تنميط المجتمع البكتيري لتخمير عنب الترامينيت أثناء إنتاج النبيذ باستخدام تسلسل الأمبليكون الميتاجينومي

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لوصف amplicon metagenomic لتحديد المجتمع البكتيري لعنب Traminette والعنب المخمر والنبيذ النهائي.

Abstract

أدى التقدم في تكنولوجيا التسلسل وسهولة الوصول نسبيا إلى استخدام أدوات المعلوماتية الحيوية لتحديد هياكل المجتمع الميكروبي إلى تسهيل فهم أفضل لكل من الميكروبات القابلة للزراعة وغير القابلة للزراعة في العنب والنبيذ. أثناء التخمير الصناعي ، غالبا ما تكون الميكروبات ، المعروفة وغير المعروفة ، مسؤولة عن تطوير المنتج وخارج النكهة. لذلك ، فإن تنميط البكتيريا من العنب إلى النبيذ يمكن أن يتيح فهما سهلا للديناميكيات الميكروبية في الموقع . في هذه الدراسة ، يجب أن تخضع بكتيريا عنب Traminette للتخمير ، وتعرض النبيذ النهائي لاستخراج الحمض النووي الذي أسفر عن 15 نانوغرام / ميكرولتر إلى 87 نانوغرام / ميكرولتر. تم تسلسل amplicon 16S للمنطقة شديدة التغير في منطقة V4 ، وهي بكتيريا وفيرة نسبيا تتكون من شعب Proteobacteria و Actinobacteriota و Firmicutes و Bacteroidota و Fusobacteriota وتليها Verrucomicrobiota و Halobacterota و Desulfobacterota و Myxococcota و Acidobacteriota. كشف تحليل مخطط فين للوحدات التصنيفية التشغيلية الفريدة المشتركة (OTU) أن 15 شعبة بكتيريا كانت مشتركة بين كل من العنب ومرحلة التخمير والنبيذ النهائي. تم الكشف عن الشعب التي لم يتم الإبلاغ عنها سابقا باستخدام تسلسل amplicon 16S ، وكذلك أجناس مثل Enterobacteriaceae و Lactobacillaceae. تم اختبار التباين في استخدام المغذيات العضوية في النبيذ وتأثيره على البكتيريا. خزان Traminette R يحتوي على Fermaid O و Traminette L محفز مع Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. حدد تنوع ألفا باستخدام اختبار Kruskal-Wallis درجة التكافؤ. أشار تنوع بيتا إلى حدوث تحول في البكتيريا في مرحلة التخمير للعلاجين ، وبدت بكتيريا النبيذ النهائية متشابهة. أكدت الدراسة أنه يمكن استخدام تسلسل 16S amplicon لمراقبة تغيرات البكتيريا أثناء إنتاج النبيذ لدعم الجودة والاستخدام الأفضل لبكتيريا العنب أثناء إنتاج النبيذ.

Introduction

يتميز عنب Traminette بإنتاج جودة نبيذ فائقة ، بالإضافة إلى محصول ملموس ومقاومة جزئية للعديد من الالتهابات الفطرية^1،2،3. يعتمد التخمير الطبيعي للعنب على الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة به ، وبيئة إنتاج النبيذ ، وأوعية التخمير ^4,5. في كثير من الأحيان ، تعتمد العديد من مصانع النبيذ على الخميرة البرية والبكتيريا للتخمير وإنتاج الكحول والإسترات والرائحة وتطوير النكهة⁶.

الهدف من هذه الدراسة هو فحص التركيب البكتيري للعنب ومراقبة ديناميكياته أثناء التخمير. على الرغم من أن ال....

Protocol

1. إنتاج النبيذ التجريبي

1. احصل على عنب Traminnette من نبيذ Dynamis Estate في كرم جونسفيل بولاية نورث كارولينا ، وقم بإزالته ، وسحقه لتحريره في جهازي تخمير منفصلين مفتوحين سعة 600 لتر واتركه على الجلود لمدة 4 أيام تقريبا مع وضع الأغطية.
2. قم بضرب الأغطية مرة واحدة يوميا للحفاظ على رطوبة القشرة والحد من إنتاج الأحماض المتطايرة (VA).
   ملاحظة: الفكرة هي أن الكثير من السلائف العطرية (monoterpenes) تقع في الجلود وتترك العصير ملامسا للجلد لزيادة الإمكانات العطرية للنبيذ.
3. بعد 4 أيام ، الملعب Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). تم اختيار هذه الخميرة لأنها مخمرة قوية وترتبط بتعزيز الطابع المتن....

النتائج

يجب أولا تحديد كمية ونوعية الحمض النووي المستخرج من العنب ، وتخمير النبيذ ، والنبيذ النهائي. تتراوح قيمة الكمية من 15-87 نانوغرام / ميكرولتر (الجدول 1).

التسلسل والمعلوماتية الحيوية
أنشأ جهاز التسلسل عالي الإنتاجية Illumina ملف FASTQ تم استيراده إلى Nephele .......

Discussion

يبدأ بروتوكول metagenomics من أخذ عينات من العنب يجب ، وعندما تمت إضافة الخميرة إلى الضرورة ، والنبيذ المخمر وعينات النبيذ النهائية. تبع ذلك استخراج الحمض النووي المكرر الذي تم استخلاصه بنجاح من هذه العينات. وتراوحت الكميات التي تم الحصول عليها في التركيز من 15 نانوغرام/ميكرولتر إلى 87 نانوغرام/م.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel	Promega, Madison, WI USA	V3121	Electrophoresis
FastPrep DNA spinKit for soil	MP Biomedicals, Solon, OH USA	116560-200	DNA extraction
FastQC software	Babraham Institute, United Kingdom		Bioinformatics
Fermaid O	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation
High-Fidelity PCR Master Mix	New England Biolabs, USA	F630S	Polymerase chain reaction for sequencing
NEBNext Ultra	New England Biolabs, USA	NEB #E7103	DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
NovaSeq Control Software (NVCS)	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
Novaseq6000 platform	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
QuiBit	Thermoscientific, Waltham, MA, USA		DNA quantification
Quickdrop spectrophotometer	Molecular device, San Jose, CA, USA		DNA quantification
Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	342483	DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation