A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يمكن استخدام خلايا الدم أحادية النواة المحيطية المعزولة لتحليل وظائف واضطرابات المناعة أو أمراض التمثيل الغذائي أو وظائف الميتوكوندريا. في هذا العمل ، وصفنا طريقة موحدة لإعداد PBMCs من الدم الكامل والحفظ بالتبريد اللاحق. الحفظ بالتبريد يجعل هذا الوقت والمكان مستقلين.

Abstract

تعتمد الوظائف الفسيولوجية للخلايا حقيقية النواة على الطاقة التي توفرها الميتوكوندريا بشكل أساسي. يرتبط ضعف الميتوكوندريا بأمراض التمثيل الغذائي والشيخوخة. تلعب الفسفرة التأكسدية دورا حاسما؛ لأنها ضرورية للحفاظ على الاتزان الداخلي النشط. تم تحديد PBMCs كعينة طفيفة التوغل لقياس وظيفة الميتوكوندريا وقد ثبت أنها تعكس ظروف المرض. ومع ذلك ، يمكن أن يكون قياس وظيفة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا محدودا بعدة عوامل في العينات البشرية. القيود هي كمية العينات المأخوذة ، ووقت أخذ العينات ، والذي غالبا ما ينتشر على مدى عدة أيام ، والمواقع. يمكن أن يضمن الحفظ بالتبريد للعينات المجمعة جمع العينات وقياسها بشكل متسق. يجب توخي الحذر للتأكد من أن المعلمات المقاسة قابلة للمقارنة بين الخلايا المحفوظة بالتبريد والخلايا المحضرة حديثا. هنا ، نصف طرق عزل وحفظ PBMCs بالتبريد من عينات الدم البشري لتحليل وظيفة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في هذه الخلايا. يظهر PBMC المحفوظ بالتبريد وفقا للبروتوكول الموصوف هنا اختلافات طفيفة فقط في عدد الخلايا وصلاحيتها ، ومستويات أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، ونشاط السلسلة التنفسية المقاسة مقارنة بالخلايا التي تم حصادها حديثا. هناك حاجة فقط إلى 8-24 مل من دم الإنسان للمستحضرات الموصوفة ، مما يجعل من الممكن جمع العينات أثناء الدراسات السريرية متعددة المراكز وتحديد الطاقة الحيوية في الموقع.

Introduction

تستخدم خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية (PBMCs) في تطبيقات مختلفة في العديد من المجالات العلمية ، بما في ذلك دراسة القضايا المناعية والطاقة الحيوية ، مثل تلك المتعلقة بعمليات الشيخوخة أو الأمراض التنكسية 1,2. PBMCs غير متجانسة في التركيب وتتكون من الخلايا الليمفاوية (الخلايا البائية والخلايا التائية والخلايا القاتلة الطبيعية) والوحيدات والخلايا المتغصنة. تظهر الخلايا أحيانا اختلافات واختلافات فردية كبيرة داخل الموضوع ، لذلك يلزم اتخاذ إجراءات موحدة للتعامل مع هذه الخلايا. المعلمات الهامة مثل صلاحية ونقاء العزلة هي المتطلبات الأساسية للتعامل معها وتتأثر بالإضافة إلى ذلك بالعوامل البيئية مثل وقت الجمع ،....

Protocol

تمت مراجعة جميع البروتوكولات الموضحة في هذه المخطوطة لجمع الدم وعزله وتحليله والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة غيسن بألمانيا. تم الحصول على موافقة المرضى على تضمين عيناتهم في الدراسة. يتم تنفيذ جميع خطوات العزل وزراعة الخلايا تحت خزانة السلامة البيولوجية.

1. بزل الوريد

  1. قم بإعداد جميع المعدات اللازمة لجمع الدم بما في ذلك رذاذ التطهير ، والمسحة المعقمة ، وقنية جمع الدم مع أنبوب 80 مم ومحول متعدد ، وعاصبة / سوار ضغط الدم ، و Monovette 9 مل ليثيوم هيبارين.
    ملاحظة: EDTA كمضاد للتخثر فعال أيضا.
  2. جمع الدم من وريد الذراع الأنسب، وعادة ما يكون الوريد الوسطي أو الوريد الرأسي.
  3. ضع سو....

النتائج

صلاحية الخلية وعددها
لتحقيق العزل الناجح والحفظ بالتبريد ، يجب أن يكون عدد الخلايا وصلاحيتها عالية قدر الإمكان. قبل وبعد الحفظ بالتبريد ، يتم عد الخلايا ، ويتم تحديد صلاحيتها لضمان صحة وجودة الخلايا. الشكل 3 هو توضيح تمثيلي ل PBMCs قبل وبعد الحفظ بالتبريد ، بالكاد ?.......

Discussion

يوفر هذا البروتوكول وسيلة لعزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) وحفظها بالتبريد من دم الإنسان بطريقة مناسبة لتحليلات الطاقة الحيوية. توفر الطريقة الموصوفة إمكانية عزل PBMCs بلطف وبكميات كبيرة ، مع قابلية عالية للبقاء وخلايا كافية لقياسات الطاقة الحيوية. من عيوبه أنه حتى مع الحد الأدن.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر الفريق السريري في مستشفى جامعة غيسن ماربورغ على جمع الدم. تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة جوستوس ليبيغ.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0)Self-prepared-
0.5 M Triethanolamine-HCl-BufferSelf-prepared-
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1)Self-prepared-
1.01 mM DTBBSelf-prepared-
10 % Triton X-100Self-prepared-
10 mM OxalacetatSelf-prepared-
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-MultiflySarstedt156353_v
37% HClCarl Roth GmbH & Co. KG-
70% Ethanol (EtOH)Self-prepared-
Acetyl-CoAPancreac ApplichemA3753
ADPSigma-AldrichA5285
Alcohol wipes (70% isopropyl alcohol)
Antimycin ASigma-AldrichA8674
Aqua (bidest.)With MilliQ Academic (self-made)-
AscorbateSigma-AldrichA4034
ATP-StandardSigma-Aldrich6016949
Biocoll Seperating SolutionBiochrom6115
Biological safty cabinet MSC AdvantageThermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Cell counter TC20 Automated Cell CounterBio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 RThermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counterBio-Rad1450016
Cryotube Cryo.SGrainer Bio-One126263-2DG
DigitoninSigma-Aldrich37008
Dimethylsulfoxid (DMSO)Merck102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTipsGilsonF164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x)Gibco (Thermo Scientific)15217168
Ethanol (EtOH 100%)Carl ROTH GmbH & Co. KG9065.3
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF9665
Frezer (-80°C)Thermo Fisher Scientific Inc.
GlutamateSigma-AldrichG1626
Holder/adapter 
Incubator Midi 40 CO2Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringeHamilton
MalateSigma-AldrichM-1000
MIR05Self-prepared-
Mr. Frosty Freezing ContainerThermo Fisher Scientific Inc.10110051
Multireader CLARIOstarBMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plusThermo Fisher Scientific Inc.
OligomycinSigma-AldrichO4876
OxalacetateSigma-Aldrich-
Oxygraph-2kOrobororus Instruments
Penicillin-StreptomycinPAA15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μLVWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)Gibco (Thermo Scientific)11530586
RotenoneSigma-AldrichR8875
SaccharoseCarl ROTH GmbH & Co. KG9286.2
Sodium azideSigma-AldrichS2002
SuccinateSigma-AldrichS2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD)Sigma-AldrichT3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methaneSigma-Aldrich108382
Triton X-100Sigma-Aldrich108643
TrypanblauBiochromT6146
Vacuum pumpVaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96Perkin Elmer6005181
Water bath WNB22Memmert GmbH & Co. KG

References

  1. Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
  2. Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PBMCs PBMCs PBMCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved