مجهر ثنائي الفوتون حساس للاستقطاب لتوصيف هيكلي أميلويد خال من الملصقات

Summary

تصف هذه الورقة كيف يمكن تطبيق المجهر ثنائي الفوتون الحساس للاستقطاب لتوصيف التنظيم المحلي داخل الهياكل الفوقية الأميلويد الخالية من التسمية. كما يصف كيفية تحضير العينة وقياسها ، وتجميع الإعداد المطلوب ، وتحليل البيانات للحصول على معلومات حول التنظيم المحلي لألياف الأميلويد.

Abstract

بالمقارنة مع نظيره ذو الفوتون الواحد ، فإن الإثارة ثنائية الفوتون مفيدة لتجارب التصوير الحيوي بسبب انخفاض السمية الضوئية ، واختراق الأنسجة الأعمق ، والتشغيل الفعال في الأنظمة المزدحمة ، وتقليل الانتقاء الضوئي الزاوي للفلوروفور. وبالتالي ، فإن إدخال تحليل الاستقطاب في المجهر الفلوري ثنائي الفوتون (2PFM) يوفر تحديدا أكثر دقة للتنظيم الجزيئي في عينة مقارنة بطرق التصوير القياسية القائمة على العمليات البصرية الخطية. في هذا العمل ، نركز على 2PFM الحساسة للاستقطاب (ps-2PFM) وتطبيقها في تحديد الترتيب الجزيئي داخل الهياكل الحيوية المعقدة - كرويات الأميلويد. غالبا ما يتم تشخيص الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر أو باركنسون من خلال الكشف عن مجاميع بروتين الأميلويد التي تشكلت بسبب ضعف عملية اختلال البروتين. يؤدي استكشاف هيكلها إلى فهم أفضل لمسار إنشائها وبالتالي تطوير طرق تشخيص أكثر حساسية. تقدم هذه الورقة ps-2PFM التي تم تكييفها لتحديد ترتيب الألياف المحلية داخل كرويات الأنسولين البقري ومجاميع البروتين النشواني الكروي. علاوة على ذلك ، نثبت أن التقنية المقترحة يمكن أن تحل التنظيم ثلاثي الأبعاد للألياف داخل الكروية.

Introduction

على مدى العقود الماضية ، على الرغم من حدوث تطور كبير للعديد من تقنيات الفحص المجهري الفلوري للتصوير الحيوي للبروتينات ومجاميعها¹ ، فقد تم استخدام عدد قليل فقط لحل ترتيبها المحلي داخل العينة ^2,3. تم استخدام الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة^{الفلوري 4} لدراسة عدم التجانس الهيكلي الجوهري للهياكل الفوقية الأميلويد الكروية. علاوة على ذلك ، يمكن حل التحديد الكمي للترتيب المحلي داخل الهياكل الحيوية المعقدة والمعبأة بكثافة مثل spherulites باستخدام طرق حساسة للاستقطاب³. ومع ذلك ، فإن تقنيات التألق القياسية مع اختراق الأنسجة السطحية محدودة لأن استخدام ....

Protocol

1. تحضير شرائح المجهر مع كرويات كاملة النمو

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول. تم تحضير جميع المحاليل بالماء منزوع الأيونات (18.2 متر مكعب سم عند 25 درجة مئوية) تم الحصول عليها من نظام تنقية المياه.

1. احتضان كرويات الأميلويد بناء على البروتوكول الذي وصفه كريبس وآخرون¹⁶. مع بعض التعديلات ، كما هو موضح أدناه.
   1. تزن 10 ملغ من مسحوق الأنسولين في أنبوب 1.5 مل.
   2. قم بإذابة المسحوق بحصة 1 مل من محلول H₂O / HCl منزوع الأيونات (درجة الحموضة 1.5).
   3. أغلق العينة بالشريط وضعه....

النتائج

يوفر البروتوكول المقدم إرشادات خطوة بخطوة من خلال إعداد الهياكل الفوقية للأميلويد للاختبار باستخدام ps-2PFM ، وبناء النظام المجهري ، وقياسات العينة المناسبة. ومع ذلك ، قبل المجموعة النهائية من القياسات ، من الضروري محاذاة APDs بشكل صحيح مع مرجع الخواص ، مما يؤدي إلى جمع إشارة متناظرة ذات شكل و.......

Discussion

يعد الفحص المجهري ثنائي الفوتون الحساس للاستقطاب أداة قيمة لدراسة الترتيب المحلي للألياف داخل الهياكل الفوقية الأميلويد ، والتي تتطلب تعديلات صغيرة فقط على الإعداد القياسي متعدد الفوتونات. نظرا لأنه يعمل على الظواهر البصرية غير الخطية ، يمكن تحقيق تقليل اختيار الصورة الزاوية والدقة ال?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5