A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل وتحديد الخلايا المتخصصة في الحوفي البشري.
نبلغ هنا عن إجراء قياسي لعزل وتحديد الخلايا المتخصصة القزحية (LNCs). تم استخدام أنسجة الليمبوس التي تم الحصول عليها من بنك العين لعزل LNCs. تم تقسيم الأنسجة إلى 12 قطعة تحت ظروف معقمة وهضمها لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا باستخدام كولاجيناز A للحصول على مجموعات الخلايا مع LNCs والخلايا السلفية الظهارية القزحية. تم هضم مجموعات الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام 0.25٪ trypsin-EDTA للحصول على خلايا مفردة ثم زرعها في وسط الخلايا الجذعية الجنينية المعدلة (MESCM) على سطح بلاستيكي مغطى ب 5٪ Matrigel. تم تمرير الخلايا عند التقاء 70٪ ، وتم تحديد LNCs باستخدام التألق المناعي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) ، وقياس التدفق الخلوي. تم عزل LNCs الأولية ومرورها أكثر من 12 مرة. كان نشاط انتشار LNCs من P4 إلى P6 هو الأعلى. عبرت LNCs عن علامات خلايا جذعية أعلى من BMMSCs (SCF و Nestin و Rex1 و SSEA4 و CD73 و CD90 و MSX1 و P75NTR و PDGFRβ). علاوة على ذلك ، أظهرت النتائج أن P4 LNCs عبرت بشكل موحد عن VIM و CD90 و CD105 و PDGFRβ ، ولكن ليس Pan-CK ، والتي يمكن استخدامها كعلامة لتحديد LNCs. أظهر تحليل التدفق الخلوي أن ما يقرب من 95٪ و 97٪ و 92٪ و 11٪ من LNCs عبرت عن CD73 و CD90 و CD105 و SCF على التوالي ، بينما كانت 68٪ و 99٪ و 20٪ و 3٪ في BMMSCs. ويمكن أن توفر العملية المعيارية لعزل البلدان غير الطبيعية وتحديد هويتها أساسا مختبريا موثوقا به للاستخدام الواسع النطاق للبلدان غير الطبيعية.
أصبح حدوث نقص الخلايا الجذعية الظهارية القرنية (CESD) ، ويسمى أيضا نقص الخلايا الجذعية الطرفية (LSCD) 1 ، وتجديد ظهارة القرنية (CES) أكثر إلحاحا بسبب عدوى القرنية وإصابتها. إذا لم يتم علاجها بشكل صحيح ، يمكن أن يؤدي CESD إلى العمى الذي يتطلب زرع القرنية. نتيجة لذلك ، أصبح تجديد CES أكثر أهمية. هناك مجموعة من الخلايا الداعمة تسمى الخلايا المتخصصة القزحية (LNCs) التي توفر الدعم الأساسي لوظيفة CES. تم عزل الخلايا الجذعية اللحمية القزحية لأول مرة بواسطة Polisetty et al.2 وتم تحديدها بواسطة Xie et al.3 على أنها LNCs المترجمة في ظهارة القزحية تحت الانبساط وسدى الليمبوس. LNCs هي الخلايا الجذعية الداعمة ا....
تم الحصول على أنسجة ليمبوس من متبرعين تتراوح أعمارهم بين 50 و 60 عاما من بنك العيون التابع للصليب الأحمر ، مستشفى تونغجي (ووهان ، الصين). تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات في تونغجي وتم إجراؤه وفقا لإعلان هلسنكي.
1. العزلة
نمو LNC
تم عزل LNCs بنجاح وفقا لطريقة هضم كولاجيناز A (2 مجم / مل) لهضم أنسجة حافة القرنية الصلبة ، كما هو موضح أعلاه (الشكل 1). تمشيا مع دراسة تم الإبلاغ عنهاسابقا 3 ، بعد هضم كولاجيناز أ ، تم تصور مجموعات تشبه اليرقة تحت المجهر (الشكل 2). زادت ?.......
عادة ما يتم الحفاظ على شفافية القرنية من خلال الترتيب والتوزيع المنتظم للألياف الصغيرة (قطرها 25-30 نانومتر) في سدى القرنية ، وهو أمر بالغ الأهمية لحدة الرؤية الطبيعية16. هناك 253 مليون شخص يعانون من ضعف البصر في جميع أنحاء العالم ، 36 مليون منهم مكفوفون17. تعتبر منظمة ا?.......
ليس لدى أي من المؤلفين أي إقرارات مالية ذات صلة.
شكرا ل Wei Wang و Lingjuan Xu و Rong Liu على التوجيه بشأن هذا العمل ، و Yongyao Tan و Bihui Jin و Chunxiu You و Li Guigang لتوفير بعض المواد ، و Guanyu Su لكتابة المخطوطة ، و Xiao Zhou و Yihong Xiong و Huatao Xie لتصحيح المخطوطة ، و Guigang Li لتوجيهاته الكاملة. ودعمت هذه الدراسة المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82070936، 81470606، 81570819)، ومشروع البحث العلمي للصحة وتنظيم الأسرة في مقاطعة هوبى (No. WJ2017M073) ، أفضل عشرة مشاريع بحثية طبية متعدية من مستشفى تونغجي (رقم 2016ZHYX20) ، مشروع تدريب الرواد الطبيين الشباب في مدينة ووهان (رقم 2015whzqnyxggrc10) ، برنامج توظيف المواهب العالمية (G2022154028L) ، مشروع اللجنة الوطنية للصحة في مقاطعة هوبي في عام 20....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | - |
CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | - |
Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | - |
Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | - |
Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
Matrigel | BioCoat | 356234 | - |
Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | - |
Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | - |
SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
Tween 20 | MERCK | P9416 | - |
Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved