الحقن المجهري للفيروس القهقري RCAS (A) المؤتلف في عدسة الدجاج الجنينية

Summary

تصف ورقة البروتوكول هذه منهجية الحقن المجهري لعدسة الدجاج الجنينية لفيروس RCAS (A) كأداة لدراسة الوظيفة في الموقع والتعبير عن البروتينات أثناء نمو العدسة.

Abstract

الدجاج الجنيني (Gallus domesticus) هو نموذج حيواني راسخ لدراسة تطور العدسة وعلم وظائف الأعضاء ، نظرا لدرجة تشابهها العالية مع العدسة البشرية. RCAS (A) هو فيروس ارتجاعي دجاج مؤهل للتكاثر يصيب الخلايا المنقسمة ، والذي يعمل كأداة قوية لدراسة التعبير في الموقع ووظيفة البروتينات البرية والطافرة أثناء تطوير العدسة عن طريق الحقن المجهري في التجويف الفارغ لحويصلة العدسة في مراحل النمو المبكرة ، مما يقصر عمله على خلايا العدسة المتكاثرة المحيطة. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى ، مثل النماذج المعدلة وراثيا والثقافات خارج الجسم الحي ، فإن استخدام الفيروس القهقري للطيور RCAS (A) المختص بالتكرار يوفر نظاما فعالا للغاية وسريعا وقابلا للتخصيص للتعبير عن البروتينات الخارجية في أجنة الصيصان. على وجه التحديد ، يمكن أن يقتصر نقل الجينات المستهدف على خلايا ألياف العدسة التكاثرية دون الحاجة إلى محفزات خاصة بالأنسجة. في هذه المقالة ، سنلقي نظرة عامة موجزة على الخطوات اللازمة لإعداد RCAS (A) للفيروس القهقري المؤتلف ، ونقدم نظرة عامة مفصلة وشاملة على إجراء الحقن المجهري ، ونقدم نتائج عينة من التقنية.

Introduction

الهدف من هذا البروتوكول هو وصف منهجية الحقن المجهري لعدسة الدجاج الجنينية ل RCAS (A) (ساركوما الطيور / الفيروس القهقري A المختص بالتكرار). لقد ثبت أن التوصيل الفعال للفيروسات القهقرية في عدسة الدجاج الجنينية أداة واعدة للدراسة في الجسم الحي للآلية الجزيئية ووظيفة بنية بروتينات العدسة في فسيولوجيا العدسة الطبيعية والحالات المرضية والتطور. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا النموذج التجريبي لتحديد الأهداف العلاجية وفحص الأدوية لحالات مثل إعتام عدسة العين الخلقي البشري. إجمالا ، يهدف هذا البروتوكول إلى وضع الخطوات اللازمة لتطوير منصة قابلة للتخصيص لدراسة بروتينات العدسة.

الكتاكيت الجنينية (Gallus domesticus) ، بسبب تشابهها في ب....

Protocol

أجريت هذه الدراسة وفقا لقانون رعاية الحيوان واللوائح التنفيذية لرعاية الحيوان وفقا لمبادئ دليل رعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو. للحصول على نظرة عامة على البروتوكول ، انظر الشكل 1 ؛ انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

الشكل ....

النتائج

بعد تحديد بروتين (بروتينات) مستهدف محدد وتحديد تسلسل (تسلسلات) الجينات المرتبطة به ، يتضمن النهج التجريبي الشامل استنساخ تسلسل (تسلسلات) الجينات في ناقل RCAS (A) للفيروسات القهقرية عن طريق الاستنساخ الأولي إلى ناقل محول ، يليه ناقل فيروسي. ثانيا ، يتم تحضير الجسيمات الفيروسية عالية العيار باس.......

Discussion

يوفر هذا النموذج التجريبي الفرصة للتعبير عن البروتين (البروتينات) ذات الأهمية في العدسة السليمة مما يؤدي إلى دراسة الأهمية الوظيفية لهذه البروتينات في بنية العدسة ووظيفتها. يعتمد نموذج الحقن المجهري للفرخ الجنيني جزئيا على عمل Fekete et. ^al.6 وتم تطويره بواسطة Jiang et. ^al.8

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Filter	Corning	431118	For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture Dish	FisherScientific	50-202-030	For using during microinjection
Centrifuge	Fisherbrand	13-100-676	Spinning down solution
Constructs	GENEWIZ	-	For generation of constructs
Dissecting microscope	AmScope	SM-4TZ-144A	Visualization of lens for microinjection
DNA PCR primers	Integrated DNA Technologies	-	Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-204	Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-50WY	Lighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen		For cell culture
Egg Holder	-	-	Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg Incubator	GQF Manufacturing Company Inc.	1502	For incubation of fertilized eggs
Fast Green	Fisher scientific	F99-10	For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggs	Texas A&M University	N/A	Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone Laboratories		For cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-095-003	For anti-FLAG  1:500
Forceps	FisherScientific	22-327379	For moving things around and isolation
Glass capillaries	Sutter Instruments	B100-75-10	Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
Lipofectamine	Invitrogen	L3000001	For transfection
Manual vertical micropipette puller	Sutter Instruments	P-30	To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge Tubes	FisherScientific	02-682-004	Dissolving solution
Microscope	Keyence	BZ-X710	For imaging staining
Parafilm	FisherScientific	03-448-254	Placing solution
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen		For cell culture
Pico-Injector	Harvard Apparatus	PLI-100	For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0	Self generated	-	Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibody	Rockland Immunichemicals	600-401-383	For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-295-003	For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping pad	Sutter Instruments	BX10	For storage of glass micropipette