ، تم اعتبار sEVs كأوعية للتخلص من النفايات الخلوية ، مما أدى إلى الحد الأدنى من البحث في العقد^{اللاحق 2}. في الآونة الأخيرة ، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن sEVs تحتوي على بروتينات محددة ، ودهون ، وأحماض نووية ، ومستقلبات أخرى. يتم نقل هذه الجزيئات إلى الخلايا المستهدفة³ ، مما يساهم في التواصل بين الخلايا ، والتي من خلالها يشاركون في العمليات البيولوجية المختلفة ، مثل إصلاح الأنسجة ، وتكوين الأوعية الد....

Protocol

1. عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية

ملاحظة: قم بإجراء جميع عمليات الطرد المركزي في الخطوات 1.1-1.11 عند 4 درجات مئوية.

1. تحضير مصل بقري جنيني خال من المركبات الكهربائية (FBS): أجهزة الطرد المركزي FBS طوال الليل عند 110000 × جم عند 4 درجات مئوية من خلال جهاز طرد مركزي فائق (انظر جدول المواد) لإزالة المركبات الكهربائية ذاتية المنشأ. اجمع المادة الطافية ، وقم بتعقيمها بغشاء ترشيح فائق 0.2 ميكرومتر ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية.
2. لوحة حوالي 3 × 10⁷ البلاعم المشتقة من نخاع العظم (iBMDMs) على طبق استزراع 150 مم وإضافة 20 مل من وسط زراعة DMEM (انظر جدول المواد

النتائج

بالنسبة ل sEVs المعزولة بواسطة الطرد المركزي الفائق التفاضلي (الشكل 1) ، قمنا بتقييم مورفولوجيتها وتوزيع حجم الجسيمات وعلامات البروتين وفقا للجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية (ISEV)¹⁷.

أولا ، لوحظ مورفولوجيا sEVs بواسطة TEM ، مما يدل على بنية نموذجية.......

Discussion

عند التحقيق في وظيفة sEVs ، من الضروري الحصول على sEVs عالية النقاء من العينات البيولوجية المعقدة لتجنب أي تلوث محتمل. تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق لعزل sEVs¹³ ، ومن بين هذه الطرق ، أظهرت الطرق التفاضلية القائمة على الطرد المركزي الفائق نقاء عاليا نسبيا للمركبات الكهربائية الكهر?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
Centrifugal filter tube	Millipore	UFC5010BK
Centrifuge bottles polypropylene	Beckman Coulter	357003	High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrate	Thermo Fisher Scientific	34580
Dithiothreitol	Solarbio	D8220	100 g
DMEM culture medium	Cell World	N?A
GRP94	Cell Signaling Technology	20292
High-speed centrifuge	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)	National Institute of Biological Sciences, China		Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
Iodoacetamide	Sigma	l1149	5 g
Microfuge tube polypropylene	Beckman Coulter	357448	1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge
nano-high-performance LC system	Thermo Fisher Scientific	EASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Phosphate-buffered saline	Solarbio	P1020
Polyallomer centrifuge tubes	Beckman Coulter	326823	Ultracentrifuge
Protease inhibitor	Bimake	B14002
SpeedVac vacuum concentrator	Eppendorf	Concentrator plus
Tabletop ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima MAX-XP	Ultracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650B
TSG101	Sigma	AF8258
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XPN-100	Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptor	Scientz	SCIENTZ-IID
Western Blot imager	Bio-Rad	ChemiDocXRs	Image lab 4.0 (beta 7)
β-actin	Sigma	A3853