A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف ورقة البروتوكول هذه منهجية الحقن المجهري لعدسة الدجاج الجنينية لفيروس RCAS (A) كأداة لدراسة الوظيفة في الموقع والتعبير عن البروتينات أثناء نمو العدسة.

Abstract

الدجاج الجنيني (Gallus domesticus) هو نموذج حيواني راسخ لدراسة تطور العدسة وعلم وظائف الأعضاء ، نظرا لدرجة تشابهها العالية مع العدسة البشرية. RCAS (A) هو فيروس ارتجاعي دجاج مؤهل للتكاثر يصيب الخلايا المنقسمة ، والذي يعمل كأداة قوية لدراسة التعبير في الموقع ووظيفة البروتينات البرية والطافرة أثناء تطوير العدسة عن طريق الحقن المجهري في التجويف الفارغ لحويصلة العدسة في مراحل النمو المبكرة ، مما يقصر عمله على خلايا العدسة المتكاثرة المحيطة. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى ، مثل النماذج المعدلة وراثيا والثقافات خارج الجسم الحي ، فإن استخدام الفيروس القهقري للطيور RCAS (A) المختص بالتكرار يوفر نظاما فعالا للغاية وسريعا وقابلا للتخصيص للتعبير عن البروتينات الخارجية في أجنة الصيصان. على وجه التحديد ، يمكن أن يقتصر نقل الجينات المستهدف على خلايا ألياف العدسة التكاثرية دون الحاجة إلى محفزات خاصة بالأنسجة. في هذه المقالة ، سنلقي نظرة عامة موجزة على الخطوات اللازمة لإعداد RCAS (A) للفيروس القهقري المؤتلف ، ونقدم نظرة عامة مفصلة وشاملة على إجراء الحقن المجهري ، ونقدم نتائج عينة من التقنية.

Introduction

الهدف من هذا البروتوكول هو وصف منهجية الحقن المجهري لعدسة الدجاج الجنينية ل RCAS (A) (ساركوما الطيور / الفيروس القهقري A المختص بالتكرار). لقد ثبت أن التوصيل الفعال للفيروسات القهقرية في عدسة الدجاج الجنينية أداة واعدة للدراسة في الجسم الحي للآلية الجزيئية ووظيفة بنية بروتينات العدسة في فسيولوجيا العدسة الطبيعية والحالات المرضية والتطور. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا النموذج التجريبي لتحديد الأهداف العلاجية وفحص الأدوية لحالات مثل إعتام عدسة العين الخلقي البشري. إجمالا ، يهدف هذا البروتوكول إلى وضع الخطوات اللازمة لتطوير منصة قابلة للتخصيص لدراسة بروتينات العدسة.

الكتاكيت الجنينية (Gallus domesticus) ، بسبب تشابهها في ب....

Protocol

أجريت هذه الدراسة وفقا لقانون رعاية الحيوان واللوائح التنفيذية لرعاية الحيوان وفقا لمبادئ دليل رعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو. للحصول على نظرة عامة على البروتوكول ، انظر الشكل 1 ؛ انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

figure-protocol-550
الشكل ....

النتائج

بعد تحديد بروتين (بروتينات) مستهدف محدد وتحديد تسلسل (تسلسلات) الجينات المرتبطة به ، يتضمن النهج التجريبي الشامل استنساخ تسلسل (تسلسلات) الجينات في ناقل RCAS (A) للفيروسات القهقرية عن طريق الاستنساخ الأولي إلى ناقل محول ، يليه ناقل فيروسي. ثانيا ، يتم تحضير الجسيمات الفيروسية عالية العيار باس.......

Discussion

يوفر هذا النموذج التجريبي الفرصة للتعبير عن البروتين (البروتينات) ذات الأهمية في العدسة السليمة مما يؤدي إلى دراسة الأهمية الوظيفية لهذه البروتينات في بنية العدسة ووظيفتها. يعتمد نموذج الحقن المجهري للفرخ الجنيني جزئيا على عمل Fekete et. al.6 وتم تطويره بواسطة Jiang et. al.8

Disclosures

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH): RO1 EY012085 (إلى JXJ) و F32DK134051 (إلى F.M.A) ، ومنحة مؤسسة ويلش: AQ-1507 (إلى JXJ). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم إنشاء الأرقام جزئيا باستخدام Biorender.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm FilterCorning431118For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture DishFisherScientific50-202-030For using during microinjection
CentrifugeFisherbrand13-100-676Spinning down solution
ConstructsGENEWIZ-For generation of constructs
Dissecting microscopeAmScopeSM-4TZ-144AVisualization of lens for microinjection
DNA PCR primersIntegrated DNA Technologies-Generation of primers:

Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively

Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter InjectorDrummond Scientific3-000-204Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope IlluminatorAmScopeLED-50WYLighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)InvitrogenFor cell culture
Egg Holder--Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg IncubatorGQF Manufacturing Company Inc.1502For incubation of fertilized eggs
Fast GreenFisher scientificF99-10For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggsTexas A&M UniversityN/AAnimal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone LaboratoriesFor cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch115-095-003For anti-FLAG  1:500
ForcepsFisherScientific22-327379For moving things around and isolation
Glass capillariesSutter InstrumentsB100-75-10Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
LipofectamineInvitrogenL3000001For transfection
Manual vertical micropipette pullerSutter InstrumentsP-30To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge TubesFisherScientific02-682-004Dissolving solution
MicroscopeKeyenceBZ-X710For imaging staining
ParafilmFisherScientific03-448-254Placing solution
Penicillin/StreptomycinInvitrogenFor cell culture
Pico-InjectorHarvard ApparatusPLI-100For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0Self generated-Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibodyRockland Immunichemicals600-401-383For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch111-295-003For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping padSutter InstrumentsBX10For storage of glass micropipette

References

  1. Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).
  2. Chen, Y., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RCAS A

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved