أخذ عينات من السائل الدماغي الشوكي والدم من الوريد الذيل الجانبي في الفئران أثناء تسجيلات EEG

Summary

يظهر البروتوكول عمليات جمع متكررة للسائل النخاعي والدم من الفئران المصابة بالصرع بالتوازي مع المراقبة المستمرة لتخطيط كهربية الدماغ بالفيديو (EEG). هذه مفيدة لاستكشاف الروابط المحتملة بين التغيرات في جزيئات سوائل الجسم المختلفة ونشاط النوبات.

Abstract

نظرا لأن تكوين سوائل الجسم يعكس العديد من الديناميات الفسيولوجية والمرضية ، يتم الحصول على عينات السائل البيولوجي بشكل شائع في العديد من السياقات التجريبية لقياس الجزيئات ذات الأهمية ، مثل الهرمونات أو عوامل النمو أو البروتينات أو الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر. مثال محدد هو أخذ عينات من السوائل البيولوجية في البحث عن المؤشرات الحيوية للصرع. في هذه الدراسات ، من المستحسن مقارنة مستويات الجزيئات في السائل النخاعي (CSF) وفي البلازما ، عن طريق سحب السائل الدماغي الشوكي والبلازما بالتوازي والنظر في المسافة الزمنية لأخذ العينات من وإلى النوبات. يعد الجمع بين CSF وأخذ عينات البلازما ، إلى جانب مراقبة تخطيط كهربية الدماغ بالفيديو في المصابة بالصرع ، نهجا واعدا للتحقق من صحة المؤشرات الحيوية التشخيصية والتنبؤية المفترضة. هنا ، يتم وصف إجراء انسحاب السائل الدماغي الشوكي المشترك من الصهريج العظيم وأخذ عينات الدم من الوريد الجانبي للذيل في الفئران المصابة بالصرع والتي يتم مراقبتها باستمرار بواسطة تخطيط كهربية الدماغ بالفيديو. يوفر هذا الإجراء مزايا كبيرة مقارنة بالتقنيات الأخرى شائعة الاستخدام. يسمح بأخذ العينات بسرعة مع الحد الأدنى من الألم أو الغزو ، وتقليل وقت التخدير. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه للحصول على عينات CSF والبلازما في كل من الفئران المسجلة EEG المربوطة والقياس عن بعد ، ويمكن استخدامه بشكل متكرر عبر أيام متعددة من التجربة. من خلال تقليل الإجهاد الناتج عن أخذ العينات عن طريق تقصير تخدير الأيزوفلوران ، من المتوقع أن تعكس التدابير بشكل أكثر دقة المستويات الحقيقية للجزيئات التي تم فحصها في السوائل الحيوية. اعتمادا على توافر مقايسة تحليلية مناسبة ، يمكن استخدام هذه التقنية لقياس مستويات جزيئات متعددة ومختلفة أثناء إجراء تسجيل EEG في نفس الوقت.

Introduction

يعد السائل الدماغي الشوكي (CSF) وأخذ عينات الدم مهمين لتحديد المؤشرات الحيوية للصرع والتحقق من صحتها ، في كل من الأبحاث قبل السريرية والسريرية ^1,2. في الوقت الحاضر ، يركز تشخيص الصرع ومعظم الأبحاث حول المؤشرات الحيوية للصرع على EEG والتصوير العصبي^3،4،5. غير أن هذه النهج تنطوي على العديد من القيود. بصرف النظر عن قياسات فروة الرأس الروتينية ، في كثير من الحالات ، يتطلب تخطيط كهربية الدماغ تقنيات غازية مثل أقطاب العمق⁶. تتميز طرق تصوير الدماغ بضعف الدقة الزمنية والمكانية وهي مكلفة نسبيا وتستغرق

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة فيرارا ووزارة الصحة الإيطالية (الترخيص: D.M. 603/2022-PR) وفقا للمبادئ التوجيهية الموضحة في توجيه مجلس المجتمعات الأوروبية المؤرخ 24 نوفمبر 1986 (86/609 / EEC) بشأن حماية المستخدمة لأغراض تجريبية وعلمية أخرى. تم تعديل هذا البروتوكول خصيصا لمزيد من تحليلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (sncRNAs) في السائل الدماغي الشوكي للفئران والبلازما التي تم الحصول عليها تحت سيطرة EEG في المصابة بالصرع. حسب اختياره ، يرجى الاطلاع على فيديو JoVE ذي الصلة لفهم أفضل وتحسينات الجراحة^19،20،....

النتائج

تم الإبلاغ عن نتائج إجراءات CSF وسحب الدم المختلفة التي أجريت في 9 فئران تحكم و 18 فأرا مزمنا مصابا بالصرع ، وكلها مزروعة بأقطاب كهربائية في شهر واحد بعد SE ، من حيث معدل النجاح. بعد الزرع ، تمت مراقبة جميع الفئران بالفيديو EEG لمدة شهر واحد ، تم خلالها سحب السائل الدماغي الشوكي بالإضافة إلى الدم .......

Discussion

يوضح هذا العمل تقنية سهلة الإتقان ل CSF وجمع الدم في الفئران ، والتي قد تكون مفيدة ليس فقط للدراسات في نماذج الصرع ولكن أيضا للحالات أو الأمراض العصبية الأخرى مثل مرض الزهايمر أو باركنسون أو التصلب المتعدد. في أبحاث الصرع ، تعتبر كل من إجراءات أخذ العينات إلى جانب تخطيط كهربية الدماغ بالفيد?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok	BD Italy SpA, Milan, Italy	367246	Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E)	BD Italy SpA, Milan, Italy	365975	Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm	Nipro, Osaka, Japan	PSY-23-ET-ICU	Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R	DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England	112000033	Material
Cotton suture 3-0	Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA	7343H	Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam	Dechra Veterinary Products, Torino, Italy	105183014 (AIC)	Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	PNM-VIDEO-008	Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up	EZVIZ Network, Hangzhou, Cina	EZVIZ (V5.3.2)	Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity	Laboratoire Garcin-Bactinyl, France	LB 920111	Solution
Dummy guide cannula 8 mm	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	CXD-8	Material
Electrode 3-channel two-twisted	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
Electrode holder for stereotxic surgery	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	1776-P1	Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6137	Equipment
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL	Eppendorf Srl, Milan, Italy	30124332	Material
Eppendorf μCuvette G1.0	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6138	Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo	Zoetis, Rome, Italy	103287025 (AIC)	Solution
Ketamine (Imalgene)	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Lithium chloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	L9650	Material
Microinjection cannula 31G 9 mm	Agn Tho's, Lindigö Sweden	CXMI-9	Material
MP150 modular data acquisition and analysis system	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night	Ursapharm, Milan, Italy	941791927 (AIC)	Material
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	P6503	Material
PTFE Tube with joint	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	JT-10	Material
Saline	0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0		Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S2250	Material
Scopolamine methyl nitrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S1876	Material
Silver sulfadiazine 1% cream	Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy	025561010 (AIC)	Material
Simplex rapid dental methacrylic cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA	Model 963	Equipment
Sucrose solution	10% sucrose in distilled water	Home-made	Solution
Syringe 1 mL	Biosigma, Cona, Venezia, Italy	20,71,26,03,00,350	Material
Telemeters	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	CTA-F40	Material
Telemetry EEG traces analyzer	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	NeuroScore v3-0	Equipment
Telemetry system	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	Hardware plus software Ponemah core 6.51	Equipment
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	X1251	Material