التحضير وتلطيخ التألق المناعي للحزم وخلايا الألياف المفردة من قشرة ونواة عدسة العين

Summary

يصف هذا البروتوكول طرقا لإعداد خلايا ألياف عدسة العين المحيطية والناضجة والنووية للتلطيخ المناعي لدراسة التداخل المعقد من خلية إلى أخرى وبنية الغشاء.

Abstract

العدسة عبارة عن عضو شفاف وبيضاوي الشكل في الحجرة الأمامية للعين يتغير شكله لتركيز الضوء بدقة على شبكية العين لتشكيل صورة واضحة. يتكون الجزء الأكبر من هذا النسيج من خلايا ليفية متخصصة ومتمايزة لها مقطع عرضي سداسي وتمتد من القطب الأمامي إلى القطب الخلفي للعدسة. هذه الخلايا الطويلة والنحيفة تعارض بشدة الخلايا المجاورة ولها تداخلات معقدة على طول الخلية. الهياكل المتشابكة المتخصصة مطلوبة للخصائص الميكانيكية الحيوية العادية للعدسة وقد تم وصفها على نطاق واسع باستخدام تقنيات المجهر الإلكتروني. يوضح هذا البروتوكول الطريقة الأولى للحفاظ على وتلوين المفرد وكذلك حزم خلايا ألياف عدسة الماوس للسماح بالتوطين التفصيلي للبروتينات داخل هذه الخلايا ذات الشكل المركب. توضح البيانات التمثيلية تلطيخ خلايا الألياف الطرفية والتمايزية والناضجة والنووية في جميع مناطق العدسة. يمكن استخدام هذه الطريقة على خلايا الألياف المعزولة من عدسات الأنواع الأخرى.

Introduction

العدسة عبارة عن نسيج شفاف وبيضاوي الشكل في الحجرة الأمامية للعين يتكون من نوعين من الخلايا ، الخلايا الظهارية والليفية 1 (الشكل 1). هناك طبقة أحادية من الخلايا الظهارية التي تغطي نصف الكرة الأمامي للعدسة. تتمايز الخلايا الليفية عن الخلايا الطلائية، وتشكل الجزء الأكبر من العدسة. تخضع خلايا الألياف عالية التخصص لبرمجة الاستطالة والتمايز والنضج ، والتي تتميز بتغيرات واضحة في مورفولوجيا غشاء الخلية من محيط العدسة إلى مركز العدسة²،³،⁴،⁵،⁶،⁷،⁸،<....

Protocol

تم الاعتناء بالفئران بناء على بروتوكول حيواني وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة إنديانا بلومنجتون. كانت الفئران المستخدمة لتوليد بيانات تمثيلية هي التحكم (من النوع البري) في خلفية C57BL6 / J ، وأنثى ، وعمر 8-12 أسبوعا. يمكن استخدام كل من ذكور وإناث الفئران في هذه التجربة ، لأنه من غير المرجح أن يؤثر جنس الفئران على نتيجة التجربة.

1. تشريح العدسة وفك الكبسولة

1. القتل الرحيم للفئران باتباع "دليل رعاية واستخدام المختبر" الصادر عن المعاهد الوطنية للصحة بالإضافة إلى بروتوكولات استخدام الحيوانات المعتمدة من قبل المؤسسة.
   ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم القتل الرحيم للفئران بجرعة زائدة من....

النتائج

يتم تحضير خلايا ألياف العدسة من قشرة العدسة (الألياف المتمايزة والألياف الناضجة) والنواة ، ويتم تلطيخ الخلايا بالقضيب ل F-actin و WGA لغشاء الخلية. يتم ملاحظة وتصوير خليط من حزم الخلايا أو ألياف العدسة المفردة (الشكل 3). من قشرة العدسة ، تم العثور على نوعين من الخلايا (.......

Discussion

وقد أظهر هذا البروتوكول طرق التثبيت والحفظ والمناعة التي تحافظ بأمانة على مورفولوجيا غشاء 3D للحزم أو خلايا ألياف العدسة المفردة من أعماق مختلفة في العدسة. تتم مقارنة ألياف العدسة الملطخة مع مستحضرات SEM التي تستخدم منذ فترة طويلة لدراسة مورفولوجيا خلايا ألياف العدسة. تظهر النتائج هياكل غش.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Triton X-100	FisherScientific	BP151-500
60mm plate	FisherScientific	FB0875713A
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
10X phosphate buffered saline	ThermoFisher	70011-044
1X phosphate buffered saline	ThermoFisher	14190136
48-well plate	CytoOne	CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)	FisherScientific	12-553-467
Curved tweezers	World Precision Instruments	501981
Dissection microscope	Carl Zeiss	Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers	Electron Microscopy Sciences	72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	FisherScientific	12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software	Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin (rhodamine)	ThermoFisher	R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11	VWR	76241-186
Secondary antibody
Straight forceps	World Precision Instruments	11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)	FisherScientific	12-565-154
Ultra-fine scissors	World Precision Instruments	501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)	Vector Laboratories	FL-1021-5