JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه المقالة بروتوكولا للتمايز الموجه والتحليل الوظيفي للخلايا الشبيهة بالخلايا β. نحن نصف ظروف وممرات الثقافة المثلى للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات قبل توليد خلايا البنكرياس المنتجة للأنسولين. يتطور التمايز المكون من ست مراحل من تكوين الأديم الباطن النهائي إلى خلايا وظيفية تشبه الخلايا β تفرز الأنسولين استجابة للجلوكوز.

Abstract

يمكن أن تتمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) إلى أي نوع من الخلايا ، مما يجعلها مصدرا بديلا ممتازا لخلايا β البنكرياس البشرية. يمكن أن تكون hPSCs إما خلايا جذعية جنينية (hESCs) مشتقة من الكيسة الأريمية أو خلايا مستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) متولدة مباشرة من الخلايا الجسدية باستخدام عملية إعادة البرمجة. هنا يتم تقديم بروتوكول قائم على الفيديو لتحديد الثقافة المثلى وظروف المرور ل hPSCs ، قبل تمايزها وتوليدها لاحقا لخلايا البنكرياس المنتجة للأنسولين. تتبع هذه المنهجية العملية المكونة من ست مراحل للتمايز الموجه للخلايا β ، حيث تتمايز hPSCs إلى الأديم الباطن النهائي (DE) ، وأنبوب الأمعاء البدائي ، ومصير الأمعاء الأمامية الخلفية ، وأسلاف البنكرياس ، وأسلاف الغدد الصماء في البنكرياس ، وفي النهاية خلايا β البنكرياس. من الجدير بالذكر أن منهجية التمايز هذه تستغرق فترة 27 يوما لتوليد خلايا β البنكرياس البشرية. تم تقييم إمكانات إفراز الأنسولين من خلال تجربتين ، والتي تضمنت التلوين المناعي وإفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز.

Introduction

تتمتع الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) بقدرة فريدة على التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، مما يجعلها بديلا قابلا للتطبيق لخلايا β البنكرياس البشرية1. يتم تصنيف هذه hPSCs إلى نوعين: الخلايا الجذعية الجنينية (hESCs) ، المشتقة من الكيسة الأريمية2 ، والخلايا المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) ، الناتجة عن إعادة برمجة الخلايا الجسدية مباشرة3. إن تطوير تقنيات للتمييز بين hPSCs إلى خلايا β ، له آثار مهمة على كل من البحث الأساسي والممارسة السريرية 1,4. داء السكري هو مرض مزمن يصيب > 400 مليون شخص في جميع أنحاء العالم وينتج عن عدم قدرة الجسم على تنظيم نسبة السكر في الدم بسبب خلل أو فقدان خلايا β البنكرياس5. أدى التوافر المحدود لخلايا جزيرة البنكرياس للزراعة إلى إعاقة تطوير علاجات استبدال الخلايا لمرض السكري2،4،6،7. تعمل القدرة على توليد خلايا إفراز الأنسولين المستجيبة للجلوكوز باستخدام hPSCs كنموذج خلوي مفيد لدراسة تطور الجزر البشرية ووظيفتها. يمكن استخدامه أيضا لاختبار المرشحين العلاجيين المحتملين لعلاج مرض السكري في بيئة خاضعة للرقابة. علاوة على ذلك ، فإن hPSCs لديها القدرة على إنتاج خلايا جزيرة البنكرياس المتطابقة وراثيا للمريض ، مما يقلل من خطر الرفض المناعي بعد الزرع2،4،7.

في السنوات الأخيرة ، كانت هناك تطورات كبيرة في تحسين ثقافة hPSC وبروتوكولات التمايز ، مما أدى إلى زيادة الكفاءة وقابلية استنساخ عملية التمايز نحو توليد خلايا β البنكرياس 8,9.

يوضح البروتوكول التالي المراحل الأساسية للتمايز الموجه لخلايا β البنكرياس. وهو ينطوي على تنظيم مسارات إشارات خلية محددة في نقاط زمنية متميزة. يعتمد على البروتوكول الذي طوره Sui L. et al.10 (2018) لتوليد hPSCs في خلايا β البنكرياس. تم تعديل البروتوكول وفقا للتحديثات الأخيرة من Sui L. et al.11 (2021) ، حيث تؤكد أحدث الأبحاث على أهمية استخدام علاج aphidicolin (APH) لتعزيز تمايز الخلايا β. يتضمن البروتوكول الحالي إضافة APH إلى الوسيط خلال المراحل اللاحقة من العملية. وعلاوة على ذلك، أدخلت تعديلات على تكوين الوسط خلال المراحل المبكرة من التمايز مقارنة بالبروتوكول الأولي. التغيير الملحوظ هو إضافة عامل نمو الخلايا الكيراتينية (KGF) في اليوم 6 ويستمر حتى اليوم 8. يتم تقديم عامل نمو الخلايا الكيراتينية (KGF) من اليوم 6 إلى اليوم 8 ، والذي يختلف قليلا عن البروتوكول الأولي10 ، حيث لم يتم تضمين KGF في وسط المرحلة 4.

الخطوة الأولى والأساسية في توليد الخلايا الشبيهة بالخلايا β هي التمايز الموجه ل hPSCs إلى الأديم الباطن النهائي (DE) ، وهي طبقة جرثومية بدائية تؤدي إلى ظهور البطانة الظهارية للأعضاء المختلفة ، بما في ذلك البنكرياس. بعد تكوين DE ، تخضع الخلايا للتمايز في أنبوب الأمعاء البدائي ، والذي يتبعه تحديد مصير الأمعاء الأمامية الخلفية. تتطور الأمعاء الأمامية الخلفية بعد ذلك إلى خلايا سلف للبنكرياس ، والتي لديها القدرة على التمايز إلى جميع أنواع خلايا البنكرياس ، بما في ذلك خلايا الغدد الصماء وخلايا الإفراز الخارجية. تتضمن المرحلة اللاحقة من العملية أسلاف الغدد الصماء في البنكرياس مما يؤدي إلى ظهور الخلايا المفرزة للهرمونات الموجودة في جزر لانجرهانز. في النهاية ، تصل عملية التمايز إلى مرحلتها النهائية من خلال إنتاج خلايا تشبه خلايا البنكرياس β تعمل بكامل طاقتها 9,10. من المهم ملاحظة أن هذه العملية معقدة وغالبا ما تتطلب تحسين ظروف الثقافة ، مثل عوامل النمو المحددة ومكونات المصفوفة خارج الخلية ، لتحسين كفاءة وخصوصية التمايز 9,10. علاوة على ذلك ، لا يزال توليد خلايا وظيفية تشبه الخلايا β من hPSCs في المختبر يمثل تحديا كبيرا. تركز الأبحاث الجارية على تحسين بروتوكولات التمايز وتعزيز نضج ووظيفة الخلايا βالناتجة 9.

في هذا البروتوكول ، يعد استخدام تفكك الخلايا اللطيف أثناء زراعة ومرور hPSCs أمرا ضروريا للحفاظ على صلاحية الخلية وتعدد القدرات ، مما يحسن بشكل كبير من كفاءة التمايز في خلايا β البنكرياس. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحسين كل وسيط خاص بالمرحلة بدقة وفقا للبروتوكول الذي طوره Sui L. et al.10 لتعزيز إنتاجية عالية من الخلايا التي تفرز الأنسولين في مجموعات تشبه إلى حد كبير الجزيرة البشرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

قبل البدء في التمايز ، يوصى بتحديد العدد المطلوب من الكائنات العضوية الشبيهة بالجزر للأغراض التجريبية. في صفيحة 6 آبار ، يتكون البئر الواحد الذي يزيد عن 80٪ من التقاء 2-2.3 مليون hPSCs. في حين أن التنبؤ الدقيق يمثل تحديا بسبب الاختلافات في خطوط hPSC وكفاءة التمايز ، فإن التقدير التقريبي هو 1.5 ضعف عدد الآبار الأولية. عادة ما ينتج عن التمايز الموجه بشكل فعال 1.6 إلى 2 مليون خلية لكل بئر في ألواح من ستة آبار ، تشمل جميع الخلايا داخل المجموعات بدلا من الخلايا المنتجة للأنسولين حصريا. بالنسبة لمجموعة 50 ميكرومتر ، يمكن تقريبها لتحتوي على حوالي 10000 خلية. يقدم الجدول 1 ملخصا لتكوين الوسائط المستخدم لكل يوم / مرحلة من مراحل التمايز الموجه أعلى مصفوفة الخلايا الجذعية والوسط ، جنبا إلى جنب مع مخزن إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز.

1. تمرير الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات قبل التمايز في 6 لوحات الآبار

ملاحظة: يعد المرور المناسب للخلايا الجذعية البشرية قبل التمايز إلى خلايا شبيهة بالخلايا β خطوة حاسمة في إنشاء العملية التجريبية. يمكن أن يؤدي تخفيف الممر غير الصحيح أو رقم خلية المرفق إلى الإضرار بكفاءة التمايز والدقة.

  1. تحضير وسط زراعة الخلايا الجذعية والطلاء ومحاليل التفكك (كما هو محدد في الجدول 1).
  2. 1-2 ساعة قبل المرور ، قم بتغطية صفيحة من ستة آبار بمحلول طلاء بارد (1 مل لكل بئر) واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  3. قم بتسخين حصة من وسط زراعة الخلايا الجذعية في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة.
  4. نضح وسط الخلايا الجذعية وإضافة 1 مل من D-PBS الخالي من الكالسيوم / المغنيسيوم.
  5. كرر الخطوة 1.4. مرتين.
    ملاحظة: يضاف D-PBS لغسل الخلايا وإزالة الوسط والمركبات السابقة. من المهم ملاحظة أنه لا يلزم إطار زمني محدد لخطوات الغسيل ، لأن التعرض ل D-PBS لا يضر ب hPSCs ، مما يمنع تمزق الخلايا أو انكماشها الناجم عن التناضح.
  6. نضح D-PBS ، أضف 500 ميكرولتر من محلول التفكك لكل بئر ، واتركه لمدة 2-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (15 - 25 درجة مئوية).
  7. أثناء تفكك الخلايا ، قم باستنشاق محلول الطلاء للوحة البئر 6 الجديدة وأضف 1-2 مل من D-PBS الخالي من الكالسيوم / المغنيسيوم إلى كل بئر.
  8. تحقق بانتظام من عملية التفكك تحت المجهر المقلوب.
  9. نضح محلول التفكك عندما تكون 80 - 90٪ من الخلايا مستديرة ولكنها لا تزال ملتصقة.
  10. أضف 1 مل من وسط الخلايا الجذعية الذي يحتوي على مثبط 10 ميكرومتر ROCK.
  11. اجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام أطراف ماصة معقمة مفلترة سعة 1000 ميكرولتر وماصة P1000.
  12. قم بسحن تعليق الخلية ببطء لأعلى ولأسفل في الماصة باستخدام طرف ماصة معقم سعة 1000 ميكرولتر مصفى لكسر المستعمرات ، لكن لا تتجاوز 10 مرات.
  13. أضف 1 مل من وسط الخلايا الجذعية الذي يحتوي على مثبط ROCK للمساعدة في فصل hPSCs المتبقية ونقل تعليق الخلية إلى نفس الأنبوب المخروطي 15 مل (1.10).
  14. قم بنضح D-PBS من اللوحة المطلية حديثا وأضف على الفور تعليق الخلية من الأنبوب المخروطي سعة 15 مل. لضمان النمو الأمثل للخلايا ، قم بزرع مجموعة من 2 × 105- 1 × 106 خلايا قابلة للحياة لكل بئر عند استخدام لوحة 6 آبار (1 في 10 إلى 1 في 50 انقساما).
    ملاحظة: لحساب الحجم ، يجب أن يحتوي كل بئر من صفيحة 6 آبار على 2 مل من وسط الخلايا الجذعية مع مثبط ROCK.
  15. حرك اللوحة بسرعة ذهابا وإيابا ، ومن جانب إلى آخر 5-10 مرات.
  16. ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية ، حاضنة CO2 5٪ لمدة 24 ساعة.
  17. استبدل بوسط الخلايا الجذعية الطازجة بدون مثبط ROCK في اليوم التالي ، ثم كل يومين حتى يصل التقاء hPSCs إلى 80 - 95٪.

2. التمايز الموجه للخلايا β المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية

ملاحظة: يمكن استخدام hPSCs لعملية التمايز المباشر في خلايا β البنكرياس عند تحقيق التقاء 80-95٪.

  1. اليوم -1: مرور الخلايا اليوم -1 من التمايز:
    1. 1-2 ساعة قبل المرور ، قم بتغطية صفيحة بئر 6 بمحلول طلاء بارد في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة.
    2. اتبع الخطوات من 1.1 إلى 1.10 وانتقل إلى عد الخلايا.
    3. قم بتحميل 10 ميكرولتر من خليط الخلية ، وأضف حجما متساويا من Trypan Blue ، واخلطه برفق.
    4. احسب تركيز الخلية. استخدم 0.8 × 106 خلايا / مل - 1.0 × 106 خلايا / مل من وسط الخلايا الجذعية يحتوي على مثبط 10 ميكرومتر ROCK للوحة لوحة البئر 6 المطلية ب 2 مل من الوسائط لكل بئر.
    5. حرك اللوحة بسرعة ذهابا وإيابا ، من جانب إلى آخر ثلاث مرات.
    6. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 . حرك اللوحة بسرعة ذهابا وإيابا ، ومن جانب إلى آخر مرة أخرى 10 مرات. ثم احتضان اللوحة لمدة 4 ساعات.
      ملاحظة: تأكد من أن الحد الأقصى للربط والتوزيع المتساوي للخلايا لا يزعج الخلايا عن طريق تحريك اللوحة بمجرد وضعها في الحاضنة. افتح وأغلق الحاضنة بعناية فائقة.
    7. ضع زجاجة الوسط القاعدي للأيام من 0 إلى 4 عند 4 درجات مئوية لإذابتها طوال الليل.
  2. اليوم 0
    ملاحظة: يجب أن تكون hPSCs متقاربة بنسبة 80 - 95٪ ، ولا تبدأ عملية التمايز إلى الأديم الباطن النهائي تحت هذا التقارب.
    1. على الجليد ، قم بإذابة كل من الوسط القاعدي للأيام من 0 إلى 4 والمكملات الغذائية (انظر جدول المواد).
    2. قم بإعداد الحجم اللازم فقط في أنبوبين مخروطيين لاستخدامه في اليوم الأول (2 مل لكل بئر من صفيحة 6 آبار) ، وفي أنبوب منفصل ، ضاعف الحجم لليوم 2.5 إلى 4 (2 × 2 مل لكل بئر من لوحة 6 آبار). يخزن اليوم 2.5 إلى اليوم 4 في درجة مئوية.
    3. قم بتسخين حصة من الحجم الضروري لوسط اليوم الأول ووسط الغسيل 1 في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. نضح وسط الخلايا الجذعية وإضافة 2 مل من وسط الغسيل 1.
      ملاحظة: يتكون وسط الغسيل المستخدم في البروتوكول من الوسط القاعدي الخاص بكل يوم / مرحلة ، مع استكمال المضادات الحيوية بنسبة 1٪. تتضمن خطوات الغسيل لبروتوكول التمايز المباشر فقط إضافة وسيط الغسيل المعين (المشار إليه باسم "وسيط الغسيل 1 أو 2" ، جدول المواد) والشفط اللاحق ، باتباع الإجراء الموصوف 2.2.4. من المهم الإشارة إلى أنه لا يوجد إطار زمني محدد محدد لخطوات الغسيل هذه.
    5. نضح وسط الغسيل 1 وأضف على الفور 2 مل من وسط اليوم 1 إلى جانب البئر.
    6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
  3. اليوم 1
    1. قم بتسخين حصة من الحجم الضروري من الأيام 2.5 إلى 4 متوسطة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. نضح وسط اليوم 1 وأضف على الفور 2 مل من اليوم 2.5 إلى 4 وسط إلى جانب البئر. لا تغسل الخلايا.
    3. ضع اللوحة مرة أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 36 ساعة.
  4. أيام 2.5 إلى 4
    1. قم بتسخين حصة من الحجم المتبقي من اليوم 2.5 إلى 4 متوسطة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. نضح الوسط وأضف على الفور 2 مل من الأيام الطازجة 2.5 إلى 4 متوسطة إلى جانب البئر.
    3. ضع اللوحة مرة أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 36 ساعة.
  5. اليوم 4
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يكون التعبير عن علامات الأديم الباطن النهائية في أقصى حد له ، ويمكن للخلايا أن تبدأ تمايز أنبوب الأمعاء البدائي.
    1. قم بإعداد حصة من الحجم اللازم لوسط مرحلة الأمعاء البدائية لليوم 4 (2 مل لكل بئر من صفيحة من ستة آبار) وقم بتسخينها في درجة حرارة الغرفة (15 درجة مئوية -25 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة.
    2. نضح الأيام 2.5 إلى 4 متوسطة وإضافة 2 مل من وسط الغسيل 1.
    3. نضح وسط الغسيل 1 ، وأضف على الفور 2 مل من مرحلة الأمعاء البدائية لليوم 4 إلى جانب البئر.
    4. ضع اللوحة مرة أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
  6. الأيام من 6 إلى 8
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، تبدأ الخلايا في مزيد من التمايز على مصير الأمعاء الأمامية الخلفية.
    1. قم بإعداد الحجم اللازم من الأيام 6 إلى 8 وسط الأمعاء الأمامية الخلفية (2 مل لكل بئر من 6 صفيحة بئر) وقم بتسخين الوسط في درجة حرارة الغرفة (15 درجة مئوية -25 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة.
    2. نضح وسط اليوم 4 وأضف على الفور 2 مل من الأيام 6 إلى 8 وسط أمامي خلفي إلى جانب البئر.
    3. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
  7. الأيام من 8 إلى 12
    ملاحظة: الخلايا جاهزة للخضوع لتمايز أسلاف البنكرياس.
    1. قم بإعداد الحجم اللازم من الأيام 8 إلى 12 من أسلاف البنكرياس المتوسطة (2 مل لكل بئر من 6 صفيحة بئر) وقم بتسخين الوسط في درجة حرارة الغرفة (15 درجة مئوية -25 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة.
    2. نضح الأيام من 6 إلى 8 متوسطة وأضف على الفور 2 مل من الأيام 6 إلى 8 وسط أمامي خلفي إلى جانب البئر.
    3. ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
  8. اليوم 12: تنفيذ خطوة التجميع
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، تشكل الخلايا طبقة أحادية كثيفة ، وسيتم نقلها إلى ثقافة الخلايا 3D لتشكيل مجموعات. هذه الخطوة ضرورية للتمايز لتعزيز التشابه الهيكلي للخلايا الشبيهة ب β بالجزر البشرية الأصلية ولكن أيضا يحسن تشابهها الوظيفي على المستويين الخلويوالعنقودي 11 (الشكل 1).
    1. عالج صفيحة 6 آبار تحتوي على آبار دقيقة 400 ميكرومتر (كما هو محدد في جدول المواد: التمايز الموجه للخلايا β المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية ، اليوم 12) ب 2 مل من محلول الشطف المضاد للالتصاق في درجة حرارة الغرفة (15 درجة مئوية - 25 درجة مئوية).
      ملاحظة: يمنع microwell الخلايا من الالتصاق بقاع البئر ويسهل التكوين الميكانيكي لمجموعات 3D.
    2. لوحة الطرد المركزي عند 1300 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. تحقق من وجود أي فقاعات تحت المجهر المقلوب. إذا لم تلاحظ أي فقاعات ، قم بنضح محلول الشطف المضاد للالتصاق وأضف على الفور 2 مل من وسط الغسيل 2 (جدول المواد).
    4. كرر الخطوة 1.8.3. مرتين.
    5. قم بإعداد الحجم اللازم للوسط العنقودي وقم بتسخينه في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة. تأكد من أن بئرين من صفيحة بئر 6 تدخل في بئر واحد من صفيحة بئر 6 ميكرو بطول 400 ميكرومتر مع 4 مل من وسط الكتلة.
    6. نضح البنكرياس السلف المتوسطة وإضافة عازلة التفكك (0.5 مل لكل بئر).
    7. احتضان في درجة حرارة الغرفة (15 درجة مئوية - 25 درجة مئوية) لمدة 2-5 دقائق. تحقق بانتظام من عملية التفكك تحت المجهر المقلوب ونضح المخزن المؤقت للتفكك عندما تكون معظم الخلايا مستديرة ولكنها لا تزال ملتصقة.
    8. نضح المخزن المؤقت للتفكك وأضف على الفور 1 مل من الوسط العنقودي إلى كل بئر.
    9. قم بفصل الخلايا عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل ست مرات باستخدام ماصة P1000 وأطراف مرشح 1000 ميكرولتر.
    10. انقل الخلايا والمزيج العنقودي المتوسط إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL.
    11. أضف 1 مل من الوسط العنقودي لجمع كل الخلايا المتبقية.
    12. أضف الوسط العنقودي إلى الحجم الكلي المطلوب بحيث يحتوي كل بئر من صفيحة الآبار الدقيقة على 4 مل من وسط / خلايا خليط العنقود.
    13. نضح وسط الغسيل 2 من لوحة microwells 6 آبار ونقل تعليق الخلية. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  9. اليوم 13: التعامل مع الخلايا بعد التجميع وتغيير وسائطها من اليوم 13 فصاعدا.
    ملاحظة: المجموعات حساسة للغاية وتتطلب معالجة دقيقة لضمان سلامتها وصلاحيتها في الأيام التالية. لذلك ، من الأهمية بمكان مراقبة المجموعات عن كثب خلال فترة ما بعد التجميع بعد اليوم 12. التقييم والتعديلات المنتظمة ضرورية لتعزيز النتائج الناجحة في العملية التجريبية.
    1. قم بإعداد الحجم اللازم من الأيام 13 المتوسطة (2 مل لكل بئر من صفيحة 6 آبار) ، وفي أنبوب مخروطي منفصل من 50 مل لليوم 15 إلى 20 وسط سلف الغدد الصماء البنكرياس.
    2. اجمع العناقيد ببطء من لوحة بئر microwells 6 في أنبوب مخروطي سعة 50 مل باستخدام ماصة p1000 وأطراف مصفاة 1000 ميكرولتر.
    3. أضف 1 مل من وسط اليوم 13 لجمع المجموعات المتبقية ونقل المجموعات إلى الأنبوب.
    4. دع الخلايا توضع بشكل طبيعي تحت الجاذبية في قاع الأنبوب المخروطي لمدة 5 دقائق.
    5. نضح أكبر قدر ممكن من المواد الطافية من الأنبوب دون إزعاج مجموعات الخلايا. يجب ألا تلمس أطراف الماصة أو تنقطح المجموعات ولكن المادة الطافية فقط.
    6. أضف الحجم اللازم من وسط اليوم 13 وفقا لما يلي: 1 بئر من الآبار الدقيقة 6 صفيحة بئر تذهب إلى ثلاثة آبار من صفيحة بئر 6 منخفضة التعلق (2 مل من الوسائط لكل بئر).
    7. ماصة بلطف صعودا وهبوطا ، وتجنب مجموعات الاستنشاق.
    8. انقل التعليق إلى لوحة بئر 6 منخفضة الالتصاق.
    9. حرك اللوحة بسرعة ذهابا وإيابا ، من جانب إلى آخر ست مرات.
    10. احتضان اللوحة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    11. قم بإجراء التغييرات المتوسطة في جميع الخطوات التالية حتى نهاية التمايز كما هو موضح في هذا القسم 2.9.
  10. الأيام 15 إلى 20
    1. التغيير إلى وسط المرحلة السلفية للغدد الصماء البنكرياس كل 48 ساعة حتى اليوم 21 من التمايز عن طريق جمع معلق الخلية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل واتباع الخطوات من 2.9.4 إلى 2.9.10 لليوم 13.
  11. الأيام 21 إلى 27
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، تتمايز المجموعات إلى خلايا β البنكرياس.
    1. تحضير البنكرياس β خلية المرحلة المتوسطة.
    2. قم بتغيير الوسيط كل يومين كما هو موضح للأيام من 15 إلى 21.
      ملاحظة: بعد اليوم 25 ، يمكن أن تخضع الكائنات العضوية الشبيهة بالجزيرة للتحليل للتأكد من أنها تعمل بكامل طاقتها.

3. تلطيخ مجموعات خلايا β البنكرياس

ملاحظة: نفذ هذه الخطوة لدراسة التقييم الوظيفي للمجموعات بعد التمايز

  1. اجمع من خمس إلى عشر مجموعات في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل في نهاية التمايز.
  2. ثبت مجموعات الخلايا ب 200 ميكرولتر من 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. أضف 1 مل من PBS إلى المجموعات وقم بإزالة PBS بطرف ماصة 1,000 ميكرولتر دون إزعاج المجموعات.
  4. أضف 200 ميكرولتر من السكروز 30٪ إلى المجموعات واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  5. انقل المجموعات إلى قالب التبريد ، وقم بإزالة السكروز الزائد ، وأضف قطرة من وسط O.C.T. ، وامزج المجموعات مع وسط O.C.T. .
  6. تجمد الكريومولد على الثلج الجاف وتخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
  7. قطع مقاطع 5 ميكرومتر من الكتلة المجمدة على شرائح المجهر باستخدام ميكروتوم / أو كريوستات.
  8. قم بتخزين الشرائح في الفريزر على حرارة -80 درجة مئوية حتى تلطيخها.
  9. في يوم التلوين ، أخرج الشرائح من الفريزر -80 درجة مئوية.
  10. قم بإزالة الثلج بعناية حول أقسام cryomold.
  11. ضع دائرة حول مجموعات الخلايا على الشرائح باستخدام قلم كاره للماء.
  12. أعد ترطيب الشرائح في وعاء تلطيخ الشرائح الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
  13. أضف الميثانول البارد إلى برطمان تلطيخ الشريحة وضع البرطمان مع الشرائح على حرارة -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  14. اغمر الشرائح في جرة PBS.
  15. كرر الخطوة 3.14 ثلاث مرات.
    ملاحظة: استخدم هذه الطريقة لجميع خطوات الغسيل التالية.
  16. قم بإزالة PBS من الشرائح وقم بتغطيتها على الفور ب 100 ميكرولتر من محلول الحجب مع 2-5٪ BSA في PBS-T.
  17. أضف محلول حظر لكل شريحة وقم بتغطيته بفيلم البارافين.
  18. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية).
  19. قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب باستخدام النسب المتوفرة في قسم الكواشف والمحاليل.
  20. قم بإزالة حل الحظر من الشرائح.
  21. أضف على الفور الأجسام المضادة المخففة وقم بتغطية الشرائح باستخدام parafilm لمنع جفاف الشريحة.
  22. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  23. في اليوم التالي ، اغسل الشرائح 3-5 مرات باستخدام PBS-T.
  24. تحضير الأجسام المضادة الثانوية المخففة وبقع الحمض النووي.
  25. قم بإزالة PBS-T الزائد من الشرائح.
  26. أضف الأجسام المضادة الثانوية المخففة وبقع الحمض النووي. احتضان لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية).
  27. اغسل الشرائح 3-5 مرات باستخدام PBS-T.
  28. قم بإزالة أي سائل من الشرائح.
  29. أضف قطرة من وسيط تركيب الأنسجة إلى كل قسم.
  30. قم بتغطية الشريحة بغطاء زجاجي.
  31. التقط صورا للشرائح الملطخة باستخدام مجهر الفلورسنت.

4. GSIS (فحص إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز)

  1. قم بإعداد ثلاثة حلول مختلفة: محلول KREBS منخفض الجلوكوز ، ومحلول KREBS عالي الجلوكوز ، ومحلول KREBS منخفض الجلوكوز مع KCl.
  2. قم بتسخين جميع المحاليل في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
  3. اختر بعناية حوالي 10 - 15 مجموعة من نفس الحجم باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر وانقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مل مع كمية صغيرة من الوسط المتمايز لتجنب جفاف المجموعات.
    ملاحظة: يجب أن تكون المجموعات مرئية للعين المجردة ، ولكن إذا لم يكن الأمر كذلك ، فضع اللوحة التي تحتوي على مجموعات متمايزة تحت مجهر مقلوب لتحديد المجموعات ونقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
  4. ضع الأنبوب مع مجموعات ووسط على رف أنبوب وانتظر حتى تغرق المجموعات في قاع الأنبوب.
  5. قم بشفط المادة الطافية ببطء باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر وأضف 200 ميكرولتر من محلول KREBS منخفض الجلوكوز.
  6. احتضان الجزر في محلول منخفض الجلوكوز لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: لضمان التقييم الدقيق لأرقام المجموعات والاتساق في التجارب ، ينصح بالتحقق من وجود جميع المجموعات في المحلول أثناء النقل ، لأنها تميل إلى الالتصاق بالأنبوب.
  7. قم بإزالة الأنبوب من الحاضنة ونضح ببطء 200 ميكرولتر من محلول KREBS دون استنشاق أي مجموعات.
  8. أضف 200 ميكرولتر من محلول KREBS منخفض الجلوكوز واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  9. نضح حجم 200 ميكرولتر من محلول KREBS منخفض الجلوكوز في أنبوب 500 ميكرولتر وتخزينه على الفور عند -80 درجة مئوية لقياسات الأنسولين. كرر لعلاجات منفصلة.
  10. لغسل المجموعات ، أضف 200 ميكرولتر من محلول KREBS بدون جلوكوز إلى الأنبوب الذي يحتوي على المجموعات. اسمح للمجموعات بالاستقرار في قاع الأنبوب ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج المجموعات.
  11. أضف 200 ميكرولتر من محلول KREBS عالي الجلوكوز واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  12. نضح 200 ميكرولتر من KREBS عالي الجلوكوز في أنبوب 500 ميكرولتر وتخزينه على الفور عند -80 درجة مئوية لقياس الأنسولين. كرر لعلاجات منفصلة.
  13. لغسل المجموعات ، أضف 200 ميكرولتر من محلول KREBS بدون جلوكوز إلى الأنبوب الذي يحتوي على المجموعات. اسمح للمجموعات بالاستقرار في قاع الأنبوب ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج المجموعات.
  14. أضف 200 ميكرولتر من محلول KCl KREBS وكرر ذلك للعلاجات المنفصلة.
  15. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  16. قم بنضح 200 ميكرولتر من محلول KCl KREBS في أنبوب سعة 500 ميكرولتر وقم بتخزينه على الفور عند -80 درجة مئوية لقياسات الأنسولين. كرر للعلاجات الأخرى.
  17. أضف 50 ميكرولتر من الماء عالي النقاء واستمر في قياس إجمالي محتوى الأنسولين.
  18. أضف 150 ميكرولتر من محلول الإيثانول الحمضي إلى الأنبوب مع الجزر الصغيرة والماء عالي النقاء.
  19. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل (12 - 15 ساعة).
  20. في اليوم التالي ، دوامة كل عينة.
  21. أداء صوتنة مع صوتنة الكهربائية تعيين إلى 20٪ الطاقة لمدة 1 ثانية لضمان تحلل كامل من الأنسجة الجزيرة.
    ملاحظة: كرر الخطوة 4.21 حتى لا تكون هناك مجموعات متبقية مرئية.
  22. أجهزة الطرد المركزي جميع العينات في 10000 × غرام لمدة 10 دقائق والحفاظ على طاف.
  23. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي النانوي ، والذي يمكن استخدامه بعد ذلك لتطبيع قياسات الأنسولين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يقدم البروتوكول الموصوف في هذه الورقة نهجا عالي الكفاءة للتمييز بين الخلايا الشبيهة ب β من hPSCs10. تستخدم هذه العملية نظام ثقافة 2D قابل للتطوير بسهولة ، مما يتيح استخدامه في بيئات تجريبية مختلفة ، مثل تمايز التعلم ، والمشاريع الصغيرة والمختبرات ، والاختبارات التجريبية لتقييم إ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يعتمد التمايز الناجح ل hPSCs إلى خلايا β البنكرياس على تحسين جميع جوانب الزراعة الروتينية ومرور hPSCs المختارة. وهذا يشمل التأكد من أن خط الخلية لديه نمط نووي طبيعي ، وسلبي لعدوى الميكوبلازما ، وخالي من جينومات البلازميد أو الناقل الفيروسي. علاوة على ذلك ، عند استخدام hiPSCs ، من المهم تجنب استخدا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

تم دعم إيناس الشرقاوي من قبل منحة دراسية لمرض السكري في المملكة المتحدة (BDA 18/0005934) إلى GAR ، التي تشكر أيضا Wellcome Trust لجائزة الباحث (212625 / Z / 18 / Z) ، UKRI MRC لمنحة البرنامج (MR / R022259 / 1) ، Diabetes UK لمنحة المشروع (BDA16 / 0005485) ، CRCHUM لصناديق بدء التشغيل ، Innovation Canada لجائزة John R. Evans Leader (CFI 42649) ، NIH-NIDDK (R01DK135268) للحصول على منحة مشروع، ومركز القاهرة لحقوق الإنسان، JDRF للحصول على منحة الفريق (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). كاميل ديون والدكتور هاري ليتش لمساعدتهما في توليد وثقافة hiPSCs البشرية ، منشأة NIHR Imperial BRC (مركز البحوث الطبية الحيوية) العضوية ، لندن.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge TubeStarlabsS1615-5500
6-well Cell culture plateThermoFisher Scientific165218
AggreWell 400 6-well plate STEMCELL Technologies34425
Anti-Glucagon Sigma-aldrichG2654-100UL
Anti-Insulin DakoA0564
Anti-NKX6.1Novus BiologicalsNBP1-49672SS
Anti-PDX1 Abcamab84987
AphidicolinSigma-AldrichA4487
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid freeSigma-AldrichA3803-100G
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC3306
Calcium/Magnesium free D-PBSThermo Fisher Scientific14190144
Cyclopamine-KAADCalbiochem239804
D-(+)-Glucose,BioXtraSigma-AldrichG7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrousSigma-Aldrich94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566016For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. 
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)Thermo Fisher Scientific10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slidesThermo Fisher Scientific10149870
EthanolVWR20821.33
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XXThermo Fisher ScientificJ64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor BasementThermo Fisher ScientificA1413302Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647Abcamab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633Thermo Fisher ScientificA-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11011
HeparinSigma-AldrichH3149
HEPES bufferSigma-AldrichH3375-500G
Hoechst 33342, TrihydrochlorideThermo Fisher ScientificH1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant ProteinThermo Fisher ScientificPHG0094
Hydrogen chlorideSigma-Aldrich295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP PenAgar ScientificAGG4582
LDN193189Sigma-AldrichSML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM9272-500G
OCT Compound 118 mLAgar ScientificAGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagentsThermo Fisher Scientific7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)Thermo Fisher Scientific,15070-063
Potassium chlorideSigma-Aldrich7447-40-7
Recombinant Human EGF ProteinR&D Systems236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mmVWR631-0137
RepSox (Hydrochloride)STEMCELL Technologies72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermo Fisher Scientific61870036For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014-500G
Sodium chlorideSigma-AldrichS3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrousSigma-Aldrich7558-80-7
STEMdiff Endoderm STEMCELL Technologies5110
StemFlex MediumThermo Fisher ScientificA3349401Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic AcidReprocell04-0021 
Thyroid Tormone 3 (T3)Sigma-AldrichT6397
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
TrypL Express Enzyme (1X)Thermo Fisher Scientific12604013
TWEEN 20Sigma-AldrichP2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension CultureThermo Fisher Scientific38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterThermo Fisher Scientific10977015
Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL Technologies72302
Zinc SulfateSigma-Aldrich Z4750

References

  1. Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  4. Nair, G. G., Tzanakakis, E. S., Hebrok, M. Emerging routes to the generation of functional β-cells for diabetes mellitus cell therapy. Nature Reviews Endocrinology. 16 (9), 506-518 (2020).
  5. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. American Diabetes Association. Diabetes Care. 32 (Supplement_1), S62-S67 (2009).
  6. Sui, L., et al. β-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells. Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).
  7. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  8. Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. Generation of insulin-producing pancreatic β-cells from multiple human stem cell lines. Nature Protocols. 16 (9), 4109-4143 (2021).
  9. Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (8), 1940-1953 (2007).
  10. Sui, L., Leibel, R. L., Egli, D. Pancreatic β-cell differentiation from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68(2018).
  11. Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), 141553(2021).
  12. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  13. Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. Metabolic and functional specialisations of the pancreatic β-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity. Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).
  14. Micallef, S. J., et al. INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells. Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).
  15. Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth. Science. 245 (4919), 752-755 (1989).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved