اعتبارات عملية لتصميم وتنفيذ وتفسير الدراسات التي تتضمن اختبارات ثني العظام بالكامل لعظام القوارض

Summary

يعد الاختبار الميكانيكي لعظام القوارض طريقة قيمة لاستخراج المعلومات المتعلقة بقابلية العظام للكسر. وبسبب الافتقار إلى الفهم العملي الصحيح، قد يتم المبالغة في تفسير النتائج أو عدم صحتها. سيكون هذا البروتوكول بمثابة دليل لضمان إجراء الاختبارات الميكانيكية بدقة لتوفير بيانات صالحة ووظيفية.

Abstract

هشاشة الهيكل العظمي التي تؤدي إلى الكسر هي أزمة صحية عامة أمريكية تؤدي إلى 1.5 مليون كسور كل عام و 18 مليار دولار في تكاليف الرعاية المباشرة. القدرة على فهم الآليات الكامنة وراء أمراض العظام والاستجابة للعلاج ليست مرغوبة فحسب ، بل حاسمة. يعمل الاختبار الميكانيكي للعظام كتقنية قيمة لفهم وقياس قابلية العظام للكسر. في حين أن هذه الطريقة تبدو سهلة التنفيذ ، فقد يتم التوصل إلى استنتاجات غير مناسبة وغير دقيقة إذا تجاهل المستخدم الافتراضات الحاكمة والخطوات الرئيسية. وقد لوحظ هذا عبر التخصصات مع استمرار نشر الدراسات مع إساءة استخدام الأساليب والتفسير غير الصحيح للنتائج. سيكون هذا البروتوكول بمثابة تمهيد للمبادئ المرتبطة بالاختبار الميكانيكي جنبا إلى جنب مع تطبيق هذه التقنيات - من اعتبارات حجم العينة من خلال حصاد الأنسجة وتخزينها ، إلى تحليل البيانات وتفسيرها. مع وجود هذا في متناول اليد ، يمكن الحصول على معلومات قيمة بشأن قابلية العظام للكسر ، مما يعزز الفهم لكل من البحث الأكاديمي والحلول السريرية.

Introduction

الاختبار الميكانيكي للعظام هو الطريقة الأساسية لاستخراج المعلومات الوظيفية المتعلقة بقابلية العظام للكسر. في الدراسات قبل السريرية ، يمكن استخدام العديد من طرق الاختبار ولكن الأكثر شيوعا هو ثني العظام الطويلة. هذه الاختبارات سهلة التنفيذ ويمكن استخدامها على عظام تتراوح أحجامها من الإنسان إلى الفأر. نظرا لأن الفئران هي واحدة من أكثر التي تمت دراستها شيوعا في الأبحاث قبل السريرية ، سيركز هذا البروتوكول على اختبارات الانحناء التي يتم إجراؤها على عظم الفخذ والساق للفئران.

قبل إجراء اختبارات الانحناء ، يجب حصاد العظام وتخزينها بشكل صحيح. كانت طرق التخزين الأكثر شيوعا تقليديا هي تجميد العظام في الشاش المنقوع بالمحلول الملحي ، أو التجميد في محلول ملحي وحده ، أو تجفيف العظام في الإيثانول ¹. تبين أن العظام المخزنة في الإيثانول قد زادت من الصلابة ومعامل المرونة وانخفضت معلمات التشوه مقابل تلك المخزنة المجمدة¹. حتى إعادة ترطيب العظام قبل الاختبار لا يعيد هذه الخصائص إلى المستويات الطبيعية ¹. يمكن أن يتسبب التخزين المغمور في محلول ملحي في تلف العظام حيث يتم ممارسة الضغط مع تمدد المحلول الملحي. بالإضافة إلى ذلك ، ستكون هناك حاجة إلى ذوبان كامل للمحلول لإزالة العظام لمسح التصوير المقطعي الدقيق (μCT). وبالتالي ، أصبح تجميد العظام التي تم حصادها حديثا في شاش منقوع بالمحلول الملحي طريقة التخزين القياسية ويوصى به في جميع أنحاء هذا البروتوكول.

نظرا لأن حجم وشكل العظم يؤثران على قوته السائبة والعديد من نماذج الأمراض تغير بشكل كبير حجم العظام ومورفولوجيتها ، يتم استخدام المبادئ الهندسية لتطبيع آثار الحجم لإنتاج خصائص تقدر سلوك الأنسجة². يتطلب هذا النهج هندسة مقطعية لموقع الفشل ، والتي يتم الحصول عليها بشكل شائع باستخدام μCT لإنشاء مسح للعظام قبل الاختبار. يستخدم μCT على نطاق واسع بسبب توفره ودقة الصورة العالية. علاوة على ذلك ، لا يتم تضمين مساهمات الأنسجة الرخوة ، ولا يتطلب المسح تثبيتا كيميائيا أو تعديلات أخرى على العظام ^3,4. في جميع أشكال التصوير المقطعي المحوسب ، يركز مصدر الأشعة السينية على جسم ما بينما يقيس الكاشف الموجود على الجانب الآخر من الجسم طاقة الأشعة السينية الناتجة. ينتج عن ذلك ظل أشعة سينية للعينة يمكن تحويله إلى صورة ^3,5. يتم تدوير الكائن الذي يتم مسحه ضوئيا (أو يتم تدوير مصدر الأشعة السينية والكاشف حول العينة) ، مما يولد صورا يمكن إعادة بنائها في مجموعة بيانات ثلاثية الأبعاد تمثل الكائن⁵.

يتم التحكم في دقة المسح الضوئي ، أو مدى قرب كائنين من بعضهما البعض ولا يزال يتم حلهما بشكل فردي ، عن طريق تغيير حجم voxel الاسمي أو حجم البكسل في الصورة الناتجة. من المقبول عموما أن الكائنات يجب أن تكون على الأقل ضعف حجم فوكسل واحد ليتم تحديدها³ ، ولكن النسبة الأعلى ستسمح بتحسين الدقة. علاوة على ذلك ، تكون الفوكسل الأكبر حجما أكثر عرضة لتأثيرات الحجم الجزئي: عندما يحتوي فوكسل واحد على أنسجة ذات كثافات متفاوتة ، يتم تعيين متوسط هذه الكثافات ، بدلا من الكثافة المحددة لنسيج واحد ، مما قد يؤدي إلى الإفراط أو التقليل من تقدير مناطق الأنسجة والكثافة المعدنية³. بينما يمكن التخفيف من هذه المشكلات عن طريق اختيار أحجام فوكسل أصغر ، فإن استخدام دقة أعلى لا يضمن التخلص من تأثيرات الحجم الجزئي وقد يتطلب أوقات مسح أطول³. عند مسح العظام خارج الجسم الحي ، يوصى عموما بحجم فوكسل من 6-10 ميكرومتر لتقييم البنية التربيقية لعظام الفأر بدقة. يمكن استخدام حجم فوكسل أكبر من 10-17 ميكرومتر للعظام القشرية ، على الرغم من أنه يجب استخدام أصغر حجم فوكسل معقول. يستخدم هذا البروتوكول حجم فوكسل 10 ميكرومتر ، وهو صغير بما يكفي للتمييز بين الخصائص التربيقية الرئيسية وتقليل تأثيرات الحجم الجزئي دون وقت مسح مكثف.

يجب أيضا اختيار إعدادات طاقة الأشعة السينية وفلتر الطاقة بعناية ، حيث أن الكثافة المعدنية العالية وسمك أنسجة العظام يخفف ويغير بشكل كبير طيف طاقة الأشعة السينية المرسلة. من المفترض عموما أنه نظرا لأن طيف الأشعة السينية المنبعث يعادل الطيف الذي يخرج من الجسم⁶ ، فإن استخدام الأشعة السينية منخفضة الطاقة على الأجسام الكثيفة مثل العظام يمكن أن يؤدي إلى قطعة أثرية تعرف باسم تصلب الحزمة⁷. يوصى بجهد أعلى من 50-70 كيلو فولت عند مسح عينات العظام لتقليل حدوث هذه القطع الأثرية⁵. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي إدخال مرشح طاقة من الألومنيوم أو النحاس إلى إنشاء شعاع طاقة أكثر تركيزا ، مما يقلل من القطع الأثرية ^4,7. سيتم استخدام مرشح ألومنيوم 0.5 مم في جميع أنحاء هذا البروتوكول.

وأخيرا، تتحكم خطوة دوران المسح الضوئي وطول الدوران (على سبيل المثال، 180°-360°) معا في عدد الصور الملتقطة، والتي تحدد مقدار الضوضاء في المسح النهائي⁴. يمكن أن يؤدي حساب متوسط الإطارات المتعددة في كل خطوة إلى تقليل الضوضاء ولكنه قد يزيد من وقت المسح^{الضوئي 4}. يستخدم هذا البروتوكول خطوة دوران تبلغ 0.7 درجة ومتوسط إطار يبلغ 2.

ملاحظة أخيرة حول المسح: يجب مسح أشباح معايرة هيدروكسيباتيت باستخدام نفس إعدادات المسح مثل العظام التجريبية لتمكين تحويل معاملات التوهين إلى كثافة معدنية في جم / سم³⁵. يستخدم هذا البروتوكول أشباح 0.25 جم / سم 3 و 0.75 جم / سم³ من هيدروكسيباتيت ، على الرغم من توفر أشباح مختلفة. لاحظ أن بعض أنظمة المسح الضوئي تستخدم الأشباح الداخلية كجزء من معايرة النظام اليومية.

بمجرد اكتمال المسح ، يتم إعادة بناء الإسقاطات الزاوية في صور مقطعية للكائن ، عادة باستخدام البرنامج المصاحب للشركة المصنعة. أيا كان النظام المستخدم ، من المهم التأكد من التقاط العظم بالكامل في إعادة البناء وأن يتم تعيين العتبة بشكل مناسب للسماح بالتعرف على العظام مقابل غير العظام. بعد إعادة الإعمار ، من الأهمية بمكان تدوير جميع عمليات المسح في ثلاثة أبعاد بحيث يتم توجيه العظام بشكل متسق ومحاذاة بشكل صحيح مع المحور العرضي ، مرة أخرى باستخدام برنامج الشركة المصنعة.

بعد الدوران ، يمكن اختيار مناطق الاهتمام (ROI) للتحليل بناء على ما إذا كانت الخصائص القشرية أو الخصائص التربيقية أو هندسة الكسر للتطبيع الميكانيكي مطلوبة. بالنسبة للأخير ، يجب اختيار عائد الاستثمار بعد الاختبار عن طريق قياس المسافة من موقع الكسر إلى أحد طرفي العظم واستخدام حجم الفوكسل لتحديد موقع الشريحة المقابل في ملف الفحص. يجب ألا يقل طول المنطقة المحددة عن 100 ميكرومتر ، مع نقطة الكسر في المركز التقريبي لعائد الاستثمار ، لتوفير تقدير مناسب⁴.

مع تحديد عائد الاستثمار ، هناك حاجة إلى خاصيتين للتطبيع الميكانيكي (لحساب إجهاد الانحناء والإجهاد): أقصى مسافة من محور الانحناء المحايد إلى السطح حيث يبدأ الفشل (يفترض أنه السطح المحمل بالتوتر ، والذي يحدده إعداد الاختبار) ، ولحظة منطقة القصور الذاتي حول المحور المحايد ، (تعتمد أيضا على إعداد الاختبار). يوصي هذا البروتوكول باستخدام رمز مخصص لتحديد هذه القيم. للوصول إلى الكود ، اتصل بالمؤلف المقابل مباشرة أو قم بزيارة موقع المختبر على https://bbml.et.iupui.edu/ لمزيد من المعلومات.

بمجرد اكتمال مسح μCT ، يمكن أن يبدأ الاختبار الميكانيكي. يمكن إجراء اختبارات الانحناء في تكوينات من أربع نقاط أو ثلاث نقاط. يفضل إجراء اختبارات الانحناء رباعي النقاط لأنها تقضي على إجهاد القص في العظم بين نقاط التحميل ، مما يسمح بحدوث انحناء نقي في هذه المنطقة³. سوف ينكسر العظم بعد ذلك بسبب التوتر ، مما يؤدي إلى فشل أكثر تمثيلا لخصائص الانحناء الحقيقية للعظم³. ومع ذلك ، يجب تحميل العظم بطريقة توفر نفس الحمل في كلتا نقطتي التحميل (يمكن تسهيل ذلك باستخدام رأس تحميل محوري). في اختبارات الانحناء ثلاثية النقاط ، هناك تغيير كبير في إجهاد القص حيث تلتقي نقطة الحمل بالعظم ، مما يتسبب في كسر العظم عند هذه النقطة بسبب القص وليس التوتر³. توصي معايير ASTM بأن المواد التي تخضع للانحناء يجب أن يكون لها نسبة طول إلى عرض تبلغ 16: 1 ، مما يعني أن طول امتداد الدعم يجب أن يكون أكبر 16 مرة من عرض العظم لتقليل تأثيرات القص ^8,9. غالبا ما يكون من المستحيل تحقيق ذلك عند اختبار عظام القوارض الصغيرة ، لذلك يتم ببساطة جعل فترة التحميل كبيرة قدر الإمكان ولكن مع تغيير صغير في شكل المقطع العرضي قدر الإمكان. علاوة على ذلك ، عند إجراء الانحناء من أربع نقاط ، يجب أن تكون النسبة بين أطوال الامتداد السفلي والعلوي ~ 3: 1⁸ ، والتي يمكن تحقيقها عادة في الساق ، ولكنها صعبة في عظم الفخذ الأقصر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الجدران القشرية الرقيقة لعظم الفخذ تجعلها عرضة للتشوه من النوع الحلقي الذي يغير شكل المقطع العرضي للعظام أثناء الاختبار (يمكن إبراز ذلك في الاختبارات المكونة من أربع نقاط حيث يلزم وجود قوة أكبر للحث على نفس لحظة الانحناء مقارنة بالانحناء ثلاثي النقاط). لذلك ، سيتم استخدام الانحناء ثلاثي النقاط لعظم الفخذ للفأر بينما سيتم استخدام الانحناء رباعي النقاط للساق في جميع أنحاء هذا البروتوكول.

أخيرا ، من المهم تشغيل الدراسة بشكل صحيح للتحليل الإحصائي. التوصية العامة للاختبار الميكانيكي هي أن يكون حجم العينة من 10-12 عظمة لكل مجموعة تجريبية لتكون قادرة على اكتشاف الاختلافات ، حيث أن بعض الخواص الميكانيكية ، وخاصة معلمات ما بعد العائد ، يمكن أن تكون متغيرة للغاية. في بعض الحالات ، قد يعني هذا البدء بحجم عينة حيوانية أكبر نظرا للاستنزاف الذي يمكن أن يحدث أثناء الدراسة. يجب إكمال تحليل حجم العينة باستخدام البيانات الموجودة قبل محاولة الدراسة.

هناك العديد من القيود والافتراضات ، لكن اختبارات الانحناء يمكن أن توفر نتائج دقيقة تماما ، خاصة عندما تكون الاختلافات النسبية بين المجموعات ذات أهمية. هذه الخصائص ، جنبا إلى جنب مع تحليل العمارة التربيقية والتشكل القشري ، يمكن أن توفر رؤية أفضل لحالات المرض وأنظمة العلاج. إذا تم الاهتمام بجوانب التجربة التي هي تحت سيطرتنا (على سبيل المثال ، الحصاد والتخزين والمسح والاختبار) ، يمكننا أن نشعر بالثقة في أنه تم إنشاء نتائج دقيقة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول والتي تنطوي على من قبل اللجنة المؤسسية للحيوانات والاستخدام التابعة لكلية العلوم بجامعة إنديانا (IACUC) قبل الإجراء. تم القتل الرحيم للحيوانات الموصوفة في الإجراء عن طريق استنشاق CO₂متبوعا بخلع عنق الرحم كوسيلة ثانوية للقتل الرحيم.

1. حصاد وتخزين وذوبان العظام

1. الحصاد والتخزين
   1. ضع الجانب البطني للفأر لأعلى. استخدم مشرطا (أو شفرة حلاقة أو مقص) لعمل شق عند التقاطع التقريبي لعظم الفخذ والحوض على جانب واحد.
   2. استمر في الشق الأولي ظهريا حتى يتم تحديد موقع مفصل الورك ؛ ابحث عن رأس الفخذ الذي يظهر ككرة بيضاء صغيرة متصلة بالحوض.
   3. اضغط بحافة المشرط على الحافة القريبة من رأس عظم الفخذ حتى يخرج رأس عظم الفخذ من التجويف. استئصال أنسجة إضافية لتحرير الطرف الخلفي من ما تبقى من الذبيحة.
   4. مع عزل الطرف الخلفي ، افصل الساق وعظم الفخذ عن طريق تحفيز الانثناء عند مفصل الركبة. حرك المشرط في الاتجاه الإنسي الجانبي عند السطح الأمامي للركبة لقطع أي نسيج مجاور ، بما في ذلك الأربطة بين العظام.
   5. إذا لم يفصل هذا العظام ، فقم بتمديد مفصل الركبة للسماح بالوصول إلى السطح الخلفي. احرص على تجنب قطع العظم أو كشط الغضروف المفصلي.
   6. بمجرد فصل عظم الفخذ والساق ، قم بإزالة القدم الخلفية من الساق عن طريق ثني المفصل واستخدام حركة النشر الإنسي الجانبي على السطح الخلفي للمفصل. إذا لزم الأمر ، قم بتمديد المفصل لكشف السطح الأمامي. كن حذرا لتجنب قطع العظام.
   7. بمجرد عزلها ، قم بتنظيف عظام جميع الأنسجة الرخوة الملتصقة. في حالة إجراء اختبارات الانحناء من أربع نقاط على الساق ، قم بإزالة الشظية أيضا. ترتبط الشظية بأربطة في الطرف القريب ولكنها تندمج مع الساق بالقرب من النهاية البعيدة للعظم. استخدم مقصا حادا بالقرب من نقطة الاتصال لفصل الشظية.
   8. لف العظام المعزولة والنظيفة بشكل منفصل في شاش مبلل بالمحلول الملحي وقم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية. افعل ذلك مباشرة بعد الحصاد.
   9. كرر الخطوات من 1.1.1 إلى 1.1.8 للجانب الآخر من الذبيحة.
      ملاحظة: إذا كانت هناك مقاومة عند محاولة فصل العظام في الخطوات 1.1.4-1.1.6 ، فمن الأفضل تكرار الخطوات بدلا من محاولة فصل العظام. قد تؤدي الحركات القوية إلى تلف العظام أو كسرها.
2. ذوبان الجليد
   ملاحظة: يجب تقليل عدد دورات التجميد والذوبان التي يخضع لها العظم لأن دورات التجميد والذوبان المفرطة يمكن أن تؤثر بشكل ضار على الخواص الميكانيكية للعظام. يمكن تحقيق ذوبان جزئي لمسح μCT عن طريق ترك العظم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق. قم فقط بإذابة العظم تماما عند إجراء اختبارات الانحناء كما هو موضح أدناه.
   1. ذوبان الجليد بين عشية وضحاها المفضل
      1. انقل العظام من -20 درجة مئوية إلى 1-4 درجة مئوية في غرفة باردة أو ثلاجة. تأكد من بقاء العظام هناك لمدة 8-12 ساعة لتذوب تماما قبل الاختبار.
   2. ذوبان سريع
      1. اضبط درجة حرارة الحمام على حوالي 37 درجة مئوية. مرة واحدة في درجة الحرارة هذه ، إضافة العظام إلى الحمام.
      2. اترك العظام في الحمام لمدة 1 ساعة تقريبا.

2. المسح الضوئي μCT

1. لف العظام في بارافيلم قبل المسح للحفاظ على الترطيب. احتفظ بجميع العظام الأخرى على الجليد أثناء انتظار المسح.
2. بمجرد لفه في parafilm ، ضع العظم في حامل للتفاعل مع الماسح الضوئي. تأكد من محاذاة جميع العظام الممسوحة ضوئيا في نفس الاتجاه لأن المحاذاة المتسقة ستبسط الدوران لاحقا في التحليل.
3. اضبط إعدادات المسح الضوئي وفقا لتطبيق الفحص. يوصى بإعدادات المسح العامة التالية لعظام الماوس: الدقة / حجم فوكسل: 10 ميكرومتر ؛ حجم البكسل: متوسط ، 2000 × 1048 ؛ الفلتر: 0.5 مم ألومنيوم. خطوة الدوران: 0.7 ؛ متوسط الإطار: 2.
   ملاحظة: قد تختلف هذه الإعدادات وفقا للنظام المستخدم للمسح الضوئي، ويجب الرجوع إلى دليل الشركة المصنعة ودليل المستخدم حسب الحاجة.
4. بمجرد تشغيل مصدر الأشعة السينية ، قم بإجراء تصحيح مجال مسطح لتقليل القطع الأثرية. للقيام بذلك ، أولا ، تأكد من أن الغرفة فارغة وأوقف تشغيل الحقل المسطح.
5. قم بقياس متوسط كثافة الحقل واضبطه على 60٪. مرة واحدة عند 60٪ ، قم بتحديث الحقل المسطح وإعادة تشغيله.
6. تأكد من أن متوسط الشدة الآن (86-88٪).
   ملاحظة: قد تختلف هذه العملية حسب نظام μCT المستخدم. راجع دليل المستخدم قبل محاولة العملية.
7. بمجرد إجراء تصحيح المجال المسطح بنجاح ، ضع الحامل في الغرفة. تأكد من توسيط العينات وتسويتها قبل وضع قاعدة التمثال في الحجرة.
8. بمجرد تثبيت قاعدة التمثال ، أغلق الحجرة ، وتأكد من التقاط العظم بالكامل في الفحص (قد يكون من الضروري عرض الكشافة) ، وابدأ الفحص.
9. بعد المسح ، أعد تخزين العظام في شاش مبلل بالمحلول الملحي عند -20 درجة مئوية.

3. إعادة بناء μCT

1. حدد عائد استثمار يلتقط العظم بالكامل في إعادة الإعمار. للقيام بذلك ، اعرض أكبر مقطع عرضي للعظم وحجم عائد الاستثمار بناء على هذا المقطع العرضي.
2. اضبط عتبة البرنامج للسماح بالتعرف المناسب على العظام مقارنة بالعظام غير العظمية. للقيام بذلك ، استخدم مدرجا تكراريا يتم فيه تعيين قيد أقل عند 0 ويتم تعيين القيد العلوي في نهاية بيانات الرسم البياني للذروة.
3. اضبط الإعدادات الإضافية ، بما في ذلك تقليل القطع الأثرية الحلقية وتصلب الحزمة إلى 5 و 20٪ على التوالي. تأكد من أن تعويض الاختلال يقع في نطاق -7 إلى 7. قد تختلف هذه القيم وفقا للبرنامج. تأكد من التحقق منها باستخدام دليل المستخدم والتعليمات المستندة إلى الشركة المصنعة قبل البدء في إعادة الإعمار.
   ملاحظة: يمكن تقليل القطع الأثرية أثناء إعادة البناء باستخدام تصحيحات لتصلب الحزمة والتحف الحلقية وتعويض عدم المحاذاة. قد يعمل تعويض المحاذاة الخاطئة كمؤشر على جودة الفحص وإذا كان خارج النطاق المحدد من قبل الشركة المصنعة ، فيجب تكرار الفحص. ومع ذلك ، ستعتمد إعدادات إعادة البناء على البرامج ، ويجب الرجوع إلى دليل المستخدم.

4. دوران μCT

ملاحظة: بمجرد إعادة بنائها ، يجب تدوير عمليات المسح لتحديد اتجاه ثابت عبر جميع العظام ، ولضمان أخذ المقاطع المستعرضة للعظم الناتج بشكل طبيعي إلى المحور الطولي بأقل زاوية إزاحة ممكنة. يجب أن يتم ذلك باستخدام البرنامج الذي يختاره المستخدم.

1. دوران عظم الفخذ
   1. قم بتدوير عظم الفخذ بحيث يكون لجميع العظام نفس الاتجاه الطولي. على سبيل المثال ، قم بتوجيه جميع العظام بالطرف القريب من العظم في الجزء العلوي من الفحص.
   2. قم بتدوير العظم بحيث يكون اتجاه المقطع العرضي لجميع العظام هو نفسه. على سبيل المثال ، قم بتدوير العظام بحيث يكون الجانب الأمامي دائما على الجانب الأيمن من عمليات الفحص.
   3. بمجرد إجراء هذه التعديلات ، قم بتصويب الفحص لضمان الحفاظ على التماثل حول المحور المركزي.
   4. احفظ مجموعة البيانات التي تم تدويرها.
2. دوران الساق
   1. كرر الخطوات 4.1.1-4.1.4 للظنبوب.

5. إجراء الاختبار الميكانيكي

1. اعداد
   1. قبل الاختبار الميكانيكي ، تأكد من الحصول على مسح μCT بدقة 6-10 ميكرومتر وإعادة بنائه للتحقق من الحصول على مسح عالي الجودة لكل عينة لحساب هندسة المقطع العرضي في موقع الكسر (الأقسام 2-3).
   2. مع الحصول على الفحوصات والتحقق منها ، قم بإذابة جميع العظام قبل الاختبار (القسم 1). اختبر جميع العظام من تجربة واحدة في نفس اليوم وقم بترتيب الاختبار عشوائيا لتقليل تحيز المستخدم وتنوع النظام عبر العينات والمجموعات التجريبية. تأكد من بقاء العظام رطبة طوال عملية الاختبار.
2. إعداد الجهاز
   1. حدد موقع خلية تحميل ذات حساسية وسعة مناسبة للعينة. ضع في اعتبارك نطاق الفشل المتوقع للعينة واختر خلية تحميل بسعة أكبر بنسبة 50٪ تقريبا مع زيادة الحساسية إلى أقصى حد (على سبيل المثال ، خلية تحميل 10 رطل بسعة 45 نيوتن لعظم فأر في نطاق الفشل 0-25 نيوتن).
   2. حدد موقع تركيبات امتداد التحميل والدعم.
   3. قم بتثبيت خلية التحميل والتركيبات كما هو موضح في الشكل 1 ، عن طريق شد خلية التحميل إما على الدعم العلوي أو السفلي لجهاز الاختبار ، وتركيبات التحميل العلوية على خلية التحميل ، والتركيبات السفلية على الدعم السفلي للمختبر. تأكد من ملاءمة آمنة.
      ملاحظة: يوصى عموما بربط خلية التحميل بالتركيبات العلوية عند إجراء اختبارات الانحناء لتجنب ملامسة السائل لخلية التحميل ولكن يمكن استخدام الجزء السفلي إذا لزم الأمر.
   4. بمجرد تثبيت خلية التحميل والتركيبات ، حدد طول امتداد الدعم وتأكد من بقائه ثابتا لجميع العينات التي يتم اختبارها. لاختيار مسافة امتداد الدعم ، أولا ، حدد موقع أقصر عظمة في مجموعة العينات.
   5. وجه العظم بين التركيبات كما هو موضح في الشكل 2.
   6. لثني عظم الفخذ بثلاث نقاط ، اتبع الشكل 2 أ. تأكد من أن السطح الأمامي للعظم مقابل امتداد الدعم وأن منطقة الامتداد داخل الحجاب الحاجز للعينة. تجنب تضمين المدور الثالث في الطرف القريب ونقطة الانتقال حيث يتسع العظم إلى الميتافيزيس واللقمات في الطرف البعيد.
   7. بالنسبة للانحناء رباعي النقاط ، تأكد من محاذاة امتدادات الدعم والتحميل وتوسيطها مع بعضها البعض. اتبع الشكل 2B لتحميل العظم في التركيبات.
      1. اضبط أطوال امتدادات الدعم والتحميل لتتبع نسبة 3: 1⁸ (على سبيل المثال ، امتداد دعم 9 مم وامتداد تحميل 3 مم).
      2. بالنسبة للساق ، قم بتحميل السطح الإنسي للعظم مقابل امتداد الدعم بدعامة واحدة عند تقاطع الظنبوب / الشظية. من المحتمل أن يتم وضع الدعم الآخر بعد قمة الظنبوب مباشرة. تأكد من أن فترة التحميل ، متمركزة داخل فترة الدعم ، ثم تحتوي على منطقة موحدة من العظم.
   8. قم بقياس مسافة امتداد الدعم في حالة إجراء الانحناء ثلاثي النقاط ومسافات امتداد التحميل والدعم في حالة إجراء الانحناء المكون من 4 نقاط وتسجيل هذه المسافات. تأكد من تسجيل هذه القيمة من مركز نقاط التحميل لكل من قياسات امتداد التحميل والدعم.
   9. ضع العظم مرة أخرى في محلول ملحي أو أعد ترطيبه ببلعة من محلول ملحي.
      ملاحظة: عند اختيار نقاط لمدى التحميل ، يوصى باستخدام نقاط دائرية (نصف قطر 0.75 مم كاف لأنه يوزع الحمل أثناء ملامسة العظم أيضا عند ظل الدائرة). بينما توصي النظرية بحافة السكين لتمثيل الحمل النقطي ، فإن هذا سيسحق العظم عند نقطة تطبيق الحمل ، مما يؤدي إلى المبالغة في تقدير الإجهاد والتقليل من تقدير المعامل.
   10. تأكد من أن جميع أجزاء التركيبات محكمة وخالية من الحركة.
3. إعداد البرنامج
   1. تأكد من توصيل جهاز الاختبار بشكل صحيح بالكمبيوتر عبر صندوق الوحدة النمطية وقنوات خلية التحميل وأي متطلبات أخرى وفقا لدليل النظام.
   2. في البرنامج المرتبط بجهاز الاختبار الميكانيكي ، قم بإنشاء ملف تعريف اختبار الانحناء باستخدام منحدر به معدل إزاحة بطيء بما يكفي لعدم إحداث تأثيرات لزجة مرنة (غالبا ما يتم استخدام 0.025 مم / ثانية ) لتحميل العظم إلى الفشل.
   3. يوصى أيضا بتردد عينة لا يقل عن 25 هرتز عند إنشاء ملف تعريف اختبار ، على الرغم من تفضيل معدل أخذ عينات أعلى.
   4. أنشئ مجلدا واحدا لكل مجموعة دراسات واحفظ كل اختبار كملف فردي داخل هذا المجلد.
4. تحميل واختبار العينات
   1. حدد عظما مذابا بشكل صحيح (انظر الخطوة 1.2). قياس وتسجيل طوله الكامل مع الفرجار.
   2. قم بتحميل العينة على التركيبات كما هو موضح في الشكل 2 أ في حالة اختبار عظم الفخذ في الانحناء ثلاثي النقاط والشكل 2 ب في حالة اختبار الساق في الانحناء المكون من أربع نقاط.
   3. قم بتغيير اسم الملف ليعكس العينة التي يتم اختبارها.
   4. صفر الحمل (وليس الإزاحة). قم بتشغيل محرك النظام ؛ تأكد من أنه ليس في التحكم في الحمل أو الإزاحة.
   5. بحذر ، ضع الحد الأدنى من التحميل المسبق على العظم لتأمين موضعه والمساعدة في منع العظم من التدحرج ولكن تأكد من أنه لا يضر بالعينة. استهدف تحميلا مسبقا يبلغ حوالي 0.25 نيوتن. تأكد من الحفاظ على اتجاه العظام المطلوب قبل المتابعة.
   6. رطب العينة عن طريق غمرها بسخاء بالمحلول الملحي.
   7. ابدأ اختبار الانحناء عن طريق تحديد ابدأ أو تشغيل في البرنامج. حرج: راقب العينة بعناية لكامل الاختبار ولاحظ الاختبارات التي حدثت فيها أي مشكلات (على سبيل المثال ، التدحرج ، الانزلاق).
      ملاحظة: قد تؤدي هذه المشكلات إلى تعريض البيانات للخطر وستكون الملاحظات حول هذه الاختبارات مفيدة للتشاور أثناء التحليل.
   8. راقب أن يبدأ العظم في الكسر (على جانب الشد). ستستمر معظم الاختبارات حتى يحدث الفشل. في هذه المرحلة ، سينتهي الاختبار عبر حدوده المبرمجة. في حالة حدوث فشل ولكن استمر المختبر في الإزاحة ، أوقف الاختبار يدويا لمنع تلف خلية التحميل.
   9. بمجرد اكتمال الاختبار ، قم بقياس الطول من الطرف البعيد إلى نقطة الكسر باستخدام الفرجار وتسجيله.
   10. كرر الخطوات من 5.4.1 إلى 5.4.9 لكل عينة.

الشكل 1: إعداد جهاز الاختبار الميكانيكي. (أ) اختبارات الانحناء من ثلاث نقاط و(ب) اختبارات الانحناء من أربع نقاط. تظهر خلية التحميل باللون الأصفر ، وتظهر تركيبات التحميل باللون الأزرق ، وتظهر تركيبات الدعم باللون الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: اتجاه العظام بين التركيبات . (أ) التوجيه الصحيح لعظم الفخذ في تركيبات تحميل منحنية ثلاثية النقاط تظهر (من أعلى إلى أسفل) مناظر من الجانب الإنسي والأمامي والخلفي لعظم الفخذ عند وضعها بشكل صحيح. يتم عرض تركيبات التحميل باللون البرتقالي وتظهر تركيبات الدعم باللون الأزرق. يجب ضبط الامتدادات السفلية لتشمل أكبر قدر ممكن من الجزء المستقيم من الحجاب الحاجز ، ويجب توسيط التركيبات العلوية بين تلك الامتدادات. (ب) التوجيه الصحيح للساق للانحناء المكون من أربع نقاط يظهر (من أعلى إلى أسفل) مناظر من الجوانب الأمامية والجانبية والإنسية للساق. يجب تحميل العظم بحيث يتصل السطح الإنسي بالتركيبات السفلية ، ويتصل السطح الجانبي بالتركيب العلوي. يجب وضع تقاطع الظنبوب والشظية خارج فترة التحميل مباشرة. يجب ضبط الامتدادات لتلبية نسبة فترة التحميل إلى الدعم بنسبة 1: 3 على أفضل وجه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. اختيار عائد الاستثمار

1. مع تسجيل أطوال الاستراحة ، قم بتحميل الصور التي تم تدويرها في البرنامج الذي يختاره المستخدم. بمجرد تحميل الصور التي تم تدويرها ، حدد موقع الشرائح العلوية والسفلية من العظم وسجلها.
2. احسب الفرق بين الشرائح العلوية والسفلية. اضرب هذه القيمة في حجم فوكسل المسح لتحديد الطول الكلي للعظم بالميكرومتر.
3. لتحديد موقع الكسر في التصوير المقطعي المحوسب ، قسم طول الكسر المسجل (بالميكرومتر) على حجم الفوكسل للحصول على عدد شرائح μCT من الطرف البعيد للفحص إلى نقطة الكسر.
4. حدد عائد استثمار ، متمركزا في هذا الموقع. أولا ، قم بتعيين إجمالي الطول المطلوب لعائد الاستثمار (100 ميكرومتر على الأقل). أوجد عدد الشرائح التي يمثلها هذا الطول بقسمة الطول بالميكرومتر على حجم الفوكسل لتحديد إجمالي عدد الشرائح في عائد الاستثمار.
5. للحصول على الحد الأدنى لعائد الاستثمار ، قسم العدد الإجمالي لشرائح عائد الاستثمار على 2 واطرح هذه القيمة من موقع الفاصل المحسوب مسبقا الموجود في الخطوة 6.4.
6. أضف الطول الإجمالي لعائد الاستثمار في الشرائح إلى القيمة المحسوبة مسبقا للحصول على الحد الأعلى لعائد الاستثمار.
7. حدد عائد الاستثمار المناسب، استنادا إلى الحدود المحسوبة، واحفظه.

7. تطبيع بيانات القوة والإزاحة

ملاحظة: سيقوم جهاز الاختبار الميكانيكي فقط بإنشاء نقاط بإحداثيات x و y (الإزاحة ، القوة). يمكن تحويل هذه النقاط إلى إجهاد وإجهاد باستخدام معادلات إجهاد وإجهاد الانحناء أويلر-برنولي ، ولكنها تتطلب خصائص هندسية تم الحصول عليها من عمليات المسح المقطعي المحوسب. يمكن إجراء القياس الكمي لهذه الخصائص باستخدام البرنامج المفضل للمستخدم. نحن نفضل رمزا مخصصا يمنح تحكما كاملا في جميع المدخلات والحسابات والمخرجات. كما ذكرنا سابقا ، للوصول إلى الكود ، اتصل بالمؤلف المقابل مباشرة أو قم بزيارة موقع المختبر على https://bbml.et.iupui.edu/ لمزيد من المعلومات. تتم مناقشة معادلات الإجهاد والإجهاد ، بالإضافة إلى الخصائص الهندسية الضرورية التي يجب الحصول عليها من عمليات المسح μCT ، لحساب هذه أدناه.

1. معادلات تطبيع الانحناء ثلاثية النقاط
   1. المعادلة المستخدمة لحساب الإجهاد في الانحناء ثلاثي النقاط موضحة أدناه في المعادلة 1. في هذه المعادلة ، يمثل "F" القوة ويمثل "L" طول فترة الدعم. يتم تسجيل قيم القوة بواسطة جهاز الاختبار الميكانيكي أثناء الاختبار. تأكد من تسجيل طول فترة الدعم قبل الاختبار. "c" و "I" هي خصائص هندسية سيتم حسابها باستخدام عمليات المسح بالأشعة المقطعية (القسم 7.3).
      (1)
   2. تظهر معادلة حساب الإجهاد أدناه في المعادلة 2 ؛ يمثل "c" و "L" نفس الخصائص لكل من حسابات الإجهاد والإجهاد. يشير الحرف "d" إلى قيم الإزاحة التي سجلها المختبر الميكانيكي أثناء الاختبارات.
      (2)
2. معادلات تطبيع الانحناء ذات النقاط الأربع
   1. معادلة الإجهاد في الانحناء المكون من أربع نقاط موضحة أدناه في المعادلة 3. ويظل "F" و"I" نفس المتغيرات التي نوقشت في الخطوة 1.1.7. احسب "أ" من قياسات الدعم وفترة التحميل قبل الاختبار. إذا اتبعت النسبة الموصى بها وهي 3: 1 للدعم إلى امتداد التحميل للانحناء المكون من أربع نقاط ، فسيكون "a" ثلث طول امتداد الدعم.
      (3)
   2. معادلة الإجهاد في الانحناء رباعي النقاط موضحة أدناه في المعادلة 4. يشير "C" و "A" إلى نفس الخصائص لكل من حسابات الإجهاد والإجهاد. يشير الحرف "d" إلى قيم الإزاحة التي سجلها جهاز الاختبار الميكانيكي أثناء الاختبارات.
      (4)
3. حساب الخصائص الهندسية من عمليات المسح الضوئي μCT
   1. يمثل المتغير "c" المسافة من المحور المحايد إلى سطح العظم الذي تم تحميله في التوتر. وبالتالي ، حدد النقطه الوسطى لكل مقطع عرضي في عمليات مسح μCT لأن المحور المحايد يمر عبر النقطه الوسطى.
      1. إذا اتبعت اتجاه اختبار عظم الفخذ في الانحناء ثلاثي النقاط الموصوف في الخطوة 5.2.6 ، فقم بقياس "c" فيما يتعلق بالسطح الأمامي.
      2. إذا اتبعت اتجاه اختبار الساق الموصوف في الخطوة 5.2.7 ، فقم بقياس "c" فيما يتعلق بالسطح الإنسي للعظام.
   2. يمثل المتغير "I" منطقة القصور الذاتي حول محور الانحناء (المحور الإنسي الجانبي لعظم الفخذ ؛ المحور الأمامي الخلفي للساق). احسب هذه القيمة باستخدام المعادلة 5. في هذه المعادلة ، "dA" هي مساحة كل بكسل تم التقاطها في مسح μCT بينما y هي المسافة المحسوبة لكل بكسل من المحور المحايد.
      (5)

8. خصائص الاختبار الميكانيكية ذات الأهمية

1. قبل حساب أي خواص ميكانيكية ، قم بإنشاء منحنى إزاحة القوة ومنحنى الإجهاد والإجهاد (المنحنيات المثالية الموضحة أدناه في الشكل 3 ، جنبا إلى جنب مع الخصائص المهمة).
   ملاحظة: لا يؤدي اختبار العينات البيولوجية دائما إلى إنشاء منحنيات تشبه هذه الأمثلة المثالية ، لكنها تظل دليلا مفيدا.
2. افحص هذه المنحنيات قبل التحليل لاكتشاف الأخطاء في الاختبار ، مثل تدحرج العظام أو الانزلاق. تتسبب هذه الأخطاء عادة في حدوث نتوءات أو مناطق مسطحة في الجزء الخطي الأولي من المنحنى. قم بإزالة البيانات الزائدة ، بما في ذلك أي بيانات قد تكون تم جمعها قبل اتصال المختبر بالعظم أو البيانات بعد الفشل ، في هذه المرحلة.
3. بمجرد التأكد من اختبار الجودة من خلال المنحنيات المرسومة ، ابدأ في تحليل الخصائص المهمة.
   1. صلابة ومعامل مرونة
      1. احسب الصلابة باستخدام المنطقة المرنة فقط من منحنى إزاحة القوة. ميل المنحنى في هذه المنطقة هو الصلابة.
      2. احسب معامل المرونة باستخدام ميل الجزء المرن فقط من منحنى الإجهاد والانفعال.
   2. نقطة العائد
      ملاحظة: هناك نقطتان للخضوع ، واحدة على منحنى إزاحة القوة والأخرى على منحنى إجهاد الإجهاد. تعرف القيم (x، y) لهذه النقطة من منحنى إزاحة القوة باسم الإزاحة إلى العائد وقوة الخضوع ، بينما تعرف القيم الموجودة في منحنى الإجهاد والانفعال باسم الإجهاد للخضوع وإجهاد الخضوع. تمثل هذه النقاط نهاية المنطقة المرنة من المنحنى ويمكن العثور عليها بالطرق المذكورة أدناه.
      1. طريقة منحنى الإجهاد والانفعال: احسب إزاحة خط من (0,0) بنسبة 0.2٪ إجهاد (2,000 سلالة مجهرية) ولكن بنفس ميل معامل المرونة. ارسم هذا الخط على الرسم البياني للإجهاد والإجهاد ؛ يتم تعريف الموضع الذي يعترض فيه هذا الخط منحنى الإجهاد والإجهاد على أنه نقطة الخضوع. استخدم إجهاد الخضوع وإحداثيات الإجهاد لإيجاد قيم القوة والإزاحة المماثلة ؛ ستمثل هاتان القيمتان قوة الخضوع والإزاحة إلى قيم الناتجة.
      2. طريقة القاطع: احسب الصلابة من منحنى إزاحة القوة وقلل الصلابة بنسبة مئوية مختارة (5-10٪). ارسم خطا يبدأ من (0,0) مع ميل هذه الصلابة المنخفضة واسمح له بالتقاطع مع منحنى إزاحة القوة. سيكون لنقطة التقاطع الإحداثيات (الإزاحة إلى العائد ، قوة الخضوع).
         ملاحظة: يمكن استخدام طريقة القاطع لإيجاد نقطة الخضوع بدون بيانات إجهاد الإجهاد.
   3. القوة المطلقة والإجهاد المطلق
      1. احسب القوة القصوى والضغط النهائي من خلال إيجاد القيمة القصوى في مجموعات البيانات المعنية.
   4. خصائص النزوح والإجهاد
      1. الإزاحة إلى الناتج والانفعال إلى قيم العائد التي تمثل الإزاحة أو الانفعال إلى نقطة الخضوع. للعثور عليها ، حدد موقع العائد كما هو موضح في الخطوة 8.3.2.
      2. تمثل قيم الإزاحة الكلية والإجهاد الكلي الإزاحة الكلية أو الإجهاد الكلي للعينة التي مرت بها خلال الاختبار وتتوافق مع نقطة الفشل.
      3. إزاحة ما بعد العائد وإجهاد ما بعد العائد: يتم الإبلاغ عن إزاحة ما بعد العائد بشكل شائع ويمكن حسابها عن طريق طرح الإزاحة للناتج من الإزاحة الكلية. احسب سلالة ما بعد المحصول عن طريق طرح السلالة للإنتاج من الإجهاد الكلي ولكن أبلغ عن ذلك بحذر ، حيث يتم اشتقاق الإجهاد أولا بافتراض أن المادة مرنة خطيا (preyield). هذا يجعل مقياس ما بعد العائد عرضة للبطلان.
   5. خصائص الطاقة
      1. احسب الطاقة باعتبارها المساحة الواقعة تحت إزاحة القوة أو منحنى الإجهاد والانفعال.
      2. تعرف المساحة الواقعة أسفل منحنى إزاحة القوة بالشغل. تعرف المساحة المحسوبة تحت جزء ما قبل العائد من المنحنى ، أو المنطقة المرنة ، باسم العمل المرن أو الطاقة. تعرف المنطقة المحسوبة تحت المنحنى بعد نقطة العائد ، أو المنطقة البلاستيكية ، باسم ما بعد العائد أو العمل البلاستيكي ، أو الطاقة المفقودة.
      3. تعرف المساحة الإجمالية المحسوبة تحت منحنى الإجهاد والإجهاد بالصلابة أو معامل الصلابة بينما تعرف المساحة المحسوبة تحت منحنى الإجهاد والانفعال حتى نقطة الخضوع بالمرونة. غالبا ما لا يتم الإبلاغ عن صلابة ما بعد العائد ، مثل إجهاد ما بعد الخضوع ، بسبب افتراضات معادلات الإجهاد التي لا تندرج تحتها هذه الخاصية.

الشكل 3: منحنيات إزاحة القوة والإجهاد والانفعال. (أ) منحنى الإزاحة المثالي للقوة؛ (B) منحنى الإجهاد والانفعال المثالي مع الخط المشتق من طريقة الإزاحة 0.2٪ المستخدمة لحساب نقطة العائد الموضحة باللون الأحمر (لاحظ أن هذا الخط له نفس ميل المنطقة المرنة من المنحنى). تشمل الخصائص الرئيسية التي يمكن الحصول عليها من منحنى إزاحة القوة قوة الخضوع ، والقوة القصوى ، والإزاحة إلى الناتج ، والإزاحة الكلية ، والعمل. تشمل خصائص مستوى الأنسجة التي يمكن الحصول عليها من منحنى الإجهاد والإجهاد إجهاد الخضوع ، والإجهاد النهائي ، والإجهاد إلى المحصول ، والإجهاد الكلي ، والمرونة ، والمتانة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

عند الانتهاء من التصوير المقطعي المحوسب ، يمكن اكتشاف معظم عمليات المسح غير الكافية في إعادة الإعمار. في كثير من الأحيان ، سيكون لعمليات الفحص السيئة تعويض اختلال مرتفع وهو مؤشر واضح على وجود خطأ أثناء الفحص. ومع ذلك ، قد تحدث أخطاء في خطوات أخرى وقد تؤدي أيضا إلى بيانات غير دقيقة. غالبا ما ...

Discussion

خلال عملية المسح والاختبار ، هناك لحظات يكون فيها استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحسين مناسبين. يحدث أولها عند مسح العظام باستخدام μCT. في حين أن العديد من الأنظمة تأتي مع حامل يمكن فيه حمل كائن واحد ومسحه ضوئيا ، يمكن تصنيع حاملات مخصصة لمسح عظام متعددة في نفس الوقت. يمكن أن يكون مسح عظام متعد...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object