إنشاء نموذج للفئران الناسور الفموي الأنفي

Summary

توضح هذه المقالة إجراء خطوة بخطوة لإنشاء نموذج الفئران مع الناسور الفموي. تم إنشاء الناسور الفموي الأنفي عن طريق استخدام الكي العيني الساخن لإتلاف جزء خط الوسط من الحنك الصلب ، مما أدى إلى تكوين فتحة بين تجاويف الفم والأنف.

Abstract

تقدم هذه الدراسة طريقة تستخدم الكي العيني الساخن لتطوير نموذج قابل للتطبيق لفحص الناسور الفموي الأنفي. تم استخدام الفئران C57BL / 6 لإنشاء نموذج الناسور الفموي الأنفي (ONF). لإنشاء ONF ، تم تخدير الفئران وشل حركتها وكشف حنكها الصلب. أثناء العملية الجراحية ، تم إحداث إصابة مخاطية كاملة السماكة 2.0 × 1.5 مم في خط الوسط من الحنك الصلب باستخدام الكي العيني. كان من الضروري التحكم في حجم ONF وتقليل النزيف من أجل ضمان نجاح التجربة. تم التحقق من فعالية نموذج ONF في اليوم 7 بعد العملية ، بما في ذلك التقييمات التشريحية والوظيفية. أكد وجود الحاجز الأنفي داخل تجويف الفم وتدفق الماء المعقم من الخياشيم عند الحقن في تجويف الفم الإنشاء الناجح لنموذج ONF. أظهر النموذج ناسور فموي أنفي عملي وناجح ، يتميز بمعدل وفيات منخفض ، وتغيرات كبيرة في الوزن ، واختلاف ضئيل في حجم ONF. قد تنظر الدراسات المستقبلية في اعتماد هذه المنهجية لتوضيح آليات التئام جروح الحنك واستكشاف علاجات جديدة للناسور الفموي الأنفي.

Introduction

الناسور الفموي الأنفي (ONF) ، وهو فتحة غير طبيعية بين تجاويف الفم والأنف ، يظهر سريريا كعيب في منطقة هيكلية من العملية السنخية إلى اللهاة ، والتي تحدث عادة كمضاعفات بعد إصلاح الحنك المشقوق¹. يعاني المرضى الذين يعانون من ONF من ارتجاع الطعام واضطرابات النطق وضعف وظيفة البلعوم ، مما يؤثر بشكل كبير على نوعية حياتهم²،^3،4. يتراوح معدل ONF بعد الجراحة من 2.4٪ إلى 55٪ بسبب عوامل مثل عرض الشق ونوع Veau والطريقة الجراحية⁵،^6،7،8. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معدل التكرار بعد إصلاح ONF مرتفع ، يتراوح من 0٪ إلى 43٪ ⁹.

أظهرت العديد من العلاجات الجديدة مؤخرا واعدة في مجال ONF ، بما في ذلك المواد المختلفة والأدوية والتقنيات الجديدة 10،¹¹،12،13،14،15،^16،17. يعد التقييم الدقيق للآثار العلاجية أمرا ضروريا لأنه يوفر الأساس لاختيار علاجات ONF وتطويرها. ومع ذلك ، فإن الحصول على تقييم صالح على المدى القصير للآثار العلاجية بخلاف الجراحة يمثل تحديا ، حيث تختلف خصائص ONFs بين المرضى المختلفين. لذلك ، يعد إنشاء نموذج مرض ONF ضروريا للتحقق من فعالية طرق العلاج هذه.

لعدة عقود ، ابتكر الباحثون نموذج الناسور الفموي الأنفي (ONF) في أنواع حيوانية مختلفة ، بما في ذلك الفئران¹⁸،¹⁹ ، والخنازير^{الصغيرة 20،21} ، والخنازير^{الصغيرة 22} ، ^{23 ،} حيث تمتلك هذه الأنواع حنكا صلبا كبيرا مناسبا للتلاعب الجراحي. ومع ذلك ، فإن الفئران لديها تسلسل جيني وجينوم كامل مشابه لجينوم البشر ، مما يجعلها نموذجا مهما للبحث وتطوير أدوية جديدة²⁴،^25،26. علاوة على ذلك ، تقدم الفئران اختلافا طفيفا من دفعة إلى أخرى ، مما يجعلها خيارا مناسبا لإنشاء نموذج ONF¹²،^13،27.

ومع ذلك ، لم يتم وصف الخطوات التفصيلية لإنشاء ONF ، ولم يتم أخذ استقرار حجم ONF في الاعتبار. بالإضافة إلى ذلك ، اعتمد التحقق من تكوين ONF فقط على الملاحظة²⁸ ، دون ضمان الاتصال المباشر بين تجاويف الفم والأنف. لم يتم إثبات ذلك من خلال وسائل أخرى ، مثل فقدان الفأر لوزن الجسم بسبب صعوبات في الأكل بسبب ONF. علاوة على ذلك ، لم يتم النظر في الاختلاف الطبيعي في حجم الجرح ، وهو أمر بالغ الأهمية للدراسات حول الأدوية أو المواد التي تعزز أو تمنع التئام الجروح. لذلك ، هناك حاجة ماسة لإنشاء نموذج ONF مستقر ومصدق عليه.

كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير نموذج عملي ل ONF يعالج القضايا المذكورة أعلاه ، على أمل أن يكون هذا البروتوكول بمثابة أساس للبحث المستقبلي حول آليات التئام الجروح الحنكية والعلاجات الجديدة ل ONF.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لكلية غرب الصين لطب الأسنان بجامعة سيتشوان. تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6 (إناث) في هذه الدراسة.

1. التحضير الجراحي

1. اجمع الأدوات الجراحية اللازمة للإجراء: الإنبات ، الكي العيني ، المقص المجهري ، ملاقط الجراحة المجهرية ، المحاقن ، والإبر (26 جم × 0.63 بوصة) (الشكل 1 أ ، ب) (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: قبل العملية الجراحية ، الأوتوكلاف الأدوات الجراحية ، بما في ذلك الكي العيني ، وملاقط الجراحة المجهرية ، ومقص الجراحة المجهرية ، عند 102.9 كيلو باسكال (1.05 كجم / سم²) و 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
2. اجمع المستلزمات الجراحية المطلوبة: الستائر الجراحية ، وقفازات اللاتكس ، والقطن المعقم ، والصفائح المعقمة ، والرقائق المعدنية المعقمة ، ولوح الرغوة كمنصة جراحية ، والأربطة المطاطية (التي يمكن الحصول عليها عن طريق تمزيق قفاز اللاتكس الطبي) ، والشريط (الشكل 1 ج) (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: استخدم مجموعة منفصلة من المستلزمات لكل ماوس ، بما في ذلك المحاقن والأغطية المعقمة للمجال الجراحي.
3. نظف المنطقة الجراحية والجهاز (مصدر الضوء ، لوح الرغوة ، وجهاز صيانة درجة الحرارة ، انظر جدول المواد) باستخدام مناديل الكحول. قم بتغطية مقابض ومقابض الأدوات التي قد تكون مطلوبة أثناء الإجراء بورق معدني معقم.
4. افتح الأدوات الفردية بشكل معقم وضعها بعناية في منطقة الجراحة. قم بتنشيط germinator (انظر جدول المواد) والأضواء للاستخدام أثناء الإجراء. ضع كي العيون في الإنبات وقم بتسخينه إلى 250 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

2. الإجراء الجراحي

1. قم بإجراء تثبيت الماوس وافتح تجويف الفم باتباع الخطوات أدناه.
   1. حدد أنثى ماوس C57BL / 6J تزن 20-25 جم وتتراوح أعمارها بين 8 و 12 أسبوعا. منزل الماوس لمدة 7 أيام قبل إجراء أي إجراءات.
   2. تخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق ل Zoletil50 (80 ملغم / كغم) و Xylazine (5 ملغ / كغ) (انظر جدول المواد). تطبيق مرهم العين العينية على عين الماوس. انتظر حتى لا يكون هناك استجابة قرصة إصبع القدم.
      ملاحظة: الماوس جاهز للإجراء عندما يكون غير قادر على الدوران بشكل مستقل.
   3. ثبت الماوس على لوح رغوي مبطن بألواح معقمة. استخدم الشريط لربط الماوس بالمنصة الجراحية في وضع ضعيف (الشكل 2 أ).
   4. افتح تجويف الفم للماوس. ضع إبرتين (26 جم × 0.63 بوصة) أمام مستوى الأذن المدارية واثنتين أخريين خلفها. ضع شريطا مطاطيا حول الإبر واعبر القواطع لإبقاء الفم مفتوحا. استخدم ملاقط الجراحة المجهرية لدعم فتح زوايا الفم (الشكل 2 ب).
      ملاحظة: تأكد من أن الحنك الصلب مكشوف بوضوح. ثبت اللسان تحت الشريط المطاطي لمنع انسداد مجال الرؤية والحرق أثناء التجارب اللاحقة.
2. قم بإنشاء الناسور الفموي الأنفي (ONF) على الحنك الصلب (الشكل 3A-F).
   1. استرجع الكي العيني الذي تم تسخينه إلى 250 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ضع طرف الكي على بعد 1 مم من تقاطع خط الوسط للحنك وخط الضاحك الأول ، مما يؤدي إلى إصابة مخاطية كاملة السماكة للحنك الصلب في خط الوسط.
      ملاحظة: تجنب حرق لسان الماوس.
   2. بعد بضع ثوان ، قم بإزالة الكي العيني عندما يتحول الغشاء المخاطي حول طرف الكي إلى اللون الأبيض.
   3. ضع الكي العيني في المنبت واستمر في تسخينه إلى 250 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. كرر الخطوة السابقة لتكبير الجرح حول الحواف حتى يصل طوله إلى 2.0 مم وعرضه 1.5 مم.
      ملاحظة: يجب أن يتبع كل امتداد حافة الإصابة الأخيرة. استخدم الفرجار ذو الورنية لقياس طول وعرض الإصابة. يجب أن تغطي الإصابة 10 ٪ من الحنك.
   4. استخدم مقص الجراحة المجهرية لإزالة أي أنسجة رخوة مشوهة زائدة حول الجرح. استخدم القطن المعقم لوقف النزيف ومنع اختناق الماوس بالاستنشاق. قم بقياس الجرح للتأكد من أنه يشكل إصابة مخاطية حنكية صلبة كاملة السماكة بقياس 2.0 × 1.5 مم في خط الوسط.

3. رعاية ما بعد الجراحة

1. تطبيق ميلوكسيكام للفأر في وقت الاستيقاظ بعد العملية الجراحية، بجرعة 5 ملغ/كغ/يوم لمدة 3 أيام،^{تحت الجلد 29}.
2. ضع الماوس على جهاز صيانة درجة الحرارة حتى يستعيد وعيه بالكامل.
   ملاحظة: تأكد من وضع الماوس بطريقة تسهل التنفس. قم بتدوير الفئران كل 10-15 دقيقة لمنع تجمع الدم أو انهيار فصوص الرئة. بمجرد تسخين الماوس ، أعده إلى قفصه. توفير هلام معقم وتغذية مشعة في الجزء السفلي من القفص للفئران لتستهلك.

4. التحقق من خلق الناسور الفموي الأنفي

ملاحظة: يتم تقييم نجاح إنشاء الناسور الفموي الأنفي (ONF) في اليوم 7 بعد العملية الجراحية.

1. تحضير المستلزمات الجراحية اللازمة: الشريط المطاطي ، الشريط ، المحاقن ، الستائر الجراحية ، قفازات اللاتكس ، الألواح المعقمة ، الرقائق المعدنية المعقمة ، ولوح الرغوة.
2. ارتداء الستائر الجراحية والقفازات المعقمة للحفاظ على الظروف المعقمة. قم بتطهير لوح الرغوة ومصدر الضوء وجهاز صيانة درجة الحرارة بالكحول.
3. تحفيز التخدير العام عن طريق الحقن داخل الصفاق من زوليتيل 50 (80 ملغ/كغ). انتظر حتى لا يكون هناك استجابة قرصة إصبع القدم. استخدم نفس الطريقة الموضحة في الخطوتين 2.1.3 و 2.1.4 لشل حركة الماوس وكشف الحنك الصلب.
4. قم بإجراء التحقق الهيكلي التشريحي من خلال التأكد من أن الحاجز لا يزال مرئيا في موقع الجرح ، مما يشير إلى نجاح إنشاء ONF (الشكل 4 أ ، ب).
5. إجراء التحقق الوظيفي: أغلق تجويف الفم للماوس وحقن الماء المعقم في تجويف الفم باستخدام حقنة معقمة. يتم تأكيد الإنشاء الناجح ل ONF عندما يتدفق السائل من أنف الماوس.
6. ضع الماوس على جهاز صيانة درجة الحرارة (37 درجة مئوية) حتى يستعيد وعيه بالكامل. قم بتدوير الفئران كل 10-15 دقيقة لمنع تجمع الدم أو انهيار فصوص الرئة.

النتائج

لتقييم جدوى واستقرار هذه الطريقة التجريبية ، تم تنفيذ نفس الإجراء على عشرة فئران ، وتم إجراء ملاحظات بشأن الوفيات ، والتغيرات في حجم الجرح ، ووزن الجسم ، والتحليل النسيجي. تم القتل الرحيم للفئران في اليوم 7.

أظهر الإجراء معدل وفيات منخفض. كان الكي العيني والإنبات ، الموضح في ...

Discussion

استكشف الباحثون العديد من المواد والأدوية والتقنيات الجديدة لعلاج ONF¹⁰،11،12،13،14،15،^16،17. مع التقدم في العمليات الجراحية ، تم تقليل حدوث وتكرار O...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Germinator	Electron Microscopy Sciences	66118-20	Heating and disinfection equipment
Latex gloves	Allmed		or similar
Lights	Olympus	A1813
Meloxicam	MedChemExpress	HY-B0261	crushed; 5 mg/kg
Microsurgical instruments (scissors and tweezers)	Jiangsu Tonghui Medical Devices Co.	M-Y-0087	Surgical instrument
Ophthalmologic cautery	Suqian Wenchong Medical Equipment Co.	1.00234E+13	Surgical instrument
Sterile cotton,	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Sterile metal foil	Biosharp		or similar
Sterile sheets	3M	XH003801129	or similar
Surgical drapes	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Syringes	Yancheng Begu Technology Co.	S-015301	or similar
Tape	Bkmamlab		or similar
Temperature maintenance device	Harvard Apparatus	LE-13-2104
Zoletil50	Virbac		80 mg/kg