كروماتوغرافيا الغاز - الأيض المستهدف القائم على قياس الطيف الكتلي لعينات المرجان الصلب

Summary

هنا ، نقدم استخراج وإعداد المستقلبات القطبية وشبه القطبية من holobiont المرجانية ، وكذلك الأنسجة المضيفة المرجانية المنفصلة وكسور خلايا Symbiodiniaceae ، لتحليل مطياف الكتلة اللوني الغازي.

Abstract

أثبتت الأساليب القائمة على قياس الطيف الكتلي اللوني للغاز (GC-MS) أنها قوية لتوضيح الأساس الأيضي لتكافل cnidarian-dinoflagellate وكيف يستجيب المرجان للإجهاد (أي أثناء التبييض الناجم عن درجة الحرارة). تم تطبيق التنميط المستقلب في الحالة المستقرة للهولوبيونت المرجاني ، والذي يضم المضيف cnidarian والميكروبات المرتبطة به (Symbiodiniaceae وغيرها من الطلائعيات والبكتيريا والعتائق والفطريات والفيروسات) بنجاح في ظل الظروف المحيطة والإجهاد لتوصيف الحالة الأيضية الشاملة للمرجان.

ومع ذلك ، للإجابة على الأسئلة المحيطة بالتفاعلات التكافلية ، من الضروري تحليل ملامح الأيض للمضيف المرجاني وتعايشاته الطحلبية بشكل مستقل ، والتي لا يمكن تحقيقها إلا عن طريق الفصل المادي وعزل الأنسجة ، يليها استخراج وتحليل مستقل. في حين أن تطبيق الأيض جديد نسبيا في مجال المرجان ، فقد أدت الجهود المستمرة لمجموعات البحث إلى تطوير طرق قوية لتحليل المستقلبات في الشعاب المرجانية ، بما في ذلك فصل الأنسجة المضيفة المرجانية والطحالب المتعايشة.

تقدم هذه الورقة دليلا تفصيليا لفصل holobiont واستخراج المستقلبات لتحليل GC-MS ، بما في ذلك خطوات التحسين الرئيسية للنظر فيها. نوضح كيف ، بمجرد تحليلها بشكل مستقل ، فإن ملف الأيض المشترك للجزأين (المرجان و Symbiodiniaceae) يشبه ملف تعريف الكل (holobiont) ، ولكن من خلال فصل الأنسجة ، يمكننا أيضا الحصول على معلومات أساسية حول التمثيل الغذائي والتفاعلات بين الشريكين التي لا يمكن الحصول عليها من الكل وحده.

Introduction

تمثل المستقلبات المنتجات النهائية للعمليات الخلوية ، ويمكن أن توفر الأيضات - دراسة مجموعة المستقلبات التي ينتجها كائن حي أو نظام بيئي معين - مقياسا مباشرا لعمل الكائن الحي¹. وهذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص لاستكشاف النظم الإيكولوجية والتفاعلات التكافلية وأدوات الاستعادة ، حيث أن الهدف من معظم استراتيجيات الإدارة هو الحفاظ على (أو استعادة) وظائف خدمة النظام الإيكولوجي المحددة². الشعاب المرجانية هي أحد النظم الإيكولوجية المائية التي توضح القيمة المحتملة لعملية التمثيل الغذائي لتوضيح التفاعلات التكافلية وربط الاستجابات الفسيولوجية المرجانية بالتأثيرات على مستوى المجتمع ومستوى النظام الإيكولوجي³. يحظى ....

Protocol

ملاحظة: تم وصف التصميم التجريبي وجمع العينات وتخزينها بالتفصيل في مكان آخر²،^30،31. يجب الحصول على الموافقة على تصريح جمع الشعاب المرجانية البرية قبل الجمع والتجريب. تم جمع العينات هنا من مستعمرات Montipora mollis (اللون الأخضر) المستوردة من مزارع باتافيا المرجانية (جيرالدتون ، واشنطن) ، والتي تم جمعها في الأصل من الشعاب المرجانية قبالة جزر أبروهلوس (غرب أستراليا ؛ 28 ° 52'43.3 "S 114 ° 00'17.0" E) على عمق 1 متر بموجب ترخيص الاستزراع المائي AQ1643. قبل أخذ العينات ، تم الاحتفاظ بالمستعمرات في حوض مائي سعة 800 لتر عند 35 PSU ، تحت الضوء الأزرق والأبيض عند 150 ميكرولتر ....

النتائج

وجميع البيانات التي أنتجت خلال هذا العمل متاحة في المعلومات التكميلية.

فصل المضيف المتكافل

الشكل 1: إعداد فصل أنسجة مضيف المرجان وخلايا Symbiodiniaceae والتحقق من صح.......

Discussion

يمكن تحقيق فصل المضيف والمتعايش بسهولة وسرعة عن طريق الطرد المركزي البسيط ، وتظهر النتائج هنا أن فصل الكسور يمكن أن يوفر معلومات قيمة تشير إلى مساهمات محددة لأعضاء holobiont ، والتي يمكن أن تسهم في التحليل الوظيفي لصحة المرجان. في الشعاب المرجانية البالغة ، يتم إجراء تخليق الدهون بشكل أس?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% LC-grade methanol	Merck	439193	LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP	Eppendorf	30121880	Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph	Shimadzu	GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads	Merck	G1152	This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler	Shimadzu	AOC6000
Bradford reagent	Merck	B6916	Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun	Ozito	6270636	Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine	Merck	605514/ 600148	Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate	Merck	CLS3614
Glass scintillation vials	Merck	V7130	20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G	Merck	56834	if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer		v4
R		v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software		v3.6
Sodium Hydroxide	Merck	S5881	Pellets to make 1 M solution
tidyverse		v1.3.1	R package
TissueLyser LT	Qiagen	85600	Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate	Greiner	M3812
Whirl-Pak sample bag	Merck	WPB01018WA	Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread