توليد عضويات الكلى في تعليق من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة شاملة وفعالة لإنتاج عضويات الكلى من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) باستخدام ظروف ثقافة التعليق. يكمن التركيز الأساسي لهذه الدراسة في تحديد كثافة الخلايا الأولية وتركيز ناهض WNT ، مما يفيد الباحثين المهتمين بأبحاث الكلى العضوية.

Abstract

يمكن توليد عضويات الكلى من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) من خلال طرق مختلفة. هذه المواد العضوية تحمل وعدا كبيرا لنمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والتطبيقات العلاجية المحتملة. تقدم هذه المقالة إجراء خطوة بخطوة لإنشاء عضويات الكلى من iPSCs ، بدءا من الخط البدائي الخلفي (PS) إلى الأديم المتوسط المتوسط المتوسط (IM). يعتمد النهج على وسيط APEL 2 ، وهو وسيط محدد خال من المكونات الحيوانية. يتم استكماله بتركيز عال من ناهض WNT (CHIR99021) لمدة 4 أيام ، يليه عامل نمو الخلايا الليفية 9 (FGF9) / الهيبارين وتركيز منخفض من CHIR99021 لمدة 3 أيام إضافية. خلال هذه العملية ، يتم التركيز على اختيار كثافة الخلايا المثلى وتركيز CHIR99021 في بداية iPSCs ، حيث أن هذه العوامل ضرورية لتوليد عضوي الكلى بنجاح. أحد الجوانب المهمة لهذا البروتوكول هو ثقافة التعليق في لوحة منخفضة الالتصاق ، مما يسمح لل IM بالتطور تدريجيا إلى هياكل نيفرون ، تشمل الهياكل الكبيبية والأنبوبية القريبة والأنبوبية البعيدة ، وكلها مقدمة بتنسيق مفهوم بصريا. بشكل عام ، يقدم هذا البروتوكول التفصيلي تقنية فعالة ومحددة لإنتاج عضويات الكلى من iPSCs المتنوعة ، مما يضمن نتائج ناجحة ومتسقة.

Introduction

تلعب الكلية دورا مهما في الحفاظ على التوازن الفسيولوجي ، اعتمادا على وحدتها الوظيفية. يمكن للنيفرون ، الذي يفرز الفضلات ، تنظيم تكوين سوائل الجسم. مرض الكلى المزمن (CKD) ، الناجم عن طفرات وراثية أو عوامل أخرى عالية الخطورة ، سيتقدم في النهاية إلى المرحلة النهائية من مرض الكلى (ESKD) ^1,2. يبدو أن ESKD يرجع إلى قدرة التجديد المحدودة للنيفرون. وبالتالي ، مطلوب العلاج ببدائل الكلى. يتيح التمايز الموجه ل iPSCs البشرية الجيل في المختبر من عضويات الكلى ثلاثية الأبعاد الخاصة بالمريض ، والتي يمكن استخدامها لدراسة نمو الكلى ، ونمذجة الأمراض الخاصة بالمريض ، وإجراء فحص الأدوية السامة للكلية

Protocol

تم الحصول على iPSCs المستخدمة في هذه الدراسة من مصدر تجاري. تم الحفاظ على الخلايا بوسط mTeSR على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء القاع المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). يحتوي الجدول 1 على جميع التراكيب المتوسطة المستخدمة في الدراسة.

1. طلاء iPSCs للتمايز وإحداث خط بدائي خلفي (PS)

1. اغسل iPSCs على لوحة 6 آبار مغلفة بمصفوفة الغشاء مع 2 مل DPBS. نضح DPBS باستخدام ماصة.
2. أضف 1 مل من محلول فصل الخلايا المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) لفصل iPSCs واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. أضف 1 مل من mTeSR إلى iPSCs ، وتأكد من رفع الخلايا عن السطح البلاستيكي.

النتائج

يتم تحقيق إنتاج IM عن طريق تنشيط إشارات WNT المتعارف عليها باستخدام مثبط GSK3 CHIR99021 ، يليه FGF9 / الهيبارين. من اليوم 0 إلى اليوم 4 ، تتوسع iPSCs بسرعة وتتخذ أشكالا معينية أو مثلثة. يصل التقاء 90٪ -100٪ ويتراكم بالتساوي حتى اليوم 7. عند ثقافة التعليق ، تشكل الركام تلقائيا هياكل النيفرون بعد الانفصال في الي.......

Discussion

تم وصف بروتوكول مفصل لتوليد عضويات الكلى من iPSCs ، بما في ذلك تعديلات طفيفة على الوسط القاعدي ، وكثافة الخلية الأولية ، وتركيز CHIR99021. في تجارب مختلفة ، تم العثور على العوامل الحاسمة لتوليد عضوي ناجح في الكلى لتكون التمايز الأولي للأديم المتوسط المتوسط (IM) وحالة الخلية في اليوم 7. علاوة على ذلك.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom	NEST	Cat #701003
Accutase	STEMCELL Technologies	Cat #o7920
Antibodies
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	Cat #100-51-6
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	Cat #120-51-4
Biological Safety Cabinet	Haier	Cat #HR40  A2
Biotin anti-human LTL (1:300)	Vector Laboratories	Cat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)	N/A	N/A
Carbon dioxide level shaker	HAMANY	Cat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)	STEMCELL Technologies	Cat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate	Corning	Cat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Corning	Cat #3471
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	Cat #07930
DAPI stain Solution	Coolaber	Cat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo SCIENTIFIC	Cat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-free	Servicebio	Cat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	Cat #ab150179
Donkey serum stoste	Meilunbio	Cat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)	Solarbio Life Science	Cat #D1040
Dry Bath Incubator	Shanghai Jingxin	Cat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Cat #370
Geltre LDEV-Free	Gibco	Cat #A1413202
Glass Bottom Culture Dishes	NEST	Cat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)	Santa Cruz Biotechnology	Cat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)	STEMCELL Technologies	Cat #07980
Human Recombinant FGF-9	STEMCELL Technologies	Cat #78161
Inverted Microscope	OLYMPUS	Cat #CKX53
Laser Scanning Confocal Microscope	OLYMPUS	Cat #FV3000
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	Cat #M7027
Micro Centrifuge	HENGNUO	Cat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)	BD Biosciences	Cat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)	BD Biosciences	Cat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)	Abcam	Cat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)	Thermo SCIENTIFIC	Cat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)	Sigma-Aldrich	Cat #81381
mTeSR1 5X Supplement	STEMCELL Technologies	Cat #85852
mTeSR1 Basal Medium	STEMCELL Technologies	Cat #85851
Nunc CryoTube Vials	Thermo SCIENTIFIC	Cat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)	Cell Signaling Technology	Cat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)	Sapphire Bioscience	Cat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)	Abcam	Cat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)	Abcam	Cat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)	Abcam	Cat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)	YEASEN	Cat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)	R&D Systems	Cat #AF4269
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	Cat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)	Gene Tex	Cat #GTX85902
Versene (1X)	Gibco	Cat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	Cat #72304