تطبيق تلطيخ الميتوكوندريا الحية في فرز الخلايا لتنقية خلايا الكبد المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

Summary

يمكن تنقية خلايا الكبد المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات من خلال فرز الخلايا ، باستخدام مزيج من تلطيخ الميتوكوندريا وجزيء التصاق خلايا الكريات البيض المنشط (ALCAM ، المعروف أيضا باسم CD166).

Abstract

الجذع الجنيني البشري (ES) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) لها تطبيقات محتملة في الطب التجديدي القائم على الخلايا لعلاج الأعضاء المريضة بشدة بسبب تكاثرها غير المحدود وخصائصها متعددة القدرات. ومع ذلك ، فإن التمييز بين الخلايا الجذعية الجنينية / الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية إلى أنواع خلايا مستهدفة نقية بنسبة 100٪ يمثل تحديا بسبب حساسيتها العالية للبيئة. يحدث تكوين الورم بعد الزرع بسبب الخلايا الملوثة والمكاثرة وغير المتمايزة ، مما يجعل تقنية التنقية العالية ضرورية لتحقيق آمن للطب التجديدي. للتخفيف من خطر تكوين الأورام، تم تطوير تقنية عالية التنقية لخلايا الكبد البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. تستخدم الطريقة FACS (فرز الخلايا المنشط بالتألق) باستخدام مزيج من المحتوى العالي للميتوكوندريا وعلامة سطح الخلية ALCAM (جزيء التصاق خلايا الكريات البيض المنشط) دون تعديل وراثي. 97٪ ± 0.38٪ (ن = 5) من خلايا الكبد المنقاة باستخدام هذه الطريقة أظهرت تعبيرا عن بروتين الألبومين. تهدف هذه المقالة إلى توفير إجراءات مفصلة لهذه الطريقة ، كما هو مطبق على أحدث طريقة تمايز ثنائية الأبعاد لخلايا iPS البشرية إلى خلايا الكبد.

Introduction

تعتبر الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة متعددة القدرات (ES و iPS ، على التوالي) مصادر خلايا واعدة للعلاجات التجديدية. ومع ذلك ، يمكن أن تختلف كفاءة تمييز هذه الخلايا إلى أنواع محددة من الخلايا المستهدفة ، حتى عند استخدام نفس خط الخلية والبروتوكول والمجرب^1،2،3،4. يمكن أن يعزى هذا التباين إلى الحساسية العالية لخلايا ES / iPS البشرية لبيئتها. لذلك ، من الصعب حاليا الحصول على خلايا مستهدفة نقية باستمرار. لتحقيق الطب التجديدي الآمن للغاية ، من الأهمية بمكان القضاء على الخلايا التكاثرية والخلايا الجذعية غير المتمايزة في الخلايا العلاجية ، وتكنولو....

Protocol

استخدمت هذه الدراسة خلايا iPS البشرية التي تم الحصول عليها تجاريا (سلالة 253G1) (انظر جدول المواد).

1. صيانة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية

1. الحفاظ على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية في ظروف خالية من التغذية في وسط AK02 على أطباق الاستزراع المغلفة ب 0.25 ميكروغرام / سم² iMatrix-511 (انظر جدول المواد).

2. التمايز الكبدي للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية في الثقافات ثنائية الأبعاد

ملاحظة: راجع الشكل 1 أ لمعرفة الجدول الي....

النتائج

يوضح الجدول الزمني للعمليات التي تحفز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية على التمايز إلى خلايا كبدية من خلال ثقافة ثنائية الأبعاد (الشكل 1 أ) وخصائص الخلية التمثيلية (الشكل 1 ب). تقريبا في يوم التمايز 12 ، بدأت الخلايا في إظهار أشكال الخلايا متعد.......

Discussion

نظرا لوظائفها في استقلاب المغذيات وإزالة السموم ، تمتلك خلايا الكبد عددا كبيرا نسبيا من الميتوكوندريا مقارنة بأنواع الخلايا^{الأخرى 15}. ALCAM هو عضو في عائلة الغلوبولين المناعي الفائقة ويلعب دورا في التصاق الخلايا والهجرة. يتم التعبير عنها في أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
253G1 human iPS cell line	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporin A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Collagenase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	ROCK inhibitor
Dexamethasone	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Fetal Bovine Serum	Biowest	51820-500
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody	R&D Systems	AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 silk	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Blocking solution
ITS-G Supplement(×100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin	Dako	A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
Sodium L-Ascorbate	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypan Blue Solution	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
Tryptose phosphate broth solution	Sigma-Aldrich	T8159