إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لتصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي في ذبابة الفاكهة البالغة التي تعبر عن GCaMP6 لمراقبة أنشطة الصرع. يوفر البروتوكول أداة قيمة للتحقيق في أحداث ictal في ذبابة الفاكهة للبالغين من خلال تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي ، مما يسمح باستكشاف الآليات المحتملة للصرع على المستويات الخلوية.

Abstract

الصرع هو اضطراب عصبي يتميز بنوبات متكررة ، ترتبط جزئيا بالأصل الجيني ، وتؤثر على أكثر من 70 مليون فرد في جميع أنحاء العالم. على الرغم من الأهمية السريرية للصرع ، لا يزال يتعين تطوير التحليل الوظيفي للنشاط العصبي في الجهاز العصبي المركزي. أحدثت التطورات الحديثة في تكنولوجيا التصوير ، جنبا إلى جنب مع التعبير المستقر لمؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا ، مثل GCaMP6 ، ثورة في دراسة الصرع على مستوى الدماغ ومستويات دقة الخلية الواحدة. برزت ذبابة الفاكهة الميلانية كأداة للتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء الصرع بسبب علم الوراثة الجزيئي المتطور والمقايسات السلوكية. في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا جديدا وفعالا لتصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي في ذبابة الفاكهة البالغة التي تعبر عن GCaMP6 لمراقبة أنشطة الصرع. يتم تحضير الدماغ كله من CAC ، وهو جين صرع معروف ، يطير ضربة قاضية لتصوير الكالسيوم باستخدام مجهر متحد البؤر لتحديد النشاط العصبي كمتابعة لفحص السلوك الشبيه بالنوبات الحساسة للانفجار. أظهر ذباب ضربة قاضية CAC معدلا أعلى من السلوك الشبيه بالنوبات وأنشطة الكالسيوم غير الطبيعية ، بما في ذلك المزيد من المسامير الكبيرة وعدد أقل من المسامير الصغيرة مقارنة بالذباب البري. ارتبطت أنشطة الكالسيوم بالسلوك الشبيه بالنوبات. تعمل هذه المنهجية كمنهجية فعالة في فحص الجينات المسببة للأمراض للصرع واستكشاف الآلية المحتملة للصرع على المستوى الخلوي.

Introduction

الصرع ، وهو اضطراب عصبي مزمن معقد يتميز بتكرار النوبات التلقائية وغير المبررة ونشاط الشبكة العصبية الشاذ ، أثر على أكثر من 70 مليون فرد في جميع أنحاء العالم ، مما يجعله أحد أكثر الأمراض العصبية شيوعا¹ ويؤدي إلى أعباء ثقيلة على الأسر والمجتمع. بالنظر إلى تأثير الصرع ، أجريت العديد من الدراسات لتحديد مسببات النوبات ، والتي تمت الموافقة على علم الوراثة كسبب رئيسي للعديد من أنواع الصرع أو متلازمات الصرع². على مدى العقود الماضية ، أدى التقدم في التقنيات الجينومية إلى زيادة سريعة في اكتشاف الجينات الجديدة المرتبطة بالصرع ، والتي تلعب دورا حاسما في حدوث النوبات ، بما في ذلك القنوات الأيونية وجينات القناة غير الأيونية

Protocol

1. بروتوكول للمقايسة الحساسة للانفجار

1. إنشاء الذباب التجريبي عن طريق عبور خط سائق الحوض Gal4 مع خط UAS-cac-RNAi عبر نظام Gal4 / UAS²¹. اجمع الذباب البكر لخط الحوض Gal4 والذباب الذكور لخط UAS-cac-RNAi . ثم انقل الذباب البكر والذكور إلى نفس القارورة لحصاد النسل.
   ملاحظة: سيسمح خط تشغيل tub-Gal4 بتحقيق ضربة قاضية عالمية لجين CAC . استخدم خط UAS-cac-RNAi كمجموعة تحكم.
2. بعد 3-5 أيام من الانسداد ، قم بتخدير الذباب برفق باستخدام 100٪ CO₂ (معدات التخدير_{CO 2} ) وجمع كل من ذباب الحوض Gal4 > UAS-cac-RNAi وذباب UAS-cac-RNAi<....

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول ، وجدنا أن ذباب ضربة قاضية من الصبار أظهر معدلات أعلى بكثير من السلوك الشبيه بالنوبات من ذباب WT (17.00 ± 2.99 [n = 6] مقابل 4.50 ± 2.03 [n = 6] ؛ ف = 0.0061 ؛ اختبار t للطالب ، الشكل 1 أ). تعافى معظم ذباب الحوض Gal4 > UAS-cac-RNAi في غضون 1-5 ثوان ، بينما تعافى.......

Discussion

يعمل أيون الكالسيوم كرسول ثان حاسم ، حيث يلعب دورا محوريا في مجموعة من الاستجابات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية لكل من الاضطرابات الكيميائية والكهربائية. علاوة على ذلك ، تم تحديد العنصر الطوبولوجي لقنوات P / Q قبل المشبكي ، المشفرة بواسطة جين CACNA1A البشري ، على أنها مسؤولة عن التوس.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brushes	Panera	AAhc022-2	for handling flies
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C4901
Confocal microscope	SP8; Zeiss, Jena, Germany.	N/A	for calcium imaging
CO2 anesthesia machine	N/A	N/A	for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder	N/A	N/A	handmade, for mounting the brain
Culture vials	Biologix	51-0500	2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	version: 2.14.0	for analysis
Fly morgue	N/A	N/A	handmade, for handling flies
Fly stocks	cac-RNAi	27244	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	GCaMP6m	42750	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	tub-Gal4	N/A	from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
High-resolution camera	N/A	N/A	for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028
Papain suspension	Worthington Biochemical	LS003126
Petri dishes	Sigma-Aldrich	SLW1480/02D	for dissection
Pipette	Thermo Scientific	4640010, 4640030, 4640050, 4640060	for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P4504
Recording dish	Thermo Scientific	150682- Glass Based Dish	for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S8282
Stereo-binocular microscope	SHANG GUANG	XTZ-D	for handling flies and dissection
Syringe needles	pythonbio	HCL0693	for dissection
Tripod	WEIFENG	45634732523	for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer	Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich	Z653438	for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard	N/A	N/A	handmade, foam pad or paper for background