التنميط الظاهري للخلايا العصبية الدوبامينية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية في الدماغ المتوسط

Summary

يصف هذا البروتوكول زراعة الخلايا للخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط البشري ، يليها تلطيخ مناعي وتوليد ملامح النمط الظاهري للخلايا العصبية من الصور المجهرية عالية المحتوى المكتسبة مما يسمح بتحديد الاختلافات المظهرية بسبب التحويرات الجينية أو الكيميائية.

Abstract

يرتبط مرض باركنسون (PD) بمجموعة من العمليات البيولوجية الخلوية التي تسبب فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط (mDA). تفتقر العديد من النماذج الخلوية PD الحالية في المختبر إلى التعقيد ولا تأخذ في الاعتبار الأنماط الظاهرية المتعددة. يمكن أن يعالج التنميط الظاهري في الخلايا العصبية mDA المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) التي يسببها الإنسان أوجه القصور هذه عن طريق قياس مجموعة من الأنماط الظاهرية العصبية في وقت واحد في نوع الخلية ذات الصلة PD بالتوازي. هنا ، نصف بروتوكولا للحصول على ملفات تعريف النمط الظاهري وتحليلها من الخلايا العصبية mDA البشرية المتاحة تجاريا. يتم استخدام لوحة تلطيخ الفلورسنت الخاصة بالخلايا العصبية لتصور الأنماط الظاهرية ذات الصلة بالبروتين النووي ، α-synuclein ، هيدروكسيلاز التيروزين (TH) ، والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2 (MAP2). بروتوكول التنميط الظاهري الموصوف قابل للتطوير لأنه يستخدم ألواح 384 بئرا ومعالجة السوائل التلقائية والفحص المجهري عالي الإنتاجية. تتمثل فائدة البروتوكول في استخدام الخلايا العصبية mDA المانحة السليمة والخلايا العصبية mDA التي تحمل طفرة G2019S المرتبطة ب PD في جين كيناز 2 (LRRK2) الغني بالليوسين. تمت معالجة كلا خطي الخلايا بمثبط كيناز LRRK2 PFE-360 وتم قياس التغيرات الظاهرية. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح كيف يمكن تحليل ملفات تعريف النمط الظاهري متعددة الأبعاد باستخدام طرق التصنيف الخاضعة للإشراف القائمة على التجميع أو التعلم الآلي. سيثير البروتوكول الموصوف اهتمام الباحثين الذين يعملون على نمذجة الأمراض العصبية أو دراسة تأثيرات المركبات الكيميائية في الخلايا العصبية البشرية.

Introduction

يتم إزعاج مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية الخلوية في مرض باركنسون (PD). على سبيل المثال ، ارتبط الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا ، والإجهاد التأكسدي ، وعيوب تحلل البروتين ، وتعطيل الاتجار الحويصلي ووظيفة الليزوزومات الداخلية بفقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط (mDA) ، ويلاحظ بشكل شائع في PD¹. لذلك ، يبدو أن مرض باركنسون ينطوي على آليات مرضية متعددة يمكن أن تتفاعل مع بعضها البعض وتزيد من تفاقمها. تتمثل إحدى الطرق المفيدة للتحقيق في هذا التفاعل الميكانيكي في إنشاء بصمة مظهرية شاملة أو ملف تعريف للخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط (mDA).

التنميط الظاهري هو نهج يتضمن إنشاء ملف تعريف لعينة بن....

Protocol

1. تحضير الوسط والألواح لبذر الخلايا العصبية (اليوم الأول)

1. لتحضير الأطباق لبذر الخلايا العصبية في اليوم 1 ، قم بتسخين اللامينين إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام مباشرة. تحضير محلول Laminin عن طريق تخفيف محلول مخزون Laminin (0.1 مجم / مل) 1/10 في PBS +/+ البارد (مع Ca 2+ و Mg²⁺).
   ملاحظة: جميع الكواشف مدرجة في جدول المواد. يتم وصف تركيبات الحلول والمخازن المؤقتة في الجداول 1-4.
2. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولتر من محلول Laminin إلى كل بئر من لوحة Poly-D-Lysine (PDL) المغلفة مسبقا ب 384 بئرا ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. يمكن تخزين الألواح المطلية في درجة حرارة 4 ....

النتائج

يعد التنميط الظاهري في الخلايا العصبية mDA طريقة فعالة لتحديد جوانب متعددة من البيولوجيا الخلوية وتغيراتها أثناء التعديل التجريبي. لتجسيد هذه المنهجية ، استخدمت هذه الدراسة LRRK2 G2019S المحفوظة بالتبريد والخلايا العصبية mDA المانحة الصحية. تم تمييز هذه الخلايا العصبية لمدة 37 يوما تقريبا ، وهي ?.......

Discussion

التنميط الظاهري هو تقنية لقياس عدد كبير من الأنماط الظاهرية في الخلايا عن طريق تطبيق تلطيخ الفلورسنت والفحص المجهري وتحليل الصور³. يمكن الحصول على ملامح النمط الظاهري ومقارنتها عبر خطوط الخلايا أو الظروف التجريبية الأخرى لفهم التغيرات المعقدة في البيولوجيا الخلوية التي قد ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.