تتبع الدهون الجديدة باستخدام وسم النظائر المستقرة LC-TIMS-TOF MS / MS

Summary

تظهر هنا طريقة لفحص التراكيب الليبيدة من خلال وضع العلامات على النظائر المستقرة باستخدام وقت الاحتفاظ بها وحركتها وتجزئتها.

Abstract

الليبيدات شديدة التنوع ، ويمكن أن يكون للتغيرات الصغيرة في هياكل الدهون وتكوينها تأثيرات عميقة على الوظائف البيولوجية الحرجة. يوفر وضع العلامات على النظائر المستقرة (SIL) العديد من المزايا لدراسة توزيع الدهون وتعبئتها واستقلابها ، بالإضافة إلى تخليق الدهون من جديد . يتطلب التنفيذ الناجح لتقنية SIL إزالة التداخلات من الجزيئات الداخلية. في العمل الحالي ، نصف بروتوكولا تحليليا عالي الإنتاجية لفحص دهون SIL من العينات البيولوجية. سيتم عرض أمثلة على تحديد الدهون دي نوفو أثناء تطور مبيض البعوض. يسمح استخدام الكروماتوغرافيا السائلة التكميلية لقياس مطياف الحركة الأيونية المحاصرة وقياس الطيف الكتلي بالفصل وتخصيص الدهون من عينة واحدة في مسح واحد (<1 ساعة). يستفيد النهج الموصوف من التطورات الأخيرة في الاستحواذ المعتمد على البيانات والاكتساب المستقل للبيانات ، باستخدام التراكم المتوازي في فخ التنقل متبوعا بالتجزؤ المتسلسل والتفكك الناجم عن الاصطدام. يكشف قياس SIL على مستوى سلسلة الأحماض الدهنية عن تغيرات في ديناميكيات الدهون أثناء تطور المبيض للبعوض. يتم تعيين هياكل الدهون الجديدة بثقة بناء على وقت الاحتفاظ بها وحركتها ونمط تجزئتها.

Introduction

عند تحليل بيانات الدهون ، يعد وضع العلامات على النظائر المستقرة (SIL) طريقة فعالة لتقييم المسارات الأيضية في الكائنات الحية. في هذه الطريقة، تستبدل الذرات الموجودة داخل المادة المراد تحليلها بنظائر مستقرة تحتوي على ¹³C أو ²H. يتم دمج هذه النظائر بشكل أكبر في السلائف ، والتي يتم تضمينها لاحقا داخل الأحماض الدهنية ، مع تسمية المناطق التي توجد فيها. باستخدام هذه النظائر ، يمكن للمرء تحديد توزيع الدهون واستقلابها ، لأنها ستتناقض مع الخلفية غير المسماة¹. منصات قياس الطيف الكتلي الشائعة غير قادرة على تمييز الإشارة القادمة من الجزيئات الداخلية². يتطلب نجاح SIL استخدام أدوات تحليلية فائقة الدقة. يسمح الكروم....

Protocol

1. إعداد العينة

1. تشريح الحشرات
   1. تشريح مبيض البعوضة Aedes aegypti عندما يبلغ عمرها 7 أيام في محلول ملحي مخزن بالفوسفات باستخدام الإبر الدقيقة.
   2. اجمع ثمانية مبايض من محلول ملحي مخزن بالفوسفات باستخدام الإبر الدقيقة واحفظها في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل عند -80 درجة مئوية.
   3. جمع المبايض في النسخ المتماثلة البيولوجية.
2. استخراج الدهون
   1. أضف 10 ميكرولتر من المعيار الداخلي (ISTD) إلى المبايض الثمانية التي تم جمعها بتركيز 1 جزء في المليون. ISTD هو خليط دهني مسمى مع سبعة ديوتيريوم من 1-بنتاديكانويل-2-أوليويل-سن-جليسيرو-3-فوسفوكولين-D7 (15: 0-18: 1 (D7) PC) ، ليسوفوسفاتيديل كولين-D7 (18....

النتائج

يسهل وضع العلامات على النظائر المستقرة تصور الدهون الثلاثية في دراسات ديناميات الدهون لمبيض البعوض الأنثوي. في مجال التنقل ثنائي الأبعاد ، يتم عرض الدهون الثلاثية 48: 1 في منطقة ذات وقت احتفاظ محدد فيما يتعلق بالتنقل 1 / K₀. يمكن تصور شدة الدهون الثلاثية بخط أزرق أغمق. تمثل البقع الأخرى ?.......

Discussion

عند تقييم استخدام هذا البروتوكول ، من الضروري التأكد من أن معلمات DIA-PASEF و MS / MS قابلة للتطبيق على الدهون الثلاثية المعنية. على وجه التحديد ، يجب أن تتبع نوافذ التنقل وعرض النافذة نمط الدهون الثلاثية. يمكن تحديد ذلك من خلال تشغيل سابق باستخدام طريقة DDA. عند تتبع الدهون الثلاثية في المعيار الد?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36