A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الورقة كيف يمكن تطبيق المجهر ثنائي الفوتون الحساس للاستقطاب لتوصيف التنظيم المحلي داخل الهياكل الفوقية الأميلويد الخالية من التسمية. كما يصف كيفية تحضير العينة وقياسها ، وتجميع الإعداد المطلوب ، وتحليل البيانات للحصول على معلومات حول التنظيم المحلي لألياف الأميلويد.

Abstract

بالمقارنة مع نظيره ذو الفوتون الواحد ، فإن الإثارة ثنائية الفوتون مفيدة لتجارب التصوير الحيوي بسبب انخفاض السمية الضوئية ، واختراق الأنسجة الأعمق ، والتشغيل الفعال في الأنظمة المزدحمة ، وتقليل الانتقاء الضوئي الزاوي للفلوروفور. وبالتالي ، فإن إدخال تحليل الاستقطاب في المجهر الفلوري ثنائي الفوتون (2PFM) يوفر تحديدا أكثر دقة للتنظيم الجزيئي في عينة مقارنة بطرق التصوير القياسية القائمة على العمليات البصرية الخطية. في هذا العمل ، نركز على 2PFM الحساسة للاستقطاب (ps-2PFM) وتطبيقها في تحديد الترتيب الجزيئي داخل الهياكل الحيوية المعقدة - كرويات الأميلويد. غالبا ما يتم تشخيص الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر أو باركنسون من خلال الكشف عن مجاميع بروتين الأميلويد التي تشكلت بسبب ضعف عملية اختلال البروتين. يؤدي استكشاف هيكلها إلى فهم أفضل لمسار إنشائها وبالتالي تطوير طرق تشخيص أكثر حساسية. تقدم هذه الورقة ps-2PFM التي تم تكييفها لتحديد ترتيب الألياف المحلية داخل كرويات الأنسولين البقري ومجاميع البروتين النشواني الكروي. علاوة على ذلك ، نثبت أن التقنية المقترحة يمكن أن تحل التنظيم ثلاثي الأبعاد للألياف داخل الكروية.

Introduction

على مدى العقود الماضية ، على الرغم من حدوث تطور كبير للعديد من تقنيات الفحص المجهري الفلوري للتصوير الحيوي للبروتينات ومجاميعها1 ، فقد تم استخدام عدد قليل فقط لحل ترتيبها المحلي داخل العينة 2,3. تم استخدام الفحص المجهري للتصوير مدى الحياةالفلوري 4 لدراسة عدم التجانس الهيكلي الجوهري للهياكل الفوقية الأميلويد الكروية. علاوة على ذلك ، يمكن حل التحديد الكمي للترتيب المحلي داخل الهياكل الحيوية المعقدة والمعبأة بكثافة مثل spherulites باستخدام طرق حساسة للاستقطاب3. ومع ذلك ، فإن تقنيات التألق القياسية مع اختراق الأنسجة السطحية محدودة لأن استخدام ....

Protocol

1. تحضير شرائح المجهر مع كرويات كاملة النمو

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول. تم تحضير جميع المحاليل بالماء منزوع الأيونات (18.2 متر مكعب سم عند 25 درجة مئوية) تم الحصول عليها من نظام تنقية المياه.

  1. احتضان كرويات الأميلويد بناء على البروتوكول الذي وصفه كريبس وآخرون16. مع بعض التعديلات ، كما هو موضح أدناه.
    1. تزن 10 ملغ من مسحوق الأنسولين في أنبوب 1.5 مل.
    2. قم بإذابة المسحوق بحصة 1 مل من محلول H2O / HCl منزوع الأيونات (درجة الحموضة 1.5).
    3. أغلق العينة بالشريط وضعه....

النتائج

يوفر البروتوكول المقدم إرشادات خطوة بخطوة من خلال إعداد الهياكل الفوقية للأميلويد للاختبار باستخدام ps-2PFM ، وبناء النظام المجهري ، وقياسات العينة المناسبة. ومع ذلك ، قبل المجموعة النهائية من القياسات ، من الضروري محاذاة APDs بشكل صحيح مع مرجع الخواص ، مما يؤدي إلى جمع إشارة متناظرة ذات شكل و.......

Discussion

يعد الفحص المجهري ثنائي الفوتون الحساس للاستقطاب أداة قيمة لدراسة الترتيب المحلي للألياف داخل الهياكل الفوقية الأميلويد ، والتي تتطلب تعديلات صغيرة فقط على الإعداد القياسي متعدد الفوتونات. نظرا لأنه يعمل على الظواهر البصرية غير الخطية ، يمكن تحقيق تقليل اختيار الصورة الزاوية والدقة ال?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع Sonata Bis 9 (2019/34 / E / ST5 / 00276) بتمويل من المركز الوطني للعلوم في بولندا.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mmChemland04-298.202.04
DPX mountant for histologySigma-Aldrich6522Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropyleneChemland02-63102
Eppendorf ThermoMixer CEppendorfUsed for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification systemHydrolabSource of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),Sigma-Aldrich30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))Sigma-AldrichI5500
Methanol (HPLC grade)Sigma-Aldrich270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mmChemland04-296.202.09
Olympus BX60OlympusPolarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2ChemlandVIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra IICoherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass FilterThorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass FilterThorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nmThorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NANikon
piezo 3D stagePiezosystem Jena
Polarizing BeamsplitterThorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mWThorlabs
Software
LabView 2018National InstrumentsVersion 18.0.1f2
Matplotlib libraryVersion 3.3.2
NumPy libraryVersion 1.19.2
SciPy libraryVersion 1.5.2
Spyder Python 3 IDEVersion 4.1.5

References

  1. Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S., Giraldo, J., Ciruela, F. . Progress in Molecular Biology and Translational Science. 169, 1-41 (2020).
  2. Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein a....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

2PFM 2PFM ps 2PFM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved