التشريح المجهري وتلطيخ التألق المناعي لأكمام عضلة القلب في الأوردة الرئوية للفئران

Summary

يوضح هذا البروتوكول العزل الموجه بالفحص المجهري وتلطيخ الأوردة الرئوية للفئران. نقوم بإعداد عينات الأنسجة التي تحتوي على الأذين الأيسر والأوردة الرئوية والرئتين المقابلة وتلطيخها لقلب Troponin T و Connexin 43.

Abstract

الأوردة الرئوية (PVs) هي المصدر الرئيسي للضربات خارج الرحم في عدم انتظام ضربات القلب الأذيني وتلعب دورا حاسما في تطور وتطور الرجفان الأذيني (AF). تحتوي PVs على أكمام عضلة القلب (MS) المكونة من خلايا عضلة القلب. يتورط مرض التصلب العصبي المتعدد في بدء وصيانة الرجفان الأذيني ، حيث يحافظ على أوجه التشابه مع عضلة القلب العاملة في القلب ، بما في ذلك القدرة على توليد نبضات كهربائية خارج الرحم. تستخدم القوارض على نطاق واسع وقد تمثل نماذج حيوانية ممتازة لدراسة عضلة القلب الوريدية الرئوية لأن خلايا عضلة القلب موجودة على نطاق واسع في جميع أنحاء جدار الوعاء الدموي. ومع ذلك ، فإن التشريح الدقيق وإعداد PVs الفئران يمثل تحديا بسبب صغر حجم العضو والتشريح المعقد.

نعرض بروتوكول تشريح مجهري موجه بالمجهر لعزل الأذين الأيسر للفأر (LA) مع PVs. يتم إجراء تلطيخ التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة Troponin-T القلبية (cTNT) و connexin 43 (Cx43) لتصور LA و PVs بالطول الكامل. يوفر التصوير عند التكبير 10x و 40x رؤية شاملة للهيكل الكهروضوئي بالإضافة إلى رؤى مفصلة حول بنية عضلة القلب ، ولا سيما تسليط الضوء على وجود connexin 43 داخل MS.

Introduction

الرجفان الأذيني (AF) هو عدم انتظام ضربات القلب المستمر الأكثر شيوعا¹. يتزايد انتشار الرجفان الأذيني بشكل أكبر مع عدد متوقع من ~ 17.9 مليون مريض في أوروبا في عام 2060¹. الرجفان الأذيني مهم للغاية سريريا لأنه عامل خطر أساسي لتطور احتشاء عضلة القلب أو قصور القلب أو السكتة الدماغية ، مما يؤدي إلى عبء فردي واجتماعي واجتماعي واقتصادي هائل¹. على الرغم من أن الرجفان الأذيني معروف منذ عقود ، إلا أن الفيزيولوجيا المرضية للرجفان الأذيني لا تزال غير مفهومة تماما².

بالفعل في أواخر تسعينيات القرن العشرين ، أظهرت الدراسات التأثير الكبير للأوردة الرئوية (PVs) في....

Protocol

تم إجراء رعاية وجميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية والأخلاقيات بجامعة لودفيغ ماكسيميليان في ميونيخ ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات باستخدام الفئران من قبل Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215 ، ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46 ، ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86 ، ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178 ، ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). تم الحصول على الفئران C57BL6 / N تجاريا.

1. التحضير

1. تحضير هلام الأغاروز 3 ٪ عن طريق خلط 3 ملغ من الأغاروز و 100 مل من 1x محلول ملحي مخزن تريس في قارورة Erlenmeyer 500 مل. سخني المحلول في الميكروويف على حرارة 600 واط لمدة 2-3 دقائق حتى يصبح الجل متجانسا.
....

النتائج

أجرينا التشريح المجهري ، وتلطيخ ، وتصوير PVs في 10 فئران عمرها 12-16 أسبوعا. باتباع البروتوكول ، نجحنا في تشريح PVs مع LA في جميع فئران التجارب وحصلنا على أقسام مع رؤية شاملة لل PVs في ثمانية فئران. تم التقاط صور عامة بتكبير 10x لتحديد منطقة الفتحة الكهروضوئية (PVO) عند تقاطع LA-PV ، والخلايا الكهروضوئية خ.......

Discussion

باستخدام هذا البروتوكول ، نشارك طريقة لتمييز وعزل PVs لقلب الفأر وإجراء تلطيخ مناعي عليها. بعد حصاد الأعضاء ، تم تجفيف القلب والرئتين في محلول سكروز معقم ، يليه فصل البطينين عن الأذين وفصوص الرئة تحت التوجيه المجهري. بعد ذلك ، تم إعداد قاعدة القلب لتصور الخلايا الكهروضوئية متبوعة بقطعها من .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides	Epredia	10149870
AF568-secondary antibody	Invitrogen	A11036	Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody	Abcam	ab11370	Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit
Anti-cTNT antibody	Invitrogen	MA5-12960	Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Brush	Lukas	5486	size 6
Cover slips	Epredia		24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera	Leica
DM6 B fluorescence microscope	Leica
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS Forceps	F.S.T.	91150-20	2 pieces needed
Fine Scissors	F.S.T.	14090-09
Fluorescence mounting medium	DAKO	S3023
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cell nuclei counterstaining
ImageJ	FIJI		analysis and processing software
LAS X	Leica		Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35	Feather	207500000
Microwave
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde 16%	Pierce	28908	methanol-free
Pasteur pipettes	VWR	612-1681
Petri dish	TPP	93100	100 mm diameter
Rocker 3D digital	IKA Schüttler	00040010000
Slide staining jars	EasyDip	M900-12
Specimen Molds	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system	StainTray	631-1923	Staining system for 20 slides
Sterican Needle	Braun	4657705	G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker	Super PAP Pen	N71310-N
Syringes	Braun	4606108V	10 mL
Tris base	Roche	TRIS-RO	component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287