تطوير وتحسين نموذج عضوي مشتق من سرطان الخلايا الكبدية البشرية لتحديد الهدف المحتمل واكتشاف الأدوية

Summary

نحن نقدم نظرة عامة شاملة وصقل البروتوكولات الحالية لتشكيل سرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، والتي تشمل جميع مراحل زراعة الأعضاء العضوية. ويعمل هذا النظام كنموذج قيم لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة وتقييم فعالية الأدوية المرشحة.

Abstract

سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو ورم منتشر ومميت للغاية في جميع أنحاء العالم ، واكتشافه المتأخر وعدم وجود عوامل علاجية محددة فعالة يستلزم مزيدا من البحث في التسبب في المرض والعلاج. حظيت الكائنات العضوية ، وهي نموذج جديد يشبه إلى حد كبير أنسجة الورم الأصلية ويمكن زراعتها في المختبر ، باهتمام كبير في السنوات الأخيرة ، مع العديد من التقارير حول تطوير نماذج عضوية لسرطان الكبد. في هذه الدراسة ، نجحنا في تحسين الإجراء وإنشاء بروتوكول استزراع يتيح تكوين عضويات HCC أكبر حجما مع ظروف مرور وثقافة مستقرة. لقد حددنا بشكل شامل كل خطوة من خطوات الإجراء ، والتي تغطي العملية الكاملة لتفكك أنسجة سرطان الكبد ، والطلاء العضوي ، والثقافة ، والمرور ، والحفظ بالتبريد ، والإنعاش ، وقدمنا احتياطات مفصلة في هذه الورقة. تظهر هذه الكائنات العضوية تشابها وراثيا مع أنسجة سرطان الكبد الأصلية ويمكن استخدامها في تطبيقات متنوعة ، بما في ذلك تحديد الأهداف العلاجية المحتملة للأورام وتطوير الأدوية اللاحقة.

Introduction

حظي سرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، وهو ورم منتشر ومتنوع على نطاق واسع¹ ، باهتمام كبير داخل المجتمع الطبي. يشير وجود لدونة النسب وعدم التجانس الكبير في سرطان الكبد إلى أن الخلايا السرطانية التي تنشأ من مرضى مختلفين وحتى آفات مميزة داخل نفس المريض قد تظهر سمات جزيئية ومظهرية مختلفة ، مما يمثل عقبات هائلة في تقدم الأساليب العلاجية المبتكرة^2،3،4،5. وبالتالي، هناك حاجة ملحة إلى تعزيز فهم الخصائص والآليات البيولوجية لمقاومة الأدوية في سرطان الكبد للاسترشاد بها في صياغة استراتيجيات علاجية أكثر فعالية.

Protocol

تم الحصول على أنسجة خزعة بشرية من المريض المعني في مستشفى السرطان التابع ومعهد جامعة قوانغتشو الطبية ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إنشاء عضويات سرطان الكبد المشتقة من المريض من العينات الجراحية

ملاحظة: يشمل إنشاء عضويات سرطان الكبد مراحل مختلفة ، وهي تفكك الأنسجة ، والطلاء العضوي ، والثقافة ، والمرور ، والحفظ بالتبريد ، والإنعاش. تتطلب عملية تفكك الأنسجة مدة 2 ساعة ، بينما يستغرق بذر المواد العضوية على طبق حوالي 40 دقيقة. بعد ذلك ، يخضع الجيل الأولي من عضويات سرطان الكب....

النتائج

عند تنفيذ الإجراء المذكور أعلاه ، يمكن ملاحظة ظهور كرويات عضوية HCC عادة في غضون 3 أيام (الشكل 1). يوضح الشكل 1 أ ، ب عضوي HCC الثابت ، والذي يطور على الفور كرويات مدمجة تتميز بحواف مستديرة وسيتوسول نافذ في اليوم الأول من التأسيس. أثناء نمو عضويات سرطان ا?.......

Discussion

تكمن إحدى الفوائد الملحوظة للنماذج العضوية المشتقة من المريض في قدرتها على تكرار الخصائص البيولوجية للأورام بأمانة ، بما في ذلك بنية الأنسجة والمشهد الجينومي. تظهر هذه النماذج مستوى ملحوظا من الدقة وتعكس بشكل فعال عدم تجانس الأورام وتطورها ، حتى على مدى فترات طويلة من الزراعة⁶

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines