الخلايا اللحمية الوسيطة المشتقة من الدهون المزروعة بشكل مشترك مع الخلايا الدبقية المختلطة الأولية لتقليل الالتهاب الناجم عن البريون

Summary

تتمتع الخلايا اللحمية المتوسطة المشتقة من الدهون (AdMSCs) بخصائص مناعية قوية مفيدة لعلاج الأمراض المرتبطة بالالتهاب. نوضح كيفية عزل وزراعة الفئران AdMSCs والدبقية المختلطة الأولية ، وتحفيز AdMSCs لتنظيم الجينات المضادة للالتهابات وعوامل النمو ، وتقييم هجرة AdMSCs ، و AdMSCs للثقافة المشتركة مع الخلايا الدبقية الأولية المصابة بالبريون المختلط.

Abstract

الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي منظمات قوية للالتهابات من خلال إنتاج السيتوكينات المضادة للالتهابات ، والكيموكينات ، وعوامل النمو. تظهر هذه الخلايا القدرة على تنظيم الالتهاب العصبي في سياق الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض البريون واضطرابات اختلال البروتين الأخرى. يمكن أن تكون أمراض البريون متفرقة أو مكتسبة أو وراثية. يمكن أن تنتج عن اختلال وتجميع بروتين البريون في الدماغ. هذه الأمراض قاتلة دائما ، مع عدم وجود علاجات متاحة.

واحدة من أولى علامات المرض هي تنشيط الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة والالتهابات المرتبطة بها ، والتي تحدث قبل تراكم البريون القابل للكشف وفقدان الخلايا العصبية. وبالتالي ، يمكن حصاد الخصائص المضادة للالتهابات والتنظيمية ل MSCs لعلاج داء النجوم في مرض البريون. في الآونة الأخيرة ، أظهرنا أن MSCs المشتقة من الدهون (AdMSCs) المزروعة بشكل مشترك مع خلايا BV2 أو الخلايا الدبقية المختلطة الأولية تقلل الالتهاب الناجم عن البريون من خلال إشارات paracrine. تصف هذه الورقة علاجا موثوقا به باستخدام AdMSCs المحفزة لتقليل الالتهاب الناجم عن البريون.

يمكن بسهولة عزل مجموعة متغايرة الزيجوت من AdMSCs من الأنسجة الدهنية للفئران وتوسيعها في الثقافة. إن تحفيز هذه الخلايا بالسيتوكينات الالتهابية يعزز قدرتها على الهجرة نحو تجانس الدماغ المصاب بالبريون وإنتاج معدلات مضادة للالتهابات استجابة لذلك. معا ، يمكن استخدام هذه التقنيات للتحقيق في الإمكانات العلاجية ل MSCs على عدوى البريون ويمكن تكييفها مع أمراض اختلال البروتين والالتهابات العصبية الأخرى.

Introduction

يلعب الالتهاب الدبقي دورا رئيسيا في مجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون والزهايمر ومرض البريون. على الرغم من أن تراكم البروتين غير الطبيعي يعزى إلى الكثير من التسبب في المرض والتنكس العصبي ، إلا أن الخلايا الدبقية تلعب أيضا دورا في تفاقم ^{هذا 1،2،3}. لذلك ، فإن استهداف الالتهاب الدبقي هو نهج علاجي واعد. في مرض البريون ، يختلط بروتين البريون الخلوي (PrP^C) إلى بروتين البريون المرتبط بالمرض (PrP^Sc) ، والذي يشكل oligomers ويتجمع ويعطل التوازن في الدماغ ^4،5،

Protocol

تم تربية الفئران وصيانتها في مختبر الموارد الحيوانية في ولاية كولورادو ، المعتمد من قبل جمعية تقييم واعتماد المختبر رعاية الدولية ، وفقا للبروتوكول # 1138 ، الذي وافقت عليه لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة ولاية كولورادو.

1. عزل وإصابة الخلايا الدبقية المختلطة القشرية الأولية بالبريونات

1. لعزل الخلايا الدبقية المختلطة الأولية التي تحتوي على كل من الخلايا النجمية والدبقية الصغيرة ، احصل على C57Bl / 6 من جراء الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين صفر إلى يومين.
   ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من البروتوكولات السابقة ^15،16.
2. القتل الرحيم للجراء واحدا ت....

النتائج

تحفيز AdMSCs مع TNFα أو إنترفيرون جاما (IFNγ) لمدة 24 ساعة يؤدي إلى تغييرات في التعبير عن الجزيئات المضادة للالتهابات وعوامل النمو. يؤدي علاج AdMSCs باستخدام TNFα أو إنترفيرون جاما (IFNγ) إلى زيادة الجين المحفز لعامل نخر الورم 6 (TSG-6) mRNA ، في حين أن TNFα ، ولكن ليس IFNγ ، يسبب زيادة في تحويل عامل النمو بيت?.......

Discussion

نوضح هنا بروتوكولا موثوقا وغير مكلف نسبيا لتقييم آثار الخلايا اللحمية المتوسطة المشتقة من الدهون (AdMSCs) في تقليل الالتهاب الناجم عن البريون في نموذج الخلايا الدبقية. يمكن بسهولة عزل AdMSCs وتوسيعها في الثقافة لاستخدامها في أقل من أسبوع 1. ينتج هذا البروتوكول باستمرار مجموعة غير متجانسة من الخ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641