مقارنة بين طريقتين تمثيليتين لتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا إلى خلايا لحمية وسيطة

Summary

يصف هذا البروتوكول ويقارن طريقتين تمثيليتين للتمييز بين hiPSCs إلى خلايا انسجة اللحمة المتوسطة (MSCs). تتميز طريقة الطبقة الأحادية بتكلفة أقل وتشغيل أبسط وتمايز عظمي أسهل. تتميز طريقة الأجسام الجنينية (EBs) باستهلاك أقل للوقت.

Abstract

الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي خلايا جذعية بالغة متعددة القدرات تستخدم على نطاق واسع في الطب التجديدي. نظرا لأن MSCs المشتقة من الأنسجة الجسدية مقيدة بالتبرع المحدود واختلافات الجودة والسلامة البيولوجية ، فقد شهدت السنوات ال 10 الماضية ارتفاعا كبيرا في الجهود المبذولة لتوليد MSCs من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). تركزت الجهود السابقة والحديثة في تمايز hiPSCs إلى MSCs حول منهجيتين للاستزراع: (1) تكوين الأجسام الجنينية (EBs) و (2) استخدام الثقافة أحادية الطبقة. يصف هذا البروتوكول هاتين الطريقتين التمثيليتين في اشتقاق MSC من hiPSCs. تقدم كل طريقة مزاياها وعيوبها ، بما في ذلك الوقت والتكلفة والقدرة على تكاثر الخلايا والتعبير عن علامات MSC وقدرتها على التمايز في المختبر. يوضح هذا البروتوكول أن كلتا الطريقتين يمكن أن تشتق MSCs ناضجة ووظيفية من hiPSCs. تتميز طريقة الطبقة الأحادية بتكلفة أقل ، وتشغيل أبسط ، وتمايز عظمي أسهل ، بينما تتميز طريقة EB باستهلاك أقل للوقت.

Introduction

الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي خلايا جذعية بالغة متعددة القدرات مشتقة من الأديم المتوسط¹. MSCs موجودة في جميع الأنسجة الضامة تقريبا². منذ اكتشاف MSCs لأول مرة في سبعينيات القرن العشرين وعزلها بنجاح من نخاع العظام في عام 1987 من قبل Friedenstein et ^al.3،4،5 ، تم استخدام مجموعة متنوعة من الأنسجة الجسدية البشرية (بما في ذلك الجنين والبالغين) لعزل MSCs مثل العظام والغضاريف والأوتار والعضلات والأنسجة الدهنية ، والسدى الداعم للدم^1،2،6

Protocol

1. صيانة hiPSCs

1. ذوبان الجليد من hiPSC
   1. أخرج الخلايا من النيتروجين السائل وقم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. انقل خلايا الذوبان إلى أنبوب سعة 15 مل محضر ب 3 مل من وسط صيانة iPSC (جدول المواد). مزيج بلطف المتوسطة.
   2. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا برفق في 1 مل من وسط صيانة iPSC باستخدام 10 ميكرومتر Y-27632 (ماصة الخلايا لأعلى ولأسفل 2-3 مرات).
   3. انقل معلق الخلايا إلى صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار والمغلفة بهلام مصفوفة خارج الخلية مخفض عامل النمو (GFR) (1: 100) و 2 مل من وسط صيانة iPSC مع إضافة 10 مي....

النتائج

باتباع البروتوكول (الشكل 1 أ) ، تم تمييز hiPSCs إلى MSCs عبر تكوين EB وطرق الاستزراع أحادي الطبقة. أثناء التمايز ، أظهرت الخلايا مورفولوجيات تمثيلية مختلفة (الشكل 1B ، C).

كما هو موضح في الشكل 1B ، تعرض مستعمرات hiPSCs مورفولوجيا م.......

Discussion

في هذا البروتوكول ، تم فحص طريقتين تمثيليتين للتمييز بين hiPSCs إلى MSCs^{20،21،22،23،24،25،26،27،28،30}. كانت كلتا الط?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red staining kit	Beyotime Biotechnology	C0148S
Anti-human-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-human-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-human-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-human-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-human-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Ascorbic acid	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Carbon dioxide level shaker	Crystal	CO-06UC6
Compensation Beads	BioLegend	424601
CryoStor CS10	STEMCELL Technology	07959
Dexamethasone	Beyotime Biotechnology	ST1254
DMEM/F12  medium	Servicebio	G4610
Fetal bovine serum	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
human IgG1 isotype control APC	BioLegend	403505
human IgG1 isotype control FITC	BioLegend	403507
human IgG1 isotype control PE	BioLegend	403503
Human TGF-β1	Stemcell	78067
Human TruStain FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime Biotechnology	ST1398
Indomethacin	Solarbio	SI9020
Insulin	Beyotime Biotechnology	P3376
iPSC maintenance medium	STEMCELL Technology	85850
ITS Media Supplement	Beyotime Biotechnology	C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced	BD Corning	354230
Oli Red O staining kit	Beyotime Biotechnology	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Sodium pyruvate	ThermoFisher	11360-070
TGFβ3	Novoprotein	CJ44
Toluidine blue staining kit	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)	Gibco	12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-glycerophosphate	Solarbio	G8100