A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول ويقارن طريقتين تمثيليتين للتمييز بين hiPSCs إلى خلايا انسجة اللحمة المتوسطة (MSCs). تتميز طريقة الطبقة الأحادية بتكلفة أقل وتشغيل أبسط وتمايز عظمي أسهل. تتميز طريقة الأجسام الجنينية (EBs) باستهلاك أقل للوقت.

Abstract

الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي خلايا جذعية بالغة متعددة القدرات تستخدم على نطاق واسع في الطب التجديدي. نظرا لأن MSCs المشتقة من الأنسجة الجسدية مقيدة بالتبرع المحدود واختلافات الجودة والسلامة البيولوجية ، فقد شهدت السنوات ال 10 الماضية ارتفاعا كبيرا في الجهود المبذولة لتوليد MSCs من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). تركزت الجهود السابقة والحديثة في تمايز hiPSCs إلى MSCs حول منهجيتين للاستزراع: (1) تكوين الأجسام الجنينية (EBs) و (2) استخدام الثقافة أحادية الطبقة. يصف هذا البروتوكول هاتين الطريقتين التمثيليتين في اشتقاق MSC من hiPSCs. تقدم كل طريقة مزاياها وعيوبها ، بما في ذلك الوقت والتكلفة والقدرة على تكاثر الخلايا والتعبير عن علامات MSC وقدرتها على التمايز في المختبر. يوضح هذا البروتوكول أن كلتا الطريقتين يمكن أن تشتق MSCs ناضجة ووظيفية من hiPSCs. تتميز طريقة الطبقة الأحادية بتكلفة أقل ، وتشغيل أبسط ، وتمايز عظمي أسهل ، بينما تتميز طريقة EB باستهلاك أقل للوقت.

Introduction

الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي خلايا جذعية بالغة متعددة القدرات مشتقة من الأديم المتوسط1. MSCs موجودة في جميع الأنسجة الضامة تقريبا2. منذ اكتشاف MSCs لأول مرة في سبعينيات القرن العشرين وعزلها بنجاح من نخاع العظام في عام 1987 من قبل Friedenstein et al.3،4،5 ، تم استخدام مجموعة متنوعة من الأنسجة الجسدية البشرية (بما في ذلك الجنين والبالغين) لعزل MSCs مثل العظام والغضاريف والأوتار والعضلات والأنسجة الدهنية ، والسدى الداعم للدم1،2،6

Protocol

1. صيانة hiPSCs

  1. ذوبان الجليد من hiPSC
    1. أخرج الخلايا من النيتروجين السائل وقم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. انقل خلايا الذوبان إلى أنبوب سعة 15 مل محضر ب 3 مل من وسط صيانة iPSC (جدول المواد). مزيج بلطف المتوسطة.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا برفق في 1 مل من وسط صيانة iPSC باستخدام 10 ميكرومتر Y-27632 (ماصة الخلايا لأعلى ولأسفل 2-3 مرات).
    3. انقل معلق الخلايا إلى صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار والمغلفة بهلام مصفوفة خارج الخلية مخفض عامل النمو (GFR) (1: 100) و 2 مل من وسط صيانة iPSC مع إضافة 10 مي....

النتائج

باتباع البروتوكول (الشكل 1 أ) ، تم تمييز hiPSCs إلى MSCs عبر تكوين EB وطرق الاستزراع أحادي الطبقة. أثناء التمايز ، أظهرت الخلايا مورفولوجيات تمثيلية مختلفة (الشكل 1B ، C).

كما هو موضح في الشكل 1B ، تعرض مستعمرات hiPSCs مورفولوجيا م.......

Discussion

في هذا البروتوكول ، تم فحص طريقتين تمثيليتين للتمييز بين hiPSCs إلى MSCs20،21،22،23،24،25،26،27،28،30. كانت كلتا الط?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نحن ممتنون للغاية لجميع أعضاء مختبر ماو وهيو ، في الماضي والحاضر ، على المناقشات الشيقة والمساهمات العظيمة في المشروع. نحن ممتنون للمركز الوطني للبحوث السريرية لصحة الطفل على الدعم الكبير. تم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (U20A20351 إلى جيانهوا ماو ، 82200784 إلى ليدان هو) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ الصينية (No. LQ22C070004 إلى ليدان هو).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alizarin red staining kitBeyotime BiotechnologyC0148S
Anti-human-CD105 (PE)Biolegend323206
Anti-human-CD34 (FITC)Biolegend343503
Anti-human-CD45 (APC)Biolegend304011
Anti-human-CD73( APC)Biolegend344006
Anti-human-CD90 (FITC)Biolegend328108
Ascorbic acidSolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
Carbon dioxide level shakerCrystalCO-06UC6
Compensation BeadsBioLegend424601
CryoStor CS10STEMCELL Technology07959
DexamethasoneBeyotime BiotechnologyST1254
DMEM/F12  mediumServicebioG4610
Fetal bovine serumHAKATAHS-FBS-500
FGF2Stemcell78003.1
GelatinSigma-AldrichG2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
human IgG1 isotype control APCBioLegend403505
human IgG1 isotype control FITCBioLegend403507
human IgG1 isotype control PEBioLegend403503
Human TGF-β1Stemcell78067
Human TruStain FcX BioLegend422301
IBMXBeyotime BiotechnologyST1398
IndomethacinSolarbioSI9020
InsulinBeyotime BiotechnologyP3376
iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technology85850
ITS Media SupplementBeyotime BiotechnologyC0341-10mL
Matrigel, growth factor reducedBD Corning354230
Oli Red O staining kitBeyotime BiotechnologyC0158S
ProlineSolarbioP0011
Sodium pyruvateThermoFisher11360-070
TGFβ3NovoproteinCJ44
Toluidine blue staining kitSolarbioG2543
TrypLE Express Enzyme(1x) Gibco12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well PlateCostar3471
VerseneGibco15040-66
Y-27632Stemcell72304
α-MEMHycloneSH30265
β-glycerophosphateSolarbioG8100

References

  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MSCs HiPSCs MSC MSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved