A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل وتحديد الخلايا المتخصصة في الحوفي البشري.

Abstract

نبلغ هنا عن إجراء قياسي لعزل وتحديد الخلايا المتخصصة القزحية (LNCs). تم استخدام أنسجة الليمبوس التي تم الحصول عليها من بنك العين لعزل LNCs. تم تقسيم الأنسجة إلى 12 قطعة تحت ظروف معقمة وهضمها لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا باستخدام كولاجيناز A للحصول على مجموعات الخلايا مع LNCs والخلايا السلفية الظهارية القزحية. تم هضم مجموعات الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام 0.25٪ trypsin-EDTA للحصول على خلايا مفردة ثم زرعها في وسط الخلايا الجذعية الجنينية المعدلة (MESCM) على سطح بلاستيكي مغطى ب 5٪ Matrigel. تم تمرير الخلايا عند التقاء 70٪ ، وتم تحديد LNCs باستخدام التألق المناعي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) ، وقياس التدفق الخلوي. تم عزل LNCs الأولية ومرورها أكثر من 12 مرة. كان نشاط انتشار LNCs من P4 إلى P6 هو الأعلى. عبرت LNCs عن علامات خلايا جذعية أعلى من BMMSCs (SCF و Nestin و Rex1 و SSEA4 و CD73 و CD90 و MSX1 و P75NTR و PDGFRβ). علاوة على ذلك ، أظهرت النتائج أن P4 LNCs عبرت بشكل موحد عن VIM و CD90 و CD105 و PDGFRβ ، ولكن ليس Pan-CK ، والتي يمكن استخدامها كعلامة لتحديد LNCs. أظهر تحليل التدفق الخلوي أن ما يقرب من 95٪ و 97٪ و 92٪ و 11٪ من LNCs عبرت عن CD73 و CD90 و CD105 و SCF على التوالي ، بينما كانت 68٪ و 99٪ و 20٪ و 3٪ في BMMSCs. ويمكن أن توفر العملية المعيارية لعزل البلدان غير الطبيعية وتحديد هويتها أساسا مختبريا موثوقا به للاستخدام الواسع النطاق للبلدان غير الطبيعية.

Introduction

أصبح حدوث نقص الخلايا الجذعية الظهارية القرنية (CESD) ، ويسمى أيضا نقص الخلايا الجذعية الطرفية (LSCD) 1 ، وتجديد ظهارة القرنية (CES) أكثر إلحاحا بسبب عدوى القرنية وإصابتها. إذا لم يتم علاجها بشكل صحيح ، يمكن أن يؤدي CESD إلى العمى الذي يتطلب زرع القرنية. نتيجة لذلك ، أصبح تجديد CES أكثر أهمية. هناك مجموعة من الخلايا الداعمة تسمى الخلايا المتخصصة القزحية (LNCs) التي توفر الدعم الأساسي لوظيفة CES. تم عزل الخلايا الجذعية اللحمية القزحية لأول مرة بواسطة Polisetty et al.2 وتم تحديدها بواسطة Xie et al.3 على أنها LNCs المترجمة في ظهارة القزحية تحت الانبساط وسدى الليمبوس. LNCs هي الخلايا الجذعية الداعمة ا....

Protocol

تم الحصول على أنسجة ليمبوس من متبرعين تتراوح أعمارهم بين 50 و 60 عاما من بنك العيون التابع للصليب الأحمر ، مستشفى تونغجي (ووهان ، الصين). تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات في تونغجي وتم إجراؤه وفقا لإعلان هلسنكي.

1. العزلة

  1. احصل على أنسجة الحواف من وسط تخزين القرنية على المدى المتوسط واعمل في ظل ظروف معقمة على طاولة عمل فائقة النظافة.
  2. كشط وإزالة القزحية والبطانة حول القرنية باستخدام شفرة جراحية مستديرة معقمة.
  3. قطع الأنسجة الطرفية إلى اثني عشر قطعة متساوية الحجم مع شفرة جراحية مع ترك 1 مم على جانبي القرنية والصلبة.
  4. انقل أنسجة الأطراف إلى طبق استزراع 3.5 سم ، أضف 1 مل من ....

النتائج

نمو LNC
تم عزل LNCs بنجاح وفقا لطريقة هضم كولاجيناز A (2 مجم / مل) لهضم أنسجة حافة القرنية الصلبة ، كما هو موضح أعلاه (الشكل 1). تمشيا مع دراسة تم الإبلاغ عنهاسابقا 3 ، بعد هضم كولاجيناز أ ، تم تصور مجموعات تشبه اليرقة تحت المجهر (الشكل 2). زادت ?.......

Discussion

عادة ما يتم الحفاظ على شفافية القرنية من خلال الترتيب والتوزيع المنتظم للألياف الصغيرة (قطرها 25-30 نانومتر) في سدى القرنية ، وهو أمر بالغ الأهمية لحدة الرؤية الطبيعية16. هناك 253 مليون شخص يعانون من ضعف البصر في جميع أنحاء العالم ، 36 مليون منهم مكفوفون17. تعتبر منظمة ا?.......

Disclosures

ليس لدى أي من المؤلفين أي إقرارات مالية ذات صلة.

Acknowledgements

شكرا ل Wei Wang و Lingjuan Xu و Rong Liu على التوجيه بشأن هذا العمل ، و Yongyao Tan و Bihui Jin و Chunxiu You و Li Guigang لتوفير بعض المواد ، و Guanyu Su لكتابة المخطوطة ، و Xiao Zhou و Yihong Xiong و Huatao Xie لتصحيح المخطوطة ، و Guigang Li لتوجيهاته الكاملة. ودعمت هذه الدراسة المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82070936، 81470606، 81570819)، ومشروع البحث العلمي للصحة وتنظيم الأسرة في مقاطعة هوبى (No. WJ2017M073) ، أفضل عشرة مشاريع بحثية طبية متعدية من مستشفى تونغجي (رقم 2016ZHYX20) ، مشروع تدريب الرواد الطبيين الشباب في مدينة ووهان (رقم 2015whzqnyxggrc10) ، برنامج توظيف المواهب العالمية (G2022154028L) ، مشروع اللجنة الوطنية للصحة في مقاطعة هوبي في عام 20....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4',6-Diamidino-2-PhenylindoleThermoFisherD13065μg/mL
Amphotericin BSigmaV9009191.25 μg/mL
Anti-CD73Abcamab2021221:50
Bovine Serum AlbuminMERCKA1933-
CD105Proteintech67075-1-Ig1:200
CD105Abcamab1140521:50
CD90Proteintech66766-1-Ig1:100
CD90Abcamab3077361:50
Cell IncubatorShanghai LishenK1119K4644HF90(HT)
Centrifuge systemStatSpin StatSpin CytoFuge 12-
Collagenase ARoche101035780012 mg/mL
Confocal microscopeZeiss LSM700-
Culture platevirya350035635 mm
DME/F-12 1:1 (1x) cytivaSH30023.0190%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary AntibodyThermoFisherA160161:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary AntibodyThermoFisher315681:1000
FACS Diva sofwareBD BiosciencesTree Star-
Flow CytometerBD BiosciencesBecton Dickinson LSRII-
Fluorescence microscopeolympuscx31 
GentamicinSigmaG191450 μg/mL
HemocytometerMERCKZ359629Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription KitThermoFisher4374966
Inverted phase-contrast microscope UOPDSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)SigmaI31465 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCsgibco10828-02810%
MatrigelBioCoat356234-
Pan-CKAbcamab77531:1000
ParaformaldehydeNoninBioNBS01354.00%
ParaformaldehydeMKBioMM-15054%
PDGFRβAbclonalA14441:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrumentApplied BiosystemsStep One Plus-
Recombinant Human FGF-basicPeprotech100-18B4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)Peprotech300-0510 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation KitQiagen74104-
SCFBiossbs-0545R1:100
SCFAbcamab526031:50
StereomicroscopeZEISSSteREO Discovery. V8
Sterile surgical round bladeCareforde29500size 10
TaqMan Gene Expression Assay MixApplied Biosystems4448489
Triton X-100MERCKX1000.20%
Trypan blueThermoFisher152500610.40%
Trypsin-EDTAGenviewGP31080.25%
Tween 20MERCKP9416-
Ultra Clean BenchLaiTeLT20200705SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
Vim Abcamab925471:100

References

  1. Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
  2. Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Matrigel VIM CD90 CD105 PDGFR Pan CK CD73 SCF BMMSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved