A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يمكن استخدام خلايا الدم أحادية النواة المحيطية المعزولة لتحليل وظائف واضطرابات المناعة أو أمراض التمثيل الغذائي أو وظائف الميتوكوندريا. في هذا العمل ، وصفنا طريقة موحدة لإعداد PBMCs من الدم الكامل والحفظ بالتبريد اللاحق. الحفظ بالتبريد يجعل هذا الوقت والمكان مستقلين.
تعتمد الوظائف الفسيولوجية للخلايا حقيقية النواة على الطاقة التي توفرها الميتوكوندريا بشكل أساسي. يرتبط ضعف الميتوكوندريا بأمراض التمثيل الغذائي والشيخوخة. تلعب الفسفرة التأكسدية دورا حاسما؛ لأنها ضرورية للحفاظ على الاتزان الداخلي النشط. تم تحديد PBMCs كعينة طفيفة التوغل لقياس وظيفة الميتوكوندريا وقد ثبت أنها تعكس ظروف المرض. ومع ذلك ، يمكن أن يكون قياس وظيفة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا محدودا بعدة عوامل في العينات البشرية. القيود هي كمية العينات المأخوذة ، ووقت أخذ العينات ، والذي غالبا ما ينتشر على مدى عدة أيام ، والمواقع. يمكن أن يضمن الحفظ بالتبريد للعينات المجمعة جمع العينات وقياسها بشكل متسق. يجب توخي الحذر للتأكد من أن المعلمات المقاسة قابلة للمقارنة بين الخلايا المحفوظة بالتبريد والخلايا المحضرة حديثا. هنا ، نصف طرق عزل وحفظ PBMCs بالتبريد من عينات الدم البشري لتحليل وظيفة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في هذه الخلايا. يظهر PBMC المحفوظ بالتبريد وفقا للبروتوكول الموصوف هنا اختلافات طفيفة فقط في عدد الخلايا وصلاحيتها ، ومستويات أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، ونشاط السلسلة التنفسية المقاسة مقارنة بالخلايا التي تم حصادها حديثا. هناك حاجة فقط إلى 8-24 مل من دم الإنسان للمستحضرات الموصوفة ، مما يجعل من الممكن جمع العينات أثناء الدراسات السريرية متعددة المراكز وتحديد الطاقة الحيوية في الموقع.
تستخدم خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية (PBMCs) في تطبيقات مختلفة في العديد من المجالات العلمية ، بما في ذلك دراسة القضايا المناعية والطاقة الحيوية ، مثل تلك المتعلقة بعمليات الشيخوخة أو الأمراض التنكسية 1,2. PBMCs غير متجانسة في التركيب وتتكون من الخلايا الليمفاوية (الخلايا البائية والخلايا التائية والخلايا القاتلة الطبيعية) والوحيدات والخلايا المتغصنة. تظهر الخلايا أحيانا اختلافات واختلافات فردية كبيرة داخل الموضوع ، لذلك يلزم اتخاذ إجراءات موحدة للتعامل مع هذه الخلايا. المعلمات الهامة مثل صلاحية ونقاء العزلة هي المتطلبات الأساسية للتعامل معها وتتأثر بالإضافة إلى ذلك بالعوامل البيئية مثل وقت الجمع ،....
تمت مراجعة جميع البروتوكولات الموضحة في هذه المخطوطة لجمع الدم وعزله وتحليله والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة غيسن بألمانيا. تم الحصول على موافقة المرضى على تضمين عيناتهم في الدراسة. يتم تنفيذ جميع خطوات العزل وزراعة الخلايا تحت خزانة السلامة البيولوجية.
1. بزل الوريد
صلاحية الخلية وعددها
لتحقيق العزل الناجح والحفظ بالتبريد ، يجب أن يكون عدد الخلايا وصلاحيتها عالية قدر الإمكان. قبل وبعد الحفظ بالتبريد ، يتم عد الخلايا ، ويتم تحديد صلاحيتها لضمان صحة وجودة الخلايا. الشكل 3 هو توضيح تمثيلي ل PBMCs قبل وبعد الحفظ بالتبريد ، بالكاد ?.......
يوفر هذا البروتوكول وسيلة لعزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) وحفظها بالتبريد من دم الإنسان بطريقة مناسبة لتحليلات الطاقة الحيوية. توفر الطريقة الموصوفة إمكانية عزل PBMCs بلطف وبكميات كبيرة ، مع قابلية عالية للبقاء وخلايا كافية لقياسات الطاقة الحيوية. من عيوبه أنه حتى مع الحد الأدن.......
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
نود أن نشكر الفريق السريري في مستشفى جامعة غيسن ماربورغ على جمع الدم. تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة جوستوس ليبيغ.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | - | |
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | - | |
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | - | |
1.01 mM DTBB | Self-prepared | - | |
10 % Triton X-100 | Self-prepared | - | |
10 mM Oxalacetat | Self-prepared | - | |
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | - | |
70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | - | |
Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | - | |
Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
Disinfection spray | |||
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Holder/adapter | |||
Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Injection syringe | Hamilton | ||
Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
MIR05 | Self-prepared | - | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
Oxalacetate | Sigma-Aldrich | - | |
Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved